徐萍萍1 刘志辉2 周浩1 魏守超1 赵兴军1
【摘 要】 目的 通过观察白藜芦醇对大鼠MCAO模型缺血-再灌注损害脑组织转化因子-β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响，探讨白藜芦醇药物剂量、用药时间与脑缺血再灌注损伤程度的相关性，白藜芦醇神经保护的可能作用机制。方法 将64只Wistar大鼠分为三组：白藜芦醇治疗组（A组，48只）、假手术组（B组，8只）和生理盐水对照组（C组，8只）。用改良线栓法制做大鼠MCAO缺血-再灌注模型，A组分别在缺血再灌注后0h、2h、4h、6h，分别腹腔注射白藜芦醇10mg/kg、15mg/kg、 20mg/kg，C组给予等量生理盐水,观察大鼠行为、并记录神经功能评分。B组麻醉和手术过程与模型组相同，但不插入线栓。造模成功后24h灌注取脑，切片，石腊包埋、制片，通过HE染色、免疫组化染色法，检测大鼠脑组织中TGF-β1和VEGF表达情况。结果 与C组比较，A组大鼠行为学明显改善,神经功能缺损减轻（p＜0.05)，且与白藜芦醇剂量呈正相关（r=0.95，P=0.007)。B组无神经功能缺损表现，评分为0,明显低于A组和C组中0h各组评分（均P=0.000）。A组大鼠脑海马区TGF-β1及VEGF阳性细胞表达数显著多于B组和C组（均p＜0.05)，且与白藜芦醇干预时间早晚呈正相关（r=0.95，P=0.003)，即治疗时间越早TGF-β1及VEGF阳性表达细胞数越多，而白藜芦醇剂量和干预时间对大鼠脑海马区TGF-β1及VEGF阳性表达细胞数并无明显交互影响。B组大鼠脑海马区TGF-β1及VEGF阳性细胞表达数较C组少，两者无统计学意义（均p＞0.05）。结论 白藜芦醇可减轻缺血再灌注损伤大鼠脑组织神经功能缺损，其可能是通过上调缺血区脑组织TGF-β1及VEGF表达，抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。
【关键词】 白藜芦醇； 缺血再灌注； 大鼠； 脑组织转化因子-β1； 血管内皮生长因子
【Abstract】 Objective The effects of resveratrol on the expression of MCAO, TGF- 1 and vascular endothelial growth factor (VEGF) were observed to investigate the relationship between the dose of resveratrol and the degree of cerebral ischemia reperfusion injury.Methods 64 Wistar rats were divided into two groups:Resveratrol treatment group(A group, 48)、Sham operation group（B group,8）and Normal saline control group(C组，8)。MCAO ischemia reperfusion model in rats with modified suture method，A groups 0mg/kg 10mg/kg, 15mg/kg, 20mg/kg were injected intraperitoneally with 0h,2h, 4h, 6h after ischemia and reperfusion.The control group（C组） was treated with the same amount of saline. The behavior of rats was observed and the nerve function score was recorded. After 24h perfusion, brain, slices, paraffin embedded, production, HE staining, immunohistochemical staining, the expression of VEGF and TGF- beta 1 were detected in brain tissue of rats.Results Compared with the Cgroup, the rats in the A group were significantly improved in the treatment group, the neurological function impairment (P < 0.05), and the dose of resveratrol was positively correlated with the dose of resveratrol (r=0.95,P=0.007),B group have no neurologic impairment，Score 0，Significantly lower than that of the 0h group (P=0.000).The expression of TGF- beta 1 and VEGF positive cells in the hippocampus of the rats in the A group were significantly higher than those in the C group (P < 0.05),And both were higher than B group, and the intervention time was positively correlated with the intervention time of resveratrol (r=0.95,P=0.003),The TGF- beta 1 and VEGF positive expression cells were increased in the treatment time, while the number of TGF- beta 1 and VEGF positive cells in the hippocampus of rats were not significantly affected by resveratrol dose and intervention time.The expression of TGF- beta 1 and VEGF positive cells in B group were less than those in C group，there was no statistical significance between the two group (P > 0.05).Conclusion Resveratrol can reduce the neurological deficit in rats with cerebral ischemia reperfusion injury, which may inhibit the apoptosis of neurons and play a protective role by regulating the expression of VEGF and TGF- beta 1 in ischemic brain tissue.
【Key words】 Resveratrol; Ischemic-reperfusion; rats; Transformation of brain tissue factor - beta1; Vascular endothelial growth factor.
白藜芦醇(Resveratrol，RES)化学名称为3，5，4-三羟基苯二烯，是一类广泛存在于虎黎芦、葡萄等植物中的非黄酮类多酚类化合物，近年来， RES作为一种天然的抗氧化物，在缺血性心脑血管疾病中所发挥的保护作用及其作用机制日益受到关注，但其具体分子水平机制尚不明确。组织转化因子-β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）和血管内皮生长因子（Vascular
Endothelial Growth Factor ，VEGF）对脑缺血再灌注损伤发挥重要保护作用[1]，能不同程度的改善和恢复缺血损伤脑组织的血液供应，可能是挽救半影区脑组织功能，治疗脑缺血再灌注损伤的关键所在[2]。
本研究通过观察RES对MCAO模型缺血-再灌注损害大鼠TGF-β1和VEGF表达的影响，探讨RES药物剂量、用药时间与脑缺血再灌注损伤程度的相关性以及从分子水平探讨RES神经保护的可能作用机制，为治疗缺血性脑血管病的治疗提供理论依据。
材料与方法
1．材料
健康雄性Wistar大鼠64只,体重为270±10g，购自潍坊医学院动物饲养中心。RES粉剂由陕西省西安奥赛斯生物技术工程有限公司生产（纯度为98％以上，批号：20040801)，VEGF 及TGF-β1 免疫组化试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。
2．方法
2.1 分组将64只健康雄性Wistar大鼠按照随机数字法分为A、B、C三组。采用析因分析法将A组大鼠根据缺血再灌注后给予的RES剂量分为三个亚组，即A1组=10 mg/kg A2组=15mg/kg A3组=20mg/kg；根据RES给药时间分为四个亚组，即b1=0h ，b2=2h，b3=4h，b4=6h，每组4只。分别在缺血再灌注后0h、2h、4h、6h一次性腹腔注射RES10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg，RES干预后观察、记录大鼠行走、平衡等肢体活动情况,并记录神经功能评分。C组即RES 0mg/kg组，用等量生理盐水代替。
2.2 动物模型制备采用改良的改良线栓法制成大鼠MCAO模型，造模前、后观察、记录大鼠行走、平衡等肢体活动情况，并记录其神经功能评分，采用Longa 5分评分标准评价其行为学，评分为1～3分者为造模型成功，纳入实验,造模成功后2h再取出线栓，制造MCAO再灌注模型。假手术组（B组）动物麻醉和手术过程与模型组相同，但不插鱼线。术后保持环境温度在25～30℃左右。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。术后至处死前若有小鼠死亡，则补以同批次相似体质量的大鼠。经过行为学评价纳入实验的大鼠于缺血-再灌注后24h采用Chen等制定的神经功能缺损评分标准（Neurological Seerity Scores，NSS）进行评分。最高分为18分，最低分为0分。损伤的程度按照分值的高低分为3组：0分为正常，1～6分为轻度缺损，7～12分为中度缺损，13～18分为重度缺损。RES干预后观察、记录大鼠行走、平衡等肢体活动情况,并记录神经功能评分。
2.3 灌注取脑
造模成功后24h应用0.9%NaCl溶液和4%多聚甲醛进行心脏灌流固定,断头取脑，切片，按照顺序依次为：脑前极与视交叉连线中点；视交叉处；漏斗柄，漏斗柄与脑尾极之间，每片厚约2mm。
2.4 石腊包埋、制片
脑片经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋蜡块后连续截取约5um厚切片,每个脑片取3张切片。
2.5 HE染色和免疫组化染色
取缺血中心部位的切片行HE染色和免疫组化染色，HE染色于400倍光学显微镜下比较各组大鼠缺血再灌注后脑组织病理学变化；免疫组化染色，光镜下分别统计脑组织20个不同视野的阳性细胞数,取其均数。
3．统计学处理
所有实验数据以均数±标准差（ ）表示，实验数据用SPSS18.0软件包进行处理，进行析因实验结果的方差分析。检验水准取α＝0.05，当P<0.05时认为差异有统计学意义。计数资料相关性分析采用秩和检验，α=0.05，当P<0.05时认为差异有统计学意义。
结 果
1．神经功能缺损评分
结果显示，B组无神经功能缺损表现，评分为0,明显低于A组及C组中0h各组评分（P=0.000）。A组大鼠NSS评分明显低于C组，见表1:
讨 论
缺血性脑血管疾病因其发病急、难以预测、致残致死率高，已成为危害人类健康的第一重大疾病。急性脑缺血再灌注损伤是一个多环节、多因素、多途径损伤的复杂病理生理过程，可导致脑组织不可逆损害和神经功能及行为障碍。脑缺血再灌注损伤涉及多个病理生理环节，如脑细胞能量状态、氧化应激、自由基代谢、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎症反应和细胞凋亡等[3]，常导致严重的神经功能障碍。
目前的研究认为，RES具有清除自由基、抗氧化、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗炎、雌激素样作用，能增加血流量,有效对抗中枢神经缺血损伤，保护缺血区神经元，减小梗死体积，减少迟发性神经细胞死亡，改善脑缺血引发的肢体运动功能障碍等多种生物功能[4]。RES的神经保护作用的研究已经成为神经科学领域的一个热点。
TGF-β1属于新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族中含量最多的成员，具有多种重要的生物学功能[5]。已有研究表明，在缺血再灌注损伤中，TGF-β1具有抗氧化、拮抗兴奋性氨基酸神经毒性、阻止细胞凋亡、调节小胶质细胞和星形胶质细胞反应、延长神经元死亡、等多种生物活性作用[6][7]。它可通过抑制缺血早期中枢神经系统的炎症反应[8]，从而减轻脑水肿、减小梗死面积、促进微血管增生、稳定细胞内钙离子浓度，挽救缺血半暗带，对脑缺血再灌注脑组织损伤发挥重要保护作用[9].
VEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能肝素结合生长因子，是内皮细胞特异性的促有丝分裂源，能促进内皮细胞分裂、增殖增生和转移[10]，它在血管生成的各个阶段（促进血管生长和侧支循环建立和开放）均发挥着重要作用[11]，在缺血、缺氧诱导下在脑内有大量的表达，是目前已知最强的促血管生成关键因子[12]。脑缺血后，血管新生是脑微循环修复重建的重要病理生理过程[13]。VEGF作为缺氧诱导的血管生长相关因子，可以特异地作用于血管内皮细胞，能不同程度的改善和恢复缺血损伤脑组织的血液供应，可能是挽救半影区脑组织功能治疗缺血再灌注损伤的关键所在 [14]。
本研究结果表明，RES可增加脑缺血再灌注损伤后脑组织TGF-β1和VEGF表达，改善脑缺血再灌注大鼠神经功能评分，提示RES对缺血再灌注损伤脑组织具有保护作用。RES可能是通过上调缺血区脑组织TGF-β1及VEGF表达，抑制神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。高剂量RES治疗组效果更佳，RES用药时间越早治疗效果越好。
参考文献
[1]Spurgeon KR, Donohoe DL, Bas ile DP. Transforming growth factor-beta in acute renal failure: receptor expression, effects on proliferation,cellularity, and vas cularization after recovery from injury. Am J Physiol Renal Physiol 2005;288(3):F568-577
[2]俞丽华,王键,陈业农,等. 3种中药复方对脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞间黏附分子-1和血管内皮生子因子表达的影响[J]. 中国老年学杂志, 2014;(6):1544-1546.
[3]郭倩,余音,潘乾广,等. 白藜芦醇保护脑缺血-再灌注损伤与自噬关系的研究[J]. 中国药理学通报, 2013;(7): 995-998.
[4]王建平，刘聪，杨直堂等.白藜芦醇对脑缺血小鼠 BDNF 及 NT-3 表达的影响.中国药理学通报, 2012;28(4):531 ～535.
[5]Vivien D,AliC.Transforming growth factor-β1signa Iling in brain disorders.Cytokine& Growth Factor Reviews,2006;17(1):121.
[6]杨舒雅，董文鹏，章翔等.白藜芦醇与缺血再灌注损伤的研究进展。中华神经外科疾病研究杂志,2012；11（6）:562-564.
[7]李珍,王斌生,孔德虎等.白藜芦醇预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用.中国药理学通报,2010;26(6):802～806.
[8]Zhu Y,Roth-EichhomS,BraunN,etal.The expression of transforming growth factor-β,(TGF-β1)in hippocampal neurons a temporary up regulated protein level after transient forebrain ischemia in the rat.Brain Res,2000;866:286.
[9]李岩，王东玉.白藜芦醇抗脑缺血再灌注损伤的研究进展.广东医学,2010;31(17):2332-2333.
[10]Kajdaniuk D, Marek B. Foltyn W, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)part I: in physiology and pathophysiology. Endokrynol Pol, 2011, 62(5): 444-455.
[11]Gtacca M,Zacchigna S.VEGF gene herapy:therapeutic angiogenesis in the Clinic and beyond.Genc Ther,2012;19(6):622-629.
[12]Ferrari G,PintucciG,SeghezziG,etal.VEGF,aprosurvivalfactor,acts in concert with TGF-beta1 to induce endothelial cell apoptosis.ProcNatlAcad Sci,2006;103(46):17260-17265.
[13]宋学萍，孙盛同.不同注射VEGF途径对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧支循环形成的影响.中华神经医学杂志,2013;12(7):661-664.
[14]易建，魏娟.丁苯酞治疗急性脑梗死患者疗效及血管内皮生长因子血清水平变化.微循环学杂志,2014;24(3):35-37.
论文作者:徐萍萍1,刘志辉2,周浩1,魏守超1,赵兴军1
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期
论文发表时间:2016/7/14
标签：大鼠论文; 损伤论文; 内皮论文; 组织论文; 脑缺血论文; 血管论文; 作用论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年2月第4期论文;