王宇玫[1]2001年在《动脉血管平滑肌细胞钙化的影响因素及其mRNA差异表达的初步研究》文中指出研究背景:动脉钙化在人类中广泛存在，其发生随着年龄的增加而明显 增加；一些疾病可以导致和加重动脉钙化的发生与发展，如冠心病、高血 压、糖尿病、尿毒症和老年人骨质疏松等，而钙化的动脉反过来增加这些 疾病致残和致死率。近年来的研究发现动脉钙化的形成过程与骨骼的矿化 过程相似，是一个主动的调节的过程，一些能够影响骨骼矿化过程的因素 同样对动脉钙化的过程产生影响。90％的动脉粥样硬化病变存在着不同程 度的钙化，而在此过程中的一些细胞生长因子如转化生长因子-β (Transforming Growth Factor-β，TGF-β)和胰岛素样生长因子 (Insulin-like Growth Factor，IGF)对骨骼细胞的矿化有明显的促进作 用，它们对动脉钙化过程的影响研究甚少或者基本上无研究。新近的研究 发现了在动脉钙化形成的过程中有许多基因表达的变化，目前对此方面的 研究多参照骨骼的矿化模式，发现的变化基因多为骨骼相关的细胞分化基 因或骨骼特征性的细胞外间质蛋白，而从整体上研究尚未见报道。 研究目的:从细胞和分子两个水平进行研究:(1)一些影响钙磷代谢的 维生素如维生素D和影响骨骼形成的细胞因子TGF-β和IGF-1对动脉钙化过 程的影响，(2)动脉血管平滑肌细胞在钙化过程中基因表达的变化。 研究方法:本实验用体外培养牛主动脉平滑肌细胞为钙化模型基础， （加入终浓度为10mmol／Lβ-甘油磷酸酯诱导细胞钙化）分别在正常对照 培养的牛主动脉血管平滑肌细胞(BASMC)和钙化培养的BASMC中加入 10~(-9)mol/L的维生素D_3、TGF-β、IGF-1，测定细胞的钙盐沉积、细胞内碱 性磷酸酶和细胞分泌的骨钙素的动态变化情况；并分别将这叁种刺激因子 的浓度增加至10~(-8)和10~(-7)mol/L，10天后测定细胞的钙盐沉积情况。提取对 照细胞和钙化细胞的RNA，用mRNA差异显示的方法分析在细胞钙化过 程中细胞的mRNA表达差异变化，分别经过reverse Northern Blot和 Northern Blot的方法鉴定阳性差异条带，进行测序，利用生物信息学的方 法分析差异片段中所含有的信息。 实验结果:在培养的BASMC中加入终浓度为10mmol/Lβ-甘油磷酸 酯，10天细胞培养层出现广泛的点状沉积，逐渐融合成片状，von Kossa 染色证实此为钙盐沉积，细胞层的钙合量较对照增加了23倍，生化分析和 病理鉴定证实了钙化模型的建立成功. 分别在正常对照培养的BMMC和钙化培养的BMMC中加入ic ’mol／L的维生素D3，钙化培养的BASMC的钙盐沉积轻度增加，第 10天的 钙盐沉积量较未加入维生素D3的钙化细胞增加了16.25％（P＞0.05），在这 个过程中细胞内碱性磷酸酶活性大幅度增加，以第8天达最高峰，较钙化 对照组增加了Zo176％，第侧天略下降，但是仍比普通钙化细胞增加了 53.90％（P＜0.05h 细胞分泌骨钙素较对照组增加 T58.3％；而作为对照 培养的BASMC则无上述改变；增加维生素D3的作用浓度，培养液中维生 素h的贩达lpe和ltwOVL，10天后细胞的钙盐沉积分别较钙化对照组 下降了双＊2％和35.89％（下＜o.05）。 用 lfr乍／L的 TGF 0分别作用于对照和钙化培养的 BASMC，两组细胞 在TGF－0加入前后的钙盐沉积量无明显的变化，在钙化培养细胞中增加 兀F－p的浓度至lpe和1o’n／L，·细胞的钙盐沉积仍无变化；钙化培养细胞 在加入TGF0后细胞的碱性磷酸酶的活性呈时间依赖增高；培养上清中细 胞分泌的骨钙素的浓度无明显变化.提示碱性磷酸酶虽然在钙化的形成过程 中有重抓用，但弧有碱性磷酸酶的升高不一定导致钙化，TGF 6虽然 增加细胞内碱性磷酸酶活性，但是并禾增加细胞的钙化。 用 lfrgmol／L的IGFl分别作用于对照和钙化培养的BASMC，结果显示 mF－1能够呈时间依赖性增加B ASASMC的钙盐沉积，对普通对照的B ASAS MCMC 无此作用，细胞在钙化的过程中钙盐沉积的增加幅度在第8天达最高 （33.3％），第10天虽继续增加，但是幅度有所下降，第10天的钙盐沉积 较钙化对照组增加了13.N％（P＞o.05），在此过程中细胞的碱性磷酸酶活 力大幅度升高，第8天细胞的碱性磷酸酶活性为钙化对照组的133％，第10 天骤然下降，低于对照组；细胞分泌的骨钙素的浓度在第10天较钙化对照 细胞增加 T 79.2凡 增加培养环境中 IGFl的浓度至豆肿和IO7mmol／L，细 胞的钙沉积进一步增加，较钙化对照分别增加了22.7％和40.7％（P叼.05）. 上述叁种因子对细胞的钙化作用都仅局限于钙化培养的BASMC，而对 作为对照的普通细胞无此作用，反映了它们作用的细胞依赖性，有赖于产 生钙化的细胞；?
常晓丹[2]2017年在《T3对钙磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及其分子机制》文中认为目的本文拟通过钙化模型在细胞水平研究叁碘甲腺原氨酸(3,5,3'-Triiodothyronine,T3)在血管钙化及血管平滑肌细胞(VSMCs)向成骨样细胞表型转化时相关蛋白及转录因子的变化和作用,并进一步明确T3调节血管钙化及VSMCs向成骨样细胞表型转化的主要信导转导通路,从而论证T3是抑制血管钙化的重要内源性保护物质,为临床调节和逆转血管钙化所致的动脉高压相关疾病提供有效的实验基础。方法体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞A7r5,将细胞随机分为正常对照组、钙化模型组(加入β-甘油磷酸盐和氯化钙培养基)、T3干预组(在钙磷培养基中加入T3,根据浓度再分为10-7、10-8、10-9mol/L叁个亚组)和抑制剂干预组,对细胞采用茜素红染色检测钙化结节,细胞骨钙素含量测定,ALP活性检测,RT-PCR检测 Runx2 和 Osterix 的 mRNA 含量,Western blot 检测骨化指标 OPN、SM22 α-actin 和 SM1-actin 及信号通路调节蛋白 ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt 的表达水平,加入信号通路抑制剂后再次检测Runx2和Osterix的mRNA含量以及OPN、SM22α-actin 和 SMα-actin 的蛋白含量。结果与正常对照组相比,钙化组A7r5细胞的骨钙素含量、ALP活性、Osterix和Runx2 mRNA水平、OPN蛋白水平均显着升高(P<0.01),SMα和SM22α蛋白水平显著下降(P<0.01);加入T3干预后细胞骨钙素含量、ALP活性明显降低,Osterix和Runx2 mRNA、OPN蛋白表达明显下调,而加入MMI后可阻断以上T3的抑制效果;与钙化组相比,抑制剂组Osterix和Runx2 mRNA、OPN蛋白表达显着升高(P<0.01)。钙化组可检测到信号通路调节蛋白ERK1/2、P-ERK、Akt、P-Akt的表达增加,加入整合素αvβ3/ERK阻断剂(PD98059)、PI3K/Akt拮抗剂(LY294002)后,再用T3进行干预,抑制钙化的效果依然存在,但与单纯加抑制剂组相比无统计学差异,两组间比较提示LY294002的抑制效果较PD98059明显(P<0.01)。结论1、钙磷培养液诱导A7r5细胞12天可成功构建钙化细胞模型。2、T3可降低A7r5钙化细胞的钙沉积及碱性磷酸酶活性,此效应呈浓度依赖性,说明T3是调节血管钙化的内源性保护物质。3、T3上调平滑肌细胞标志分子SM22 α和SMα,使骨相关蛋白OPN的表达增加,同时检测到骨分化的重要转录因子Runx2和Osterix的mRNA水平下降,而加入T3拮抗剂MMI后,上述T3抑制钙化的效果被部分拮抗,说明T3通过抑制血管平滑肌细胞表型转化这一关键环节来调节血管钙化。4、钙磷诱导A7r5细胞钙化过程中可检测到信号通路调节蛋白ERK1/2、Akt的活化,加入相应的抑制剂后表型转化特异性转录因子Osterix和Runx2 mRNA的表达均有所下调,随着抑制剂浓度的升高骨分化蛋白OPN的蛋白水平逐渐下降,收缩表型标志物SMα和SM22α的蛋白水平逐渐恢复,利用筛选出的抑制剂浓度加入钙化液后再用T3进行干预,结果表明LY294002的抑制效果较PD98059明显,提示钙磷诱导的A7r5细胞钙化可能与PI3K/Akt信号通路的激活有更明显的关系。
何昊[3]2010年在《OPG在腹主动脉瘤中的表达及OPG与主动脉平滑肌细胞凋亡关系研究》文中指出目的：检测OPG(骨保护素)在不同直径大小人腹主动脉瘤(AAA)组织中的表达情况,探讨其在腹主动脉瘤发生发展过程中的作用。方法：(1)应用免疫组织化学方法检测20例AAA组织(包括6例小腹主动脉瘤(SAAA):横径4.0-5.5cm,6例中腹主动脉瘤(MAAA):横径5.5-7.0cm,4例大腹主动脉瘤(LAAA):横径≥7.0cm,4例破裂型腹主动脉瘤(RAAA)和对照组6例正常腹主动脉组织OPG的表达。(2)Western-blooting和RT-PCR技术检测不同直径大小瘤体中OPG,MMP-9蛋白及mRNA表达情况。结果：(1)与正常腹主动脉对照,AAA组织中OPG的阳性细胞明显增多,主要分布于中膜,并与炎性细胞浸润程度呈显着正相关,AAA组中OPG的表达明显高于对照组,差异具有显着性(P<0.05)。(2)OPG的蛋白及mRNA表达在AAA组明显高于正常腹主动脉,差异具有显着性(P<0.05),且与MMP-9表达及瘤体直径呈显着正相关。结论：OPG水平与AAA有关,OPG可能通过促进基质金属蛋白酶的表达和炎症细胞浸润,在基质和细胞水平参与腹主动脉结构损伤与重构,促进AAA形成和发展。目的观察兔体内主动脉壁剪切力变化情况下动脉成瘤的形态学变化及OPG的表达情况及其与中膜血管平滑肌细胞(VSMCs)密度降低的关系。方法取新西兰兔共24只,在肾动脉平面以下2cm将供体的一段腹主动脉壁作补片移植到受体腹主动脉而成瘤,分别在术后7,21,35天获取瘤体及腹主动脉组织标本,分别测量术前及成瘤后腹主动脉的形态学参数,免疫组织化学法检测OPG抗原的表达,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测OPG、MMP-9的mRNA表达,Western blot检测OPG、MMP-9的蛋白产物表达,原位末端DNA标记技术(TUNEL)测定中膜VSMCs凋亡的变化；计算机图像分析并计算VSMCs密度及平均光密度。结果实验组兔存活15只,腹主动脉血流通畅,无吻合口狭窄,实验组腹主动脉直径随时间延长逐渐扩张,与对照组有显着差异(P<O.05)；HE染色显示明显增生的内外膜存在大量免疫炎性细胞浸润,中膜明显变薄,平滑肌细胞排列紊乱,密度明显降低。特殊染色可见中膜弹力蛋白明显纤细,僵硬,平滑肌层明显变薄,计算机图像进一步分析显示,瘤体内外径随时间延长逐步增加,弹力蛋白、胶原纤维含量与外径呈显着负相关(P<0.05)；免疫组织化学染色显示实验组OPG表达显着高于对照组(P<0.05),且表达水平与瘤体大小成正比。Western免疫印迹及RT-PCR结果显示OPG、MMP-9的蛋白及mRNA表达呈阳性,且随瘤体直径扩大而表达逐渐增强,而正常对照组无明显的阳性条带。TUNEL检测发现,实验组凋亡细胞明显高于对照组,其中阳性VSMCs凋亡占35%以上,与瘤体外径呈显着正相关。结论1血管补片法构建的AAA是一种稳定可靠的动物模型,适用于AAA发病机制及防治的体内研究。2动脉壁剪切力变化可以引起局部OPG, MMP-9表达增加及VSMCs凋亡增加。3 OPG表达与VSMCs凋亡具有相关性,可能对动脉瘤形成起着一定的作用。目的：利用OPG基因过表达及RNA干扰技术作用于人主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),观察VSMCs凋亡的情况。方法：①实验材料：购买OPG基因,同时体外化学合成4条OPG序列特异性小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)。②实验方法：将购买的OPG基因亚克隆至穿梭载体上,同时随机选择一条shRNA,构建shRNA真核表达载体,包装腺病毒,转染人主动脉VSMCs。③实验分组：分为空白组、OPG过表达组、OPG过表达+RNA干扰组。④实验评估：应用RT-PCR,Western blot检测OPG基因表达的变化；应用流式细胞仪检测VSMCs凋亡情况。结果：①空白细胞组中,OPG表达量比较弱；OPG过表达组中,OPG表达量大大增加；OPG过表达+OPG RNA干扰组中,由于OPG表达受到抑制,OPG表达量下降较明显。②OPG过表达组的细胞凋亡率较空白细胞组有较大上升,而同时进行RNA干扰后,细胞凋亡率有一定程度下降,显示OPG的表达和VSMCs凋亡之间存在一个正比关系。结论：RNA干扰介导的OPG基因沉寂可显着抑制VSMCs的凋亡,OPG的过表达可明显加速VSMCs的凋亡。
魏培丹[4]2013年在《核心结合因子α1 siRNA靶向抑制对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响》文中提出【目的】本课题利用小分子干扰RNA（siRNA）靶向抑制血管平滑肌细胞（VSMC）中Cbfα-1基因表达，观察Cbfα-1表达抑制对高磷诱导的VSMC成骨样转分化及钙盐沉积的影响，从而探讨Cbfα-1在高磷诱导的VSMC钙化中的作用，试图进一步阐明CKD血管钙化的可能机制，并为治疗提供可能的靶点。【方法】1.组织块贴壁法原代培养VSMC,倒置相差显微镜观察细胞形态及α-SMA免疫组化鉴定；3～8代VSMC用于实验。2.针对大鼠Cbfα-1基因设计合成4对候选siRNA序列，以阳离子脂质体为载体，转染体外培养的VSMC细胞；FAM荧光标记siRNA测定转染效率并优化转染条件。RT-PCR法分析4对候选siRNA序列对Cbfα-1基因表达的抑制作用，筛选出有效siRNA序列。3.将筛选出的有效siRNA序列转染VSMC，细胞分为4组：(1)正常磷（1.3mmol/L）组；(2)高磷（2.6mmol/L）组；(3) siRNA转染组：高磷（2.6mmol/L）+转染试剂+Cbfα-1-siRNA（有效siRNA序列）；(4)阴性转染对照组：高磷（2.6mmol/L）+转染试剂+阴性对照siRNA，转染后24h、48h通过RT-PCR技术检测成骨样转分化相关基因Cbfα-1、骨桥蛋白（OPN）mRNA表达情况；转染后48、72h采用Western Blot方法检测Cbfα-1、OPN蛋白表达情况；转染后第6天通过茜素红染色法检测细胞钙盐沉积情况。所有实验至少重复3次。【结果】1.细胞鉴定：双目倒置相差显微镜下，大鼠VSMC为梭形细胞，呈典型的“峰－谷”样生长。抗α-SMA抗体免疫组织化学染色显示，VSMC胞浆内见大量棕色颗粒。2.荧光显微镜下观察显示，在Cbfα-1-siRNA浓度为100nmol/L、Lipo为8μL/孔转染条件下，转染效率约55%；RT-PCR结果显示Cbfα-1siRNA1952序列相对基因抑制水平最强，转染24h以后沉默效率达81.77%，故作为有效siRNA序列。3. RT-PCR结果显示，转染后24h，与正常磷组相比，高磷组VSMC中Cbfα-1及OPN mRNA表达明显增加（P＜0.01），与高磷组及阴性转染对照组相比，siRNA转染组Cbfα-1mRNA表达明显降低（P＜0.01），而叁组间OPN mRNA表达无明显差异（P＞0.05）；转染后48h，siRNA转染组Cbfα-1mRNA表达仍低于高磷组及阴性转染对照组（P＜0.05），但高于正常磷组（P＜0.05），OPN mRNA表达低于高磷组及阴性转染对照组（P＜0.05），但高于正常磷组（P＜0.05）。4. Western Blot结果显示，转染后48h，与正常磷组相比，高磷组Cbfα-1及OPN蛋白表达明显增加（P＜0.01），siRNA转染组Cbfα-1蛋白表达较高磷组及阴性转染对照组明显降低（P＜0.01），叁组间OPN蛋白表达无明显差异（P＞0.05）；转染后72h，siRNA转染组Cbfα-1蛋白表达仍低于高磷组及阴性转染对照组（P＜0.05），但高于正常磷组（P＜0.05），OPN蛋白表达低于高磷组及阴性转染对照组（P＜0.05），但高于正常磷组（P＜0.05）。5.茜素红染色结果显示，正常磷组细胞无明显钙盐沉积，高磷组和阴性转染对照组细胞钙盐沉积明显，而siRNA转染组细胞钙盐沉积明显减轻。【结论】1.高磷条件可在体外成功诱导大鼠VSMC钙化。化学合成的Cbfα-1siRNA通过脂质体瞬时转染可以有效抑制VSMC Cbfα-1基因和蛋白的表达。2. Cbfα-1基因沉默可明显抑制高磷诱导的VSMC向成骨样转分化及细胞钙化；Cbfα-1可望成为CKD血管钙化治疗的靶点。
陆卫平[5]2002年在《高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究》文中研究表明慢性肾衰竭(CRF)是临床的常见病和多发病。在长期透析治疗的终末期肾病(ESRD)病人中，心血管疾病是引起死亡的首要原因，约占50％。流行病学资料证实，尿毒症患者中普遍存在高磷血症，CRF病人心血管病变发生率及死亡率的增高与高磷血症和钙磷乘积的升高密切相关。高磷血症以及随后发生的钙磷乘积升高促进血管钙化(vascular calcification,VC)。血管钙化加重动脉粥样硬化斑块病变，使心肌梗死、周围血管缺血性病变的发生率增加，冠状动脉钙化与心源性猝死相关或者是心源性猝死的先兆。 研究高磷血症致血管钙化的机制，并采取积极的治疗措施，对于降低CRF病人心血管病变的发生率和死亡率具有重要的临床意义，故设计并开展了本研究课题。 目的：观察不同浓度磷对体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙沉积及骨钙素(osteocalcin,OC)表达的影响，初步探讨高磷血症促进血管钙化的可能机制；同时观察膦甲酸钠(phosphonoformic acid，PFA)对高磷诱导该细胞钙化的干预作用，从而为防治CRF病人血管钙化提供新的理论观点。 方法：体外培养牛主动脉平滑肌细胞，观察不同磷浓度(Pi 1.5mmol／L、2.0mmol／L)、不同培养时间(3天、6天、9天)血管平滑肌细胞的钙沉积；以及不同磷浓度(Pi 1.5mmol／L、2.0mmol／L、2.5mmol／L)培养血管平滑肌细胞72小时骨钙素的表达。同时观察不同浓度膦甲酸钠对高磷(Pi 2.0mmol／L)诱导的钙沉积和骨钙素增加的抑制作用。用甲o-酚酞络合酮方法测定钙含量；放射免疫法测定培养上清液中骨钙素的浓度；BCA法测定蛋白含量，用蛋白含量标化钙含量与骨钙素浓度；RT-PCR观察骨钙素mRNA的表达。 南京医科大学硕士学位论文 结果1：林B当于正常血磷门．5。W）的培服中，平滑肌细胞 钙沉积量小；而郁目当于高磷血症门刀 rnmljL）的培养基中，钙 沉积显着增加（培养 6 H，Pi 2．0。l／L组w Pi．5。l／L组，77．187 i 11．692Pg吨蛋白 VS 25＊68＊50PgirnZ 蛋白，P＜0．of），呈时间 和剂量M性。von KOssa染色，Pi 2刀 mini／L组平滑肌细月肌大量 的黑色颗粒沉积，而刊1．5——巩组中很少。同样，与n1．5——w 纽相比，Pi 2刀 mrnol／L组培养上清液中骨钙素的水平明显增高门．503 X 10－’i 2．601X 10刁呛pg蛋白。，S 2．9815 10刁 i 8．382 X 104 n叭；蛋白，P＜0．001X Pi 2＊ mmol／L组平滑月几细胞骨钙素 mtvA 白表达也显着增力。（OC／GAPDH：1．906．132 VS 0．748＊366， p＜0．0川＊ 结果2：我们也观察了胰甲酸钠对高酿导的钙沉积和骨钙素表这 的干预作用。瞬甲嘲h能有勿收拓呻I钙沉积［培养6天，Pi 2．ePFA．0 （mmol／L）组 vs Pi 2＊ rnmo讥组，37．729。5．899u鹏蛋白 vs 77．187 土门＊92卜旮p蛋白，p＜0＊of］和骨钙素的表达Pi 2．e PFA．0 删OW组VS刊2．0。O几纽，上清液中，4．529 X m刁。1．250 X m上 n旮pg蛋白vs．503 x 10’12＊of x 10一略＊蛋白，p＜0＊of；mRNA， OC／GAPDH，0．642 i 0．092 VS．886．165，p＜0＊ 1］。 结论：高磷能脓…管平滑肌细B站5沉积和骨钙素表达的增加， 说明高磷血症可能是促狐管钙化的独立危险因素；膀甲酸钠能有 效地抑制高磷诱导的血管平滑肌细胞钙沉积和骨钙素表达的增加， 可以作为一种新的防治高贼导血管钙化的药物。
刘立新[6]2003年在《体外血管钙化与细胞增殖的关系及其氟伐他汀对钙化影响的实验研究》文中提出目的：本研究通过β-甘油磷酸盐处理牛主动脉平滑肌细胞，建立细胞水平的体外血管钙化模型，借此观察多种非胶原类骨基质蛋白钙化期间的表达、分泌情况，以及细胞增殖、细胞凋亡／死亡情况，初步探讨其可能的机制。此外，加用氟伐他汀进行干预，观察其对体外血管钙化的影响并探讨可能的作用机制。 方法：(1)第一部分：组织块法原代培养牛主动脉中膜平滑肌细胞。选用8代以内的传代细胞，添加终浓度为10mmol／L β-甘油磷酸盐培养10天诱导钙化；利用Von Kossa染色、茜素红-S染色及检测细胞层钙沉积对钙化进行鉴定，同时观察细胞层碱性磷酸酶活性和培养上清骨钙素含量。(2)第二部分：采用噻唑兰(MTT)比色试验、台盼兰排斥试验观察不同浓度β-甘油磷酸盐对牛主动脉平滑肌细胞增殖的影响，利用流式细胞分析术观察钙化期间细胞凋亡、细胞周期的情况。(3)第叁部分：体外血管钙化期间，添加终浓度为10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)mol/L氟伐他汀进行干预，检测细胞层钙沉积、碱性磷酸酶活性和培养上清骨钙素含量，观察氟伐他汀对钙化的影响；利用RT-PCR、Western blot方法检测正常培养细胞、钙化组及氟伐他汀治疗组的骨桥蛋白、骨连接素基因、蛋白水平的表达情况。 结果：(1)β-甘油磷酸盐处理10天后，光镜及电镜显示培养细胞出现广泛分布的钙盐沉积，Von Kossa、茜素红-S钙染色均呈阳性，细胞层钙沉积升至正常对照的28.44倍，较实验初增加了293倍(P＜0.01)，从而证实体外血管钙化模型建立成功。(2)β-甘油磷酸盐能够时间依赖性增加细胞层钙沉积，细胞层碱性磷酸酶活性、培养上清骨钙素含量也随时间的延长而增高，各时间点均高于正常对照(P＜0.01)；此外，RT-PCR、Western blot证实钙化组的骨桥蛋白mRNA及蛋白表达明显增高，而骨连接素mRNA及蛋旱巨域修斗腕协士学位公义 幻县白表达略有下降。o）p－甘油磷酸盐能以时间、浓度依赖性抑制牛主动脉平滑肌细胞增殖，并且钙化组的MTT光密度值、活细胞计数与正常对照相比，实验第 4天起己有明显差异（HO．01）；④ 钙化组的细胞凋亡率随时间的延长而呈增多趋势，并与细胞层钙沉积有相关性（r＝0．9，HO．05）。（5）细胞周期分析显示，钙化组G；期细胞略有增加，S期细胞减少，G。M期细胞改变不明显，细胞增殖指数k 下降。（6）氟伐他汀能够剂量依赖性减少细胞层钙沉积，以 10－‘mo l／［。浓度组最为明显，使细胞层钙沉积减少了 27％（HO．05入 门） 应用氟伐他汀后，细胞层碱性磷酸酶活性改变不明显，但培养上清骨钙素含量显着下降（HO．05）；RT－PCR、Western blot分别从基因、蛋白水平证实骨桥蛋白表达下降、骨连接素表达增加。 结论：＊）卜甘油磷酸盐能在短时间内诱导出牛主动脉平滑肌广泛钙化，是一种良好的体外血管钙化模型。（2）体外血管钙化期间，多种非胶原类骨基质蛋白的表达、分泌发生改变，提示血管钙化类似骨矿化，是一个主动、可调控的过程。（3）体外血管钙化期间，平滑肌细胞增殖明显受抑制，死亡细胞增多，并有少量细胞凋亡，凋亡率与钙化程度相关，提示凋亡可能参与了钙化过程。山 体外血管钙化能够影响细胞周期，使G1期细胞增多，预示成熟、有合成能力的细胞相对增多八5）首次证实氟伐他汀能够减轻体外血管钙化程度，提示氟伐他汀可用于体内血管钙化的治疗。（6）氟伐他汀能够影响非胶原类骨基质蛋白如骨连接素，骨桥蛋白、骨钙素的表达或分泌，可能通过转变细胞表型、影响细胞功能而干预钙化。（7）首次证实卜甘油磷酸盐能够下调骨连接素的表达，提示其诱导钙化的能力可能与之有关。
金波, 尹恒冲, 汪凌清, 包丽雯, 李延林[7]2013年在《平滑肌细胞成骨分化致血管钙化中MAPK信号通路基因的表达谱变化》文中研究说明背景:血管钙化是一种细胞介导的主动的、可调控的复杂生物学过程,血管平滑肌细胞转分化为成骨样细胞发挥着重要作用,其确切机制尚不清楚。目的:探讨尿毒症背景下动脉粥样硬化血管钙化的病理生理机制。方法:采用5/6肾切除法建立尿毒症背景下ApoE-/-小鼠动脉血管钙化模型,苏木精-伊红染色和VonKossa染色观察主动脉组织形态学特点,明确造模成功。应用小鼠全基因组Agilent芯片筛查MAPK信号通路的差异表达基因,实时定量PCR分析验证部分与MAPK信号通路相关的差异表达基因,并结合通路分析来探索MAPK信号通路与血管钙化的内在联系。结果与结论:造模12周后,尿毒症ApoE-/-小鼠主动脉组织形态学特点证实动脉粥样硬化钙化斑块形成。Agilent基因芯片检测结果显示,MAPK信号通路中存在14个差异表达基因,RT-PCR验证结果与芯片检测结果相符合。经KEGG通路分析,ERK1/2信号通路可能在血管钙化的病理生理过程中扮演着重要的角色。说明5/6肾切除ApoE-/-小鼠主动脉钙化斑块形成与MAPK信号通路激活密切相关,该信号通路可能在平滑肌细胞转分化过程中起着至关重要作用。
汪沁沁[8]2016年在《miR-133a/Runx-2信号轴在糖尿病血管内膜钙化中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景:糖尿病及其并发症已成为威胁人类生命健康的重要杀手,发病特点较为隐匿,但是危害巨大,其中大血管并发症包括血管钙化、动脉粥样硬化等已成为患者致死或致残的最主要原因,因其最终会导致心肌梗死、心衰、脑血管意外等严重后果。钙化,作为糖尿病患者血管病变的重要特征之一,与以上心脑血管事件的发生风险密切相关,是公认的独立危险因素之一。而针对钙化的治疗手段仍较有限,即使在规范的全面的现有药物治疗以及介入器械治疗双管齐下的前提下,仍有很大部分的心血管事件无法避免。现在一般认为血管钙化是类似于骨发育的主动且高度可调控的一个生物学过程,而糖尿病患者的血管内膜钙化的形成主要与高糖状态及其糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)的水平升高、炎症细胞、氧化应激等以及血管平滑肌细胞向内膜增殖迁移并产生表型转化等因素相关。目前已有大量研究证实,AGEs-RAGE(receptor for AGEs)轴参与了糖尿病血管钙化的发生发展,但其中的具体分子机制不详。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一类形成血管内皮细胞的前体细胞,其可以通过渗入斑块内,出现成骨样分化后参与粥样硬化内膜的钙化,表明EPCs很可能就是成骨样前体细胞,EPCs在成骨信号刺激下可高表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx-2)等钙化相关蛋白,促进血管钙化进程的进展,且EPCs还具有促进骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的能力。研究显示microRNA-133a在骨骼肌和心肌的生长发育、功能改变中发挥了重要作用,而Runx-2则是其作用靶点蛋白之一,高糖环境下miR-133a水平下降,Runx-2水平升高,miR-133a/Runx-2信号轴与成骨转化密切相关。研究目的:通过病例对照研究明确糖尿病与非糖尿病患者冠脉钙化程度的差别,并比较两者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中miR-133a的表达水平。动物实验部分通过建立糖尿病高脂喂养小鼠模型,明确主动脉弓粥样斑块内成骨分化标志性蛋白Runx-2、BMP-2表达情况。在细胞实验中,用AGEs刺激干预EPCs,进一步证实糖尿病环境下积聚的晚期糖基化终产物对于EPCs的迁移、增殖、凋亡等功能的影响以及相关成骨基因的表达变化,明确其能诱导EPCs成骨表型转化;继而进一步检测AGEs刺激后,EPCs中Runx2相关microRNAs的变化,定位于mi R-133a/Runx2信号轴,利用RAGE特异性抗体阻断AGEs-RAGE轴,观察阻断后AGEs刺激下EPCs中miR-133a相对表达量的变化,并构建miR-133a过表达质粒,转染后检测Runx2表达水平并进行组间比较,进一步研究AGEs-RAGE轴通过miR-133a/Runx2途径促进EPCs成骨化的机制。本研究旨在初步阐明“糖尿病环境下,血管内膜损伤局部积聚的AGEs可通过rage激活mir-133a/runx2信号轴,诱导epcs成骨分化,参与糖尿病血管内膜钙化的形成和发展”。研究方法:1)选取2014年2月至2015年3月期间在我科住院并行冠脉cta检查的糖尿病患者30例,同期住院并行冠脉cta检查的非糖尿病患者30例,收集基线临床数据及血脂、血糖、血压等检测指标进行对比,比较两组间冠脉钙化积分(coronaryarterycalcificationscore,cacs)及pbmcs中mir-133a的表达水平。2)通过链脲霉素(stz)腹腔注射建立糖尿病小鼠模型,并予高脂饲料喂养,12周时用免疫组化技术检测主动脉弓粥样斑块处runx-2、bmp-2蛋白表达情况。3)从pbmcs中分离、培养得到epcs,通过观察细胞形态、流式细胞仪检测表面标记进行鉴定。进一步使用增殖试剂盒、annexin-v凋亡检测试剂盒、transwell小室迁移实验分别观察对照组、不同浓度梯度羧甲基赖氨酸(carboxy-methyl-lysine,cml)-bsa干预组中epcs增殖、迁移、凋亡的功能,并检测成骨相关钙化基因alp、骨钙素(osteocalcin,oc)、runx2、骨形态发生蛋白2(bonemorphogeneticprotein,bmp2)的表达量,明确其对epcs成骨化的影响。4)分离、培养、鉴定epcs后,用80μg/mlcml-bsa干预,采用qpcr方法检测epcs中runx2相关micrornas的相对表达量,包括mir-133a、mir-204、mir-433、mir-335和mir-211。加入rage特异性抗体后,检测epcs中cml刺激后mir-133a的表达,并与各对照组比较。构建mir-133a过表达质粒并转染,采用qpcr方法检测epcs中cml刺激后runx2mrna的表达,用westernblot方法检测其蛋白水平。研究结果:1)糖尿病组和非糖尿病组患者在年龄、性别、体重指数(bmi)、血压、等方面均无统计学差异,在使用药物方面,33.3%的糖尿病人在服用他汀类药物,与非糖尿病组13.3%相比,p<0.05,有统计学差异,其他药物的使用如阿司匹林、acei/arb、钙离子拮抗剂等均无统计学差异。两组在总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血肌酐水平指标上比较无统计学意义(p>0.05),在空腹血糖(6.47±2.88mmol/lvs5.18±1.52mmol/l)、甘油叁酯水平(1.98±1.09mmol/lvs1.60±0.48mmol/l)比较中,糖尿病组明显高于非糖尿病组,具有统计学意义(p<0.05)。两组受试者中钙化积分最低为0分,最高为3120分,其中糖尿病组钙化积分为388±556,非糖尿病组为96±130,糖尿病组钙化积分明显高于非糖尿病组,且危险分层为高度以上心血管事件风险的患者比例明显较高。糖尿病组外周血单个核细胞中mir-133a相对表达量(0.42±0.09)较非糖尿病组(1.02±0.17)明显降低,两组比较具有显着统计学差异(p<0.01)。2)与对照组相比,糖尿病组小鼠随机血糖持续升高(p<0.05),12周时体重较造模前下降(22.4±1.87gvs24.8±1.46g,p<0.05),主动脉弓部血管内免疫组化染色显示runx-2及bmp-2蛋白表达水平明显高于对照组。3)与bsa对照组相比,cml-bsa刺激后显着抑制了epcs增殖、迁移的能力,并增加细胞凋亡,促进其成骨分化(P<0.05),而其中以80μg/mL的浓度影响最明显(P<0.05);与BSA对照组相比,CML-BSA刺激后显着增加了EPCs成骨相关基因ALP、Runx2、BMP2和OC的表达量,并且呈现浓度依赖性递增,以80μg/mL的浓度变化最明显(P<0.05),分别为11.97±0.25,10.04±0.47,10.04±0.47,9.28±0.32。而100μg/mL的浓度反而呈现下降趋势(P<0.05),分别为6.01±0.12,3.11±0.01,2.60±0.20,3.15±0.13。4)给予80μg/m L CML后,EPCs中Runx2相关microRNAs的相对表达量与BSA对照组相比,miR-133a、miR-204和miR-211明显下降(P<0.05),分别为0.35±0.07,0.67±0.15,0.58±0.02。miR-433、miR-335的表达量组间无明显差异。而阻断RAGE后,再给予80μg/m L CML刺激,RAGE+CML组与Scramble+CML组相比,EPCs中miR-133a相对表达量明显升高(P<0.05),分别为0.82±0.17,0.42±0.03。过表达miR-133a后,给予80μg/m L CML刺激,与scramble+CML组相比,miR-133a mimic+CML组Runx2蛋白表达量明显下降(P<0.05),差异具有统计学意义。研究结论:1)糖尿病组冠脉钙化程度较非糖尿病组严重,且糖尿病组外周血单个核细胞中miR-133a相对表达量较非糖尿病组明显下降,miR-133a可能与糖尿病血管钙化相关。2)糖尿病小鼠高脂喂养模型中,主动脉弓部粥样硬化斑块内Runx-2、BMP-2蛋白表达水平明显升高,提示存在钙磷代谢紊乱及成骨分化。3)在CML-BSA的刺激干预下,EPCs的增殖、迁移功能受损,凋亡增加,且BMP2、Runx2、OC、ALP等成骨化相关蛋白表达水平升高。晚期糖基化终产物的积聚影响了EPCs的功能且促进其成骨分化,可能是糖尿病血管内膜钙化形成和发展的重要机制之一。4)CML-BSA干预后,EPCs中miR-133a表达量明显下降,而阻断RAGE后,CML对miR-133a的影响被抑制,过表达miR-133a则导致Runx2蛋白表达水平下降,且较Runx2 mRNA的下降更为明显,结果支持miR-133a通过转录后水平的调控抑制其靶基因Runx2的蛋白表达,发挥反向调节作用。进一步阐明了糖尿病环境下局部积聚的AGEs可通过RAGE激活miR-133a/Runx2信号轴,诱导EPCs成骨分化,参与糖尿病血管内膜钙化的形成和发展。
方晴[9]2016年在《海带多糖对慢性肾功能衰竭及并发性血管钙化的干预作用》文中研究说明海带多糖是存在于海带细胞中的一类天然生物大分子物质,表现出多种生物活性。本文主要开展了海带多糖(LJP61A)对腺嘌呤诱发的小鼠慢性肾功能衰竭及并发性血管钙化的干预效果研究,并通过离体钙化模型对体内实验进行验证并探索LJP61A对血管平滑肌细胞钙化形成的干预机制,现取得的研究结果如下：(1)海带多糖LJP61A对小鼠慢性肾功能衰竭的干预作用研究：采用腺嘌呤诱导的小鼠慢性肾功能衰竭实验模型,通过检测小鼠体重、肾脏病理损伤及血清和尿液各项生化指标,探究LJP61A对肾功能衰竭是否存在干预作用。组织病理学研究显示,LJP61A对肾脏代偿性纤维化增生和肾小管损伤有一定的保护作用,呈量效关系。血清和尿液生化检测结果显示LJP61A可显着降低慢性肾功能衰竭小鼠血清BUN、 Crea水平,改善Ca2+、Mg2+、P3+等电解质及蛋白质代谢紊乱状态,稳定肾功能,表明LJP61A能显着延缓腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭病情的发展进程。(2)海带多糖LJP61A对慢性肾功能衰竭小鼠并发性血管钙化的干预作用研究：通过复制慢性肾功能衰竭钙磷代谢紊乱引起的血管钙化的同时给予LJP61A干预,病理检测结果显示LJP61A能明显降低主动脉钙和磷含量、ALP活性水平以及血清中PTH和FGF-23的含量；形态学研究和免疫组织化学分析结果显示,海带多糖能够降低血管钙化形成过程中的主动脉钙磷盐沉积现象,并上调平滑肌细胞上钙敏感受体的表达；qRT-PCR和Western blotting结果显示,LJP61A能显着上调主动脉组织中血管平滑肌细胞标志因子a-SMA、SM22a的基因表达以及降低Pit-1的基因表达,促进钙化抑制因子MGP和OPG的蛋白表达,并且显着降低骨分化相关蛋白Cbfa-1、OC、RANKL、BMP-2的表达。结果表明海带多糖LJP61A对腺嘌呤诱发的慢性肾功能衰竭并发性血管钙化的发生有较强的干预作用。(3)海带多糖LJP61A对β-GP诱导的小鼠血管平滑肌细胞钙化的干预作用初探：采用β-GP诱导MOVAS细胞钙化模型,当LJP61A在浓度为25 μg/mL时,明显减少细胞内的钙化结节及ALP的分泌。qRT-PCR结果显示,LJP61A能够上调β-GP诱导的MOVAS细胞中MGP、OPN、a-SMA、SM22a的转录表达水平以及降低Pit-1的基因表达。Western blotting结果显示,LJP61A能够抑制内源性钙化促进因子Cbfa-1、OC、BMP-2和RANKL蛋白表达,并且显着上调钙化抑制因子OPG和MGP蛋白表达。综上结果表明,LJP61A通过细胞内钙化促进及抑制因子平衡的调节从而抑制血管重塑过程中平滑肌细胞转分化为类成骨细胞的过程。
陈秀鹃[10]2017年在《长链非编码RNA-ANCR通过NF-κB信号通路抑制小鼠血管平滑肌细胞成骨样分化》文中提出目的:动脉钙化常见于糖尿病、终末期肾脏病和心脏病等疾病。新近的研究显示动脉钙化是动脉中层的钙化,是一种类似于骨形成的主动调节过程,其具体的发生机制尚不明确。血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)是研究动脉钙化的细胞学基础。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)指的是长度超过200个核苷酸的非编码RNA,它不具有转录和翻译的功能,但它可以和特定的DNA或者RNA结合,影响其转录和翻译。抗分化非编码RNA(Anti-differentiation non-coding RNA,ANCR)是lncRNA的一种,ANCR可以抑制表皮细胞的分化,而动脉钙化是VSMCs的成骨样分化,目前尚无动脉钙化和ANCR的研究,本实验的研究目的是探讨ANCR对小鼠VSMCs成骨样分化的影响及其可能机制。方法:利用10mMβ-甘油磷酸钠(beta-glycerophosphate,β-GP)诱导小鼠VSMCs建立动脉钙化细胞模型;构建ANCR过表达慢病毒载体并感染小鼠VSMCs;qPCR检测Runt相关转录因子2(Runt related transcr iption factor 2,Runx2)、骨形成蛋白-2(bone morphology protein-2,BMP-2)和ANCR的表达,Western blotting检测胞浆蛋白Runx2、BMP-2及核内核转录因子-Kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65的表达;茜素红染色观察矿化结节的形成。结果:1、β-GP刺激后小鼠VSMCs中Runx2和BMP-2的表达显着升高,差异有统计学意义(P<0.05),茜素红染色可见明显的矿化结节形成。2、β-GP刺激后小鼠VSMCs中ANCR的表达显着降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3、ANCR过表达慢病毒感染后与对照组相比,Runx2和BMP-2的mRNA水平和蛋白水平均显着下降,NF-κB p65的蛋白表达显着降低,钙化结节形成显着减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ANCR可能通过削弱NF-κB信号通路抑制β-GP诱导的小鼠VSMCs成骨样分化。
参考文献：
[1]. 动脉血管平滑肌细胞钙化的影响因素及其mRNA差异表达的初步研究[D]. 王宇玫. 军医进修学院. 2001
[2]. T3对钙磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及其分子机制[D]. 常晓丹. 南方医科大学. 2017
[3]. OPG在腹主动脉瘤中的表达及OPG与主动脉平滑肌细胞凋亡关系研究[D]. 何昊. 中南大学. 2010
[4]. 核心结合因子α1 siRNA靶向抑制对高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化的影响[D]. 魏培丹. 福建医科大学. 2013
[5]. 高磷诱导及膦甲酸钠干预血管平滑肌细胞钙化的研究[D]. 陆卫平. 南京医科大学. 2002
[6]. 体外血管钙化与细胞增殖的关系及其氟伐他汀对钙化影响的实验研究[D]. 刘立新. 中国人民解放军军医进修学院. 2003
[7]. 平滑肌细胞成骨分化致血管钙化中MAPK信号通路基因的表达谱变化[J]. 金波, 尹恒冲, 汪凌清, 包丽雯, 李延林. 中国组织工程研究. 2013
[8]. miR-133a/Runx-2信号轴在糖尿病血管内膜钙化中的作用及机制研究[D]. 汪沁沁. 第二军医大学. 2016
[9]. 海带多糖对慢性肾功能衰竭及并发性血管钙化的干预作用[D]. 方晴. 合肥工业大学. 2016
[10]. 长链非编码RNA-ANCR通过NF-κB信号通路抑制小鼠血管平滑肌细胞成骨样分化[D]. 陈秀鹃. 济宁医学院. 2017