秦琴[1]2003年在《人源性抗乙型肝炎表面抗原（抗HBs）噬菌体单链抗体库的构建》文中研究表明目的 构建人源性噬菌体单链抗体库，以筛选人源性抗乙型肝炎病毒表面抗原(抗HBs)的基因工程抗体。 方法 (1)抽取注射过乙肝疫苗并产生抗HBs抗体的正常人外周血，分离淋巴细胞，提取细胞总RNA (2)以Oligo(dT)_(15)为引物将mRNA反转录为cDNA (3)根据抗体分子的第一框架区和第四框架区的保守性，设计简并引物 (4)PCR扩增重链和轻链的可变区序列(V_H和V_L) (5)设计一对互为模板的引物，PCR扩增连接肽Linker基因 (6)由Linker片段通过重迭延伸PCR连接扩增的V_H和V_L基因，形成单链抗体(ScFv)基因 (7)将ScFv基因克隆入具有相同酶切位点的噬菌粒载体pCANTAB5E中，然后转化大肠杆菌E.Coli TG1，辅助噬菌体M13K07的拯救，收集噬菌体上清，即为噬菌体抗体库 结果 (1) 我们设计的扩增抗体重链和轻链可变区的简并引物，成功地扩增出了V_H和V_L基因片段 (2)根据我们设计的Linker基因引物，成功地扩增出大约100bp的Linker基因(包括与V_H和V_L互补序列) 山西医科大学2003而颀十毕业论文 门）重迭延伸 PCR将 V。和 V。基因连接成约 750hp的单链抗体基 因 N）构建了 pCANTABSE沼CFV载体，转化 E．Colt TGI后，在含有 氨令青霉素的平板上长出阳性菌落，并经过PCR快速鉴定插入 片段大小的正确 （5）制备了人源性噬菌体抗体库，抗体片段以融合蛋白的形式表达 于噬菌体的表面，利于筛选 结 论 本课题通过建立人源性的噬菌体单链抗体库，以期从中筛选到 抗HBs的单链抗体，由于是人源性的，避免了鼠源性单克隆抗体 所产生的人抗鼠抗体反应，且由于是小分子的单链抗体，可以与干 扰素基因相偶联，是十分有希望的抗乙型肝炎病毒基因治疗方案， 而且为满足阻断乙肝病毒（HBV）感染的母婴垂直传播，具备生产 大量人源特异性强的抗体制品的要求。总之，抗HBS单链抗体在 临床上有着广泛的应用前景。
周世水[2]2003年在《重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究》文中认为目前乙型肝炎病毒感染是全球性公共卫生问题,现有3.5亿患者受其困扰。随着抗HBsAg单克隆抗体和抗体片段的研究开发,发现能够和乙肝病毒表面特异性位点结合并封闭其侵袭肝细胞的活性,而融合了对病毒有较好临床治疗效果的干扰素γ的双功能抗体将能够起到导向性预防和治疗的双重作用。本文在前期工作的基础上,将抗HBsAg单链抗体(single-chain Fv against HBsAg,HBscFv)基因与干扰素γ(IFNγ)基因在体外拼接成单一基因,然后转入巴氏毕赤酵母中分泌表达,并对表达产物进行了纯化及体外生物学活性和理化性质鉴定。 体外基因及其表达载体的构建。首先是设计合适的引物并分别从含干扰素γ基因的载体和含抗HBsAg单链抗体的质粒中PCR扩增出干扰素γ基因和HBscFv基因。接着成功采用重迭PCR技术,通过基因SOEing方法将两基因拼接成单一基因HBscFv-IFNγ,并进行序列测定,其结果表明,所获得的基因产物为正确的HBscFv-IFNγ基因。将此HBscFv-IFNγ基因插入真核高效表达的载体pPICZaA中,获得含目的基因的表达载体pPICZaA/HBscFv-IFNγ,并成功转入E coli. TOP10。对此载体进行体外多拷贝的构建,最后成功地构建出pPICZaA/(HBscFv-INFγ)_2、pPICZaA/(HBscFv-INFγ)_4、pPICZaA/(HBscFv-INFγ)_6的表达载体,并分别成功转入E coli. TOP10。因此,通过液体培养可大量提取各类多拷贝含目的基因的表达载体,为进行酵母转化奠定了良好的基础。 在P. pastoris中分泌表达融合蛋白HBscFv-IFNγ。将测序确认正确的酵母表达质粒pPICZaA/HBscFv-IFNγ用酶PmeI线性化,同多拷贝表达载体pPICZaA/(HBScFv-IFNγ)n=2、4、6一起,分别采用LiCl法或电穿孔转化法转化P. pastoris GS115或X33,获得大量转化子。对转化菌落基因组进行PCR鉴定,发现70%转化子中含有目的基因HBscFv-IFNγ的整合。高浓度Zeocin抗性筛选试验,发现4%左右的转化子能够在含2000mg/L Zeocin的抗性平板上生长,并且电转化法的转化子中高抗性菌株比例稍微高于LiCl法转化子。将转化子经甲醇诱导培养后,发现培养上清中含有HBScFv-IFNγ样蛋白。对此蛋白用鼠抗HBscFv单克隆抗体作为第一抗体的Western-blotting分析表明,酵母培养上清中含有分子量为42kD的HBScFv-IFNγ融合蛋白。间接ELISA结果表明,酵母培养上清中的HBscFvI-IFN具有结合HBsAg活性。定量分析结果表明,酵母培
参考文献：
[1]. 人源性抗乙型肝炎表面抗原（抗HBs）噬菌体单链抗体库的构建[D]. 秦琴. 山西医科大学. 2003
[2]. 重组人源抗HBsAg单链抗体—干扰素γ在巴氏毕赤酵母中表达的研究[D]. 周世水. 华南理工大学. 2003