摘要：目的：应用慢病毒介导的RNA干扰技术，有效沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表达，建立一种简便有效基因沉默的系统，并初步研究慢病毒感染T细胞的可能性。方法：以Vβ13 mRNA编码序列作为干扰靶点，以慢病毒质粒UTG作为载体，构建靶向Vβ13的shRNA表达质粒，构建携带Vβ13的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点，并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western Blot确定最佳沉默Vβ13序列后，将有效的UTG- Vβ13质粒与辅助质粒共转染293FT细胞，低温超高速离心，获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染大鼠T细胞，光镜观察T细胞被慢病毒感染的情况，流式细胞术检测T细胞的绿色荧光表达情况。结果：成功构建Vβ13-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA- Vβ13，RT-PCR及Western Blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞Vβ13 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染T细胞。结论：红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能；UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率。可作为一种良好的基因导人载体，实现慢病毒介导的RNA干扰在T细胞内的有效表达，并为T细胞过继性转移的相关研究提供技术支持。
关键词:1型糖尿病，慢病毒，绿色荧光蛋白，红色荧光质粒，Vβ13
An EGFP-Lentivirus and red target Vβ13 gene system and its infection in rat T cells
LIUZhi-Jun*1CHENYong2LIWen-Tong3WANGJin-Dong1LIJiao4JIANGZi-Tong5LIFeng-Jie6
1.Microbiology Department, Weifang Medical University Shandong Weifang 261053
2.Biochemistry Department, Weifang Medical University Shandong Weifang 261053
3.Department of Pathology, Weifang Medical University Shandong Weifang 261053
4. Biological Science and Technology, Biopharmaceutical class 2015th
Weifang Medical University Shandong Weifang 261053
5. Clinical Medicine,2014th，Weifang Medical University Shandong Weifang 261053
6. Central Laboratory，Weifang Medical University Shandong Weifang 261053
Abstract: [Objective] RNA interferience technology mediated by Lentivirus was applied to effectively silence the mCherry combined Vβ13 target gene expression and a possibility in Lentivirus transduction NSCs was explored preliminarily [Methods] The Vβ13gene mRNA sequences were set as interfered targets and a Lentivirus cassette named UTG was used as vector in producing Lentivirus to construct shRNA expressive plasmid. A mCherry plasmid carrying the whole backbone of Vβ13 gene was set as the target to shRNAs. Both the UTG and mCherry- Vβ13 plasmids were co-transfected into 293FT cells. The optimized Vβ13 sequence was determined by knocking out of mCherry color and confirmed by RT-PCR and Western Blot, the UTG-shVβ13 plasmid was co-transfected with the helper plasmids into 293FT cells for Lentivirus after a super high speed centrifuge in 4 ℃. Subsequently, the Lentivirus was added into T cells to observe the situation of transduction. FACS was applied to observe and detect the EGFP protein expression. [Results] A set of Lentiviral shRNA vectors targeting Vβ13 was constructed successfully and one optimized shRNA sequence was selected by RT-PCR and Western Blot. The results showed Vβ13 mRNA and protein were decreased significantly. In addition, Lentivirus with shRNA can infect rat T cells. [Conclusion] The mCherry target- EGFP Lentivirus characterizes as simple and convenient tool in screening an optional shRNA; UTG Lentivirus shows a high efficiency in infecting T cells as a vector to study knocking down gene expression in T cells.
Keywords: Type 1 diabetes,, Lentivirus, green fluorescent protein, mCherry plasmid, Vβ13 gene
RNA干扰和慢病毒技术是通过用shRNA沉默转染质粒和细胞相关基因的表达，在目前已经成为检测基因功能的最常用和最有效的方法[1,2]。1型糖尿病是T淋巴细胞介导的以胰岛β细胞损伤为特征的自身免疫性疾病[3,4]。该疾病是由遗传因素、环境因素和病毒感染等因素的复杂相互作用共同参与引发的，迄今为止，其发生机理尚未清楚。最新的亚类鼠系易感分析表明，Iddm14基因座在<2.57 兆碱基范围内。Iddm14基因座在自发性糖尿病中发挥重要作用。我们的前期工作表明，Iddm 14是BB大鼠中最主要的易感基因座；而TCR-Vβ13基因极有可能是导致的1型糖尿病的重要易感基因[5]。本文应用红色荧光嵌合的Vβ13基因，使用绿色荧光标记的慢病毒感染HEK 293FT（以下简称293FT）细胞，观察最佳的作用靶点，为进一步进行慢病毒干扰大鼠T细胞试验奠定基础。
1 材料和方法
主要试剂
1.1.1细胞、质粒与菌株: 大肠杆菌菌株DH5α 及293FT 细胞由本实验室保存；DMEM 培养液、胎牛血清、辅助培养基F12，B27，EGF和bFGF均购自Gibco 公司; Lipofectamine 2000 和TRIzol 试剂盒购自Invitrogen 公司; 反转录RNA 试剂盒和PCR 试剂盒购自立陶宛Fermentas公司;含有Vβ13 基因的质粒pVbeta13由美国Drexel大学的Blankenhorn教授惠赠[6]。红色荧光质粒pmR-mCherry购自美国Clonetech公司；慢病毒载体及辅助载体由德国维尔茨堡大学Holger Reichardt教授惠赠[7]，本实验室扩增保存。Polybrene购自Sigma公司; 质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司; T4 DNA 连接酶、限制性内切酶EcoRⅠ和BamH Ⅰ购自宝生物工程大连有限公司。辅助培养基B27，EGF和bFGF均购自Gibco公司。小鼠抗Vβ13抗体购自 ViroStat公司，小鼠抗β-actin 抗体购自 Santa Cruz公司，山羊抗小鼠IgG抗体购自武汉博士德公司。
1.1.2 UTG-ShRNA选择：分别针对3个靶点设计干扰Vβ13的siRNA序列。https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai根据GenScript siRNA Target Finder在线设计软件，按照分值高低排次选择3个21nt的Vβ13核苷酸序列作为备选的沉默靶点。
AAGATCCAGTCTGCAAAGCAG516nt-536nt shVβ-1
AATGCAACTGTCAAGACCTTG82nt-102nt sh Vβ-2
CACCTATCTCTGTGCCAGCAG 546nt-566nt sh Vβ-3
方法
1.2.1含Vβ13-mCherry红色荧光质粒的构建及鉴定：以质粒pVβ13 为模板[6]，分别用上游引物: 5′-gggaattc caccaagaggcactgtgct 3′（EcoRⅠ）和下游引物:5′- atggcctgtgtcaaaagacggatccgg-3′（BamH Ⅰ），通过PCR 法获得大小为1358 bp 的Vβ13基因片段，PCR 反应条件是:94 °C 1 min，55 °C 1 min，72 °C 2 min，30个循环。将获得的扩增片段定向插入质粒pmR-mCherry的EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位点之间，构建成Vβ13基因表达质粒Vβ13-mCherry。
1.2.2含sh-Vβ13基因重组慢病毒质粒UTG的构建及鉴定：设计一对寡核苷酸的siRNA序列，含有Bbs/XhoⅠ的酶切末端，将寡核苷酸退火，并克隆至pH1tet-flex质粒中，测序；使用下列引物扩增H1tet-shRNA 骨架，H1tetflex 上游引物：cgtgtaTTAATTAAccatggaattcgaacgctgac H1tetflex 下游引物：cgatcTTAATTAAcaggctagcctaggacgcg 应用PacI内切酶，酶切PCR产物，纯化。应用PacI内切酶，酶切FH1t-UTG质粒，连接H1tet-shRNA至UTG载体，由FUW1引物（GACATAATAGCAACAGAC）测序。
1.2.3 细胞培养：
1.2.3.1 HEK293FT细胞的培养：细胞株以含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素和非必须氨基酸的DMEM 高糖培养液，37 °C，5% CO2孵箱培养细胞。
1.2.3.2大鼠T细胞的培养：抽取20只LEW.1WR1大鼠的心脏血各2 mL, 肝素抗凝后, 加Hank’s 液稀释, 用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心(于22℃以800 g 离心20 min)。吸取上、中层界面的白色云雾状层, 即大鼠PBMC。充分洗涤后, 计数, 用含100 mL /L小牛血清的RPM I1640完全培养液重悬PBMC, 并调整细胞的密度为2 ×109 /L, 培养基中添加浓度为5％重组大鼠IL-2(500 U/ml)和抗CD3/CD28 单克隆抗体进行共培养刺激培养时间为5-6 周。大鼠T细胞培养后，经过计数后接种到新的培养瓶中。
1.2.4 质粒转染细胞
1.2.4.1 mCherry红色荧光质粒与慢病毒质粒载体UTG- Vβ13 共转染293FT细胞：转染分组：构建并测序正确的UTG-shRNA1-3质粒，与含有完全序列Vβ13的mCherry质粒，分别共转染293FT细胞，并设立未转染及单转染mCherry- Vβ13质粒的对照组。转染前，培养 5×105 293FT细胞于DMEM无双抗的完全培养基中，待细胞密度达到90%时，进行转染；使用Lipofectamin 2000与相关质粒转染细胞，具体操作如下：稀释质粒总质量为2μg（UTG-shRNA 5μL，mCherry 3μL）加入250 μL Opti-MEM无血清培养基；稀释Lipofectamin 2000到250μL Opti-MEM无血清培养基。孵育5min后将两者混匀，孵育20min，加入培养皿中。6h后，加入浓度为1 μg/ mL的Dox培养基。48h后观察各组红色荧光的减低情况。
1.2.4.2 UTG慢病毒的包装及病毒滴度测定：按Lipofectamine 2000使用说明，将慢病毒载体与辅助载体（5 μg的pMDL质粒，2.5 μg 的pRSV-rev质粒和3 μg的pVSV-g质粒 ）共感染 293FT细胞，感染8h后更换为完全培养基，培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，离心后收集得到高滴度的慢病毒浓缩液，收集含病毒的上清液，3000 r/min 离心10 min，去除细胞碎片，经0.45 μm的滤膜过滤。
1.2.5 检测Vβ13 mRNA和蛋白的表达情况
1.2.5.1 RT-PCR检测Vβ13 mRNA基因的表达：分别抽提双转染mCherry-Vβ13红色荧光质粒和UTG质粒的293FT细胞的总RNA，分为三组：单转染mCherry-Vβ13组、双转染质粒但未加Dox诱导组、双转染质粒加Dox诱导组转染，转染后48h，依据Trizol抽提总RNA操作步骤进行[8]。分别取各克隆细胞2 μg总RNA进行反转录反应，依据AMV逆转录试剂盒操作步骤进行。在转染所得的克隆细胞cDNA中，以Vβ13基因的上下游引物进行PCR扩增，条件为：94°C变性5 min；94°C 1 min，50°C 1 min，72°C 1 min，30个循环。72°C延伸10 min。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测Vβ13基因1358 bp的目的产物。同时设立β-actin为半定量对照。
1.2.5.2 Western Blot 检测Vβ13蛋白的表达：分别分离双转染mCherry-Vβ13红色荧光质粒和UTG质粒的293FT细胞的总蛋白，以各组Vβ13的总蛋白量进行10 %聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF 膜上。用5 %脱脂乳缓冲液在室温封闭此PVDF 膜2 h ，然后将PVDF 膜分别与小鼠抗Vβ13(1 :200 ，ViroStat) 和小鼠抗β-actin (1 :2 000 ，Santa Cruz) 抗体在4 °C孵育过夜，PBS 洗膜，与HRP 标记山羊抗小鼠IgG(武汉博士德) 在室温反应1 h ，以DAB 显色。分离总蛋白及杂交方法均参照文献进行。
1.2.6 慢病毒感染大鼠T细胞：实验前1天接种1×105个大鼠T细胞于24 孔培养板中，DMEM／F12培养基400 μL，待细胞融合约50％-60％时进行病毒感染。加准备培养基和 Polybrene混合物，Polybrene 终浓度为：5 ?g/mL。-70°C保存的病毒在冰上融化后，无菌操作，每孔分别加入100 μL 的干细胞培养液稀释好的病毒，混匀后置37°C延培养。由于慢病毒对细胞没有明显毒性作用，4-6 h后可加入300 μL 完全培养基继续培养。病毒感染3~4天后倒置荧光显微镜或其它方法观察感染率。
1.2.7 大鼠T细胞表达EGFP的流式细胞仪检测：取慢病毒介导感染的表达EGFP的大鼠T细胞，pH 7.2的PBS液多次洗涤，胰酶-EDTA消化液进行消化成单个细胞，PBS液洗涤，离心收集细胞，70%乙醇固定后，用筛网过滤，200μL PBS液重悬T细胞，进行流式细胞术检测分析。
2 结果
2.1 Vβ13-mCherry红色荧光质粒的构建及鉴定
Vβ13-mCherry红色荧光质粒经EcoRⅠ和 BamHⅠ酶切鉴定，得到Vβ13片段的长度为1358 bp(图1)。测序结果与GenBank比对完全一致（图1）。
图1：Vβ13-mCherry质粒的酶切鉴定 1：DL2000 DNA蛋白标准物 2：Vβ13 PCR产物 3：EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切mCherry-Vβ13质粒 4：mCherry空载体电泳
Fig. 1 Identification of Vβ13 cloned into mCherry plasmid 1: DL2000 DNA marker 2: Vβ13 PCR product 3: Restriction enzymes EcoRⅠand BamHⅠ digest mCherry-Vβ13 plasmid 4: mCherry plasmid backbone
2.2 含sh-Vβ13基因重组慢病毒质粒UTG的构建及鉴定
UTG-shRNA1-3绿色荧光质粒经PacⅠ分别酶切鉴定，得到酶切片段长度为1743 bp，证明已成功将shRNA序列连接入UTG质粒，未酶切成功的则为阴性空白质粒（图2）。
Fig. 2 Identification of cloned UTG-shRNA by restriction digestion
M：250 bp DNA Ladder Marker；Lane 1-3：Restriction enzyme PacⅠ digests UTG-shIE1-3 plasmid to confirm the right construction of UTG-shRNA1-3
图2 酶切鉴定UTG-shRNA质粒 M：250 bp DNA Ladder Marker；泳道1-3：PacⅠ酶切UTG-shRNA已确认正确构建UTG-shRNA1-3
2.3 针对Vβ13靶基因的绿色荧光蛋白质粒对红色荧光mCherry-Vβ13表达的阻断：
红色和绿色荧光蛋白质粒共转染293FT细胞后48 h，未加Dox诱导，通过倒置显微镜观察，可发现较多细胞带有红色和绿色荧光，说明Lipofectamin 2000有较高的转染效率，红绿色荧光表达见A-E。由于shRNA1的有效沉默，F中红色荧光表达微弱。
图3 红绿荧光蛋白质粒转染293FT细胞筛选有效shRNA片段
A:UTG空白绿色荧光蛋白质粒转染293FT细胞；B：UTG-shIE1绿色荧光蛋白质粒转染293FT细胞，无Dox诱导；
C：UTG-shIE1绿色荧光蛋白质粒转染293FT细胞，1 μg/ mL Dox诱导；D-F:mCherry-Vβ13红色荧光质粒表达，可见F中红色荧光淬灭； G-I：红绿荧光图片合并，可见未有效沉默红色荧光的G，H中显示黄色；而有效沉默的I中显示绿色。
Fig. 3： UTG EGFP plasmid and mCherry-Vβ13 plasmid co-transfect 293FT cells to screen effective shRNA target
Panel A: Blank UTG EGFP plasmid transfects 293FT cells;Panel B: UTG-shVβ13 EGFP plasmid transfetcts 293FT cells without Dox induction Panel C: UTG-shVβ13 EGFP plasmid transfetcts 293FT cells with 1 Dox induction
Panel D-F: mCherry-Vβ13 expression and an effective silence of Vβ13 was observed in panel F. Panel G-I: merged images show yellow fluorescence after mCherry and green images expressed both and an EGFP alone was shown in panel I.
3 重组慢病毒的包装及对VΒ13的沉默：
2.4 转染后的Vβ13mRNA和蛋白在感染慢病毒293FT细胞中的表达：
由于其他2组shRNA不显示明显红色荧光淬灭，我们选取了效果最明显的Vβ13-mCherry-shRNA1进行检测。RT-PCR的结果显示，Vβ13-shRNA1与正常对照组与未加Dox组相比，Vβ13-shRNA1转染组Vβ13表达水平分别下降了91.4% ，p＜0.01。Western Blot检测结果显示，与正常对照组相比，Dox组Vβ13蛋白表达明显减弱，见图4、图5。
Fig. 4 RT-PCR confirmed an effective silence in Vβ13 mRNA by UTG-shRNA1 in 293FT cells *p＜0.01
图4 RT-PCR检测双质粒转染293FT细胞后Vβ13 mRNA的表达 p＜0.01
图5：293FT细胞中检测Vβ13蛋白表达被UTG-shRNA1抑制情况
No UTG:：293FT细胞无UTG-shRNA1转染；No Dox：双转染后但未加Dox诱导shRNA表达；Dox1、Dox2：重复检测在Dox=1μg/ mL 时，Vβ13的蛋白表达。β-actin作为内参照。
Fig. 5 Suppression of Vβ13 protein in UTG-shRNA1 induced by Dox on 293FT cells
No UTG:293FT cells were cultured without UTG-shRNA1 transfection; No Dox: UTG-shRNA1 and mCherry-Vβ13 plasmids were co-transfected into 293FT cells for protein blot; Dox 1 and Dox 2: a multiple wells of 293FT cells with 1 μg/ mL Dox was applied and no Vβ13 protein was detected by blot. β-actin was set as inner control.
2.5 UTG-shRNA1慢病毒感染T细胞
用UTG-shRNA1慢病毒感染神经干细胞48h后，流式细胞仪检测该病毒载体对T细胞的感染效率为91.56％(图3)。
图6. 流式细胞术检测慢病毒感染大鼠T细胞48h后的绿色荧光蛋白表达情况
Fig. 6 Flow Cytometry was applied to detect the EGFP expression post Lentivirus transduction for 48 h
onto rat T cells
讨论
RNA干扰是通过双链RNA引发转录后沉默，抑制特定基因的表达；而慢病毒被认为是进行RNA干扰的最佳载体，因其能感染低分裂细胞，特别是神经元等，因而能将基因整合至神经干细胞中长期表达，转染效率高[9,10]。但是，RNAi片段的筛选，一直缺乏有效的工具。大多数研究是通过应用选取靶基因的4-10个候选核苷酸19-22nt，通过siRNA验证，或者应用Western Blot对转染shRNA后的细胞株逐一进行检验，筛选最有效的干扰片段进行深入研究[11,12]。本研究采用的UTG-mCherry红绿色荧光系统构建并筛选了靶向Vβ13干扰慢病毒载体，研究表明，针对易感基因Vβ13 516nt-536nt序列作为靶序列进行RNA干扰能使Vβ13的表达下降95%以上。因此，干扰516nt-536nt序列可以作为沉默Vβ13的有效序列。
Tet-On 系统是近些年发展的一种在真核细胞中诱导外源基因表达的调控系统，具有可调节、表达水平高的特点，已广泛用于体内/体外实验研究[13-15]在UTG-mCherry红绿鉴定系统中，UTG慢病毒质粒具有Tet-on调控的增强型绿色荧光蛋白控制开关，可以在后期的研究中，无论细胞水平还是动物水平，都具有高效、无毒、开关严密，并且满足可逆性，可控性等优点。对于减低基因沉默的毒性，可以通过增减Dox来达到此目的。
本实验应用携带绿色荧光的慢病毒质粒，与携带红色荧光mCherry的靶基因质粒载体同时共转染293FT细胞。在Dox存在情况下，当慢病毒质粒中shRNA能有效干扰与沉默Vβ13靶位点时，相应的红色荧光会减弱或者淬灭，叠加后的荧光颜色为绿色；当慢病毒质粒中的shRNA不能有效沉默Vβ13靶位点时，以及Dox没有加入情况下，红色荧光与绿色荧光并存，叠加后的荧光颜色为红+绿=黄色。后继的RT-PCR和Wesern Blot实验也证实了相应的Vβ13 mRNA和蛋白的增减变化。基本原理如图所示:
Fig. 7 Dox induced Tet-UTG lentivirus and mCherry system in screening effective shRNA
图 7. Dox诱导的Tet-UTG 慢病毒基因沉默与红色荧光体系筛选有效shRNA
总之，本研究应用RNA干扰技术，通过靶基因连接红色荧光-慢病毒绿色荧光系统，有效筛选出高效敲除的RNA沉默片段，并且此方法为可诱导，可逆的基因沉默系统，方法简便可靠，并在mRNA和蛋白水平得到印证，这为我们下一步应用慢病毒转导T细胞，拟通过过继性转移技术，观察基因敲除Vβ13的对1型糖尿病的发生发展提供了有效的实验工具。
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论文作者:刘志军*1 陈永2李文通3 王金冬1,李娇4,姜子童5
论文发表刊物:《中国实用内科杂志》2016年7月第7期
论文发表时间:2016/12/12
标签：质粒论文; 转染论文; 细胞论文; 荧光论文; 基因论文; 病毒论文; 蛋白论文; 《中国实用内科杂志》2016年7月第7期论文;