杨臻[1]2016年在《浙贝黄芩汤对急性髓系白血病化疗敏感性的影响》文中指出目的1.观察比较浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对急性髓系白血病HL60、HL60/ADR细胞增殖及化疗药物敏感性的影响。2.探讨野生型p53诱导的磷酸酶1(Wipl)在难治性急性髓系白血病患者外周血中性粒细胞及单个核细胞中的表达情况。3.观察浙贝黄芩汤醇提取物对急性髓系白血病HL60、HL60/ADR细胞凋亡的影响及其与Wipl表达的相关性。4.探讨浙贝黄芩汤醇提取物增加急性髓系白血病HL60、HL60/ADR细胞对阿霉素敏感性与Wipl表达的相关性。方法1.采用MTS法检测比较浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对急性髓系白血病敏感细胞HL60、耐药细胞HL60/ADR的增殖抑制作用,计算各提取物的IC5。值。测定非毒剂量(<IC,0)浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物联合阿霉素作用后HL60、HL60/ADR细胞阿霉素IC50的变化。2.中性粒细胞分离液分离5例难治性急性髓系白血病患者(难治组)、3例化疗敏感的急性髓系白血病患者(缓解组)、3例健康成年人(正常对照组)外周血中性粒细胞及单个核细胞,分别提取总RNA,应用Real-time PCR法检测Wip1mRNA的表达情况。3.浙贝黄芩汤醇提取物作用于HL60、HL60/ADR细胞,Real-time PCR法检测Wip1mRNA的表达变化；经Annexin/PI双染后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。4.Real-time PCR法检测HL60、HL60/AD R细胞Wip1mRNA表达的差异。非毒剂量(<IC,0)浙贝黄芩汤醇提取物联合阿霉素作用HL60、HL60/ADR细胞,Real-time PCR法检测Wip1mRNA表达的变化。利用Lipofectamine 3000转染试剂将Wipl高表达质粒(hWIP1-FLAG-pCMV-Neo-Bam)及对照质粒(pCMV-Neo-Bam)转染入HL60细胞,上调HL60细胞Wip1表达。MTS法检测Wipl高表达HL60细胞及转染对照质粒HL60细胞对阿霉素的敏感性。结果1.浙贝黄芩汤提取物对HL60细胞的IC50值由低到高依次为醇提取物(141.06±11.29ug/ml)、水提取物(177.28±4. OOug/ml)、酸水提取物(217.66±16.78 ug/m1),P<0.05。浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物对HL60/ADR细胞的IC50值均大于200ug/ml,浙贝黄芩汤酸水提取物对HL60/ADR细胞的IC50值大于400ug/ml,各提取物对HL60/ADR细胞的工C50值均高于HL60细胞。200ug/m1浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对HL60/ADR细胞增殖的抑制率分别为(27.28±4.69)%、(37.67±3.43)%、(25.39±4.98)%,其中醇提取物抑制率高于水提取物及酸水提取物,P<0.05；水提取物及酸提取物抑制率比较差异无统计学意义,P>0.05。非毒剂量(<IC10)浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物联合阿霉素作用于HL60细胞,阿霉素的IC50值降低,P<0.05,增敏倍数分别为1.60、2.00倍。非毒剂量(<IC10)浙贝黄芩汤醇提取物联合阿霉素作用于HL60/ADR细胞,阿霉素的IG50值降低,P<0.05,逆转倍数为1.50倍。2. Real-time PCR检测结果显示难治组外周血中性粒细胞中Wip1mRNA目对内参基因β-actin的表达量为0.0969±0.0684,缓解组外周血中性粒细胞中Wip1mRNA相对内参基因β-actin的表达量为0.0083±0.0078,正常对照组外周血中性粒细胞中Wip1mRNA相对内参基因β-actin的表达量为0.0116(0.0021,0.0118)。Wip1mRNA在难治组外周血中性粒细胞中的表达水平分别较缓解组及正常对照组增高,差异有统计学意义,P<0.05；WiplmRNA在缓解组及正常对照组外周血中性粒细胞中的表达水平无统计学差异,P>0.05。正常对照组、缓解组、难治组外周血.单个核细胞中Wip1mRNA的表达水平差异无统计学意义,P>0.05。3.浙贝黄芩汤醇提取物作用于HL60、HL60/ADR细胞,HL60细胞早期凋亡率及晚期凋亡率增加,P<0.05;HL60/ADR细胞早期凋亡率增加,P<0.05,晚期凋亡率与对照组相比差异无统计学意义,P>0.05。浙贝黄芩汤醇提取物作用后,HL60细胞Wip1mRNA水平下调,HL60/ADR细胞WiplmRNA表达水平无明显变化。4.WiplmRNA在HL60/ADR细胞中的表达水平低于HL60细胞。与单用阿霉素组相比,非毒剂量(<IC10)浙贝黄芩汤醇提取物联合阿霉素作用后,HL60细胞WiplmRNA表达上调、HL60/ADR细胞WiplmRNA表达下调。Wipl高表达HL60细胞阿霉素的IC50值为0.35±0.09ug/m1,转染对照质粒HL60细胞阿霉素的IC50值为0.36±0.17ug/ml,两组比较差异无统计学意义,P>0.05。结论1.浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物能不同程度的抑制HL60及HL60/ADR细胞增殖,以醇提取物抑制作用最强。浙贝黄芩汤水提取物、醇提取物、酸水提取物对HL60/ADR细胞的抑制作用弱于HL60细胞。非毒剂量(<IC,0)浙贝黄芩汤醇提取物能有效增加HL60细胞对阿霉素的敏感性,并部分逆转HL60/ADR细胞对阿霉素的耐药性。2.Wipl可能在难治性急性髓系白血病患者外周血中性粒细胞中高表达,其在急性髓系白血病中的表达情况仍有待进一步检测研究。3.浙贝黄芩汤醇提取物能促进HL60、HL60/ADR细胞凋亡,但与Wip1的相关性不明确。4.本实验未显示Wipl高表达与HL60细胞化疗敏感性的相关性,浙贝黄芩汤醇提取物对HL60/ADR细胞的耐药逆转作用与Wipl表达未显示相关性。
王晓军[2]2016年在《白血病细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF测定及其意义》文中进行了进一步梳理白血病(leukemia)是造血干/祖细胞出现分化受阻、凋亡障碍和恶性克隆性增生而引起的一组异质性的造血系统恶性肿瘤。目前我国白血病的发病率为3-4/10万,在各种恶性肿瘤凋亡率中,白血病在男性患者位居第六位,女性患者位列第八位,在儿童及35岁以下成人中则居首位。研究发现,与实体肿瘤一样,血液肿瘤的发生、发展与血管新生和信号传导密切相关。目前这一研究已逐渐成为众多学者关注的焦点。在肿瘤形成过程中,异常的血管生成发挥着关键作用。肿瘤生长依赖于血管生成。肿瘤细胞具有诱导血管生成的潜能,这种潜能必需在生长因子的刺激下才能转化为发挥作用的表型。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是最强的血管生长因子之一,是一种十分重要的正性调控因子。近年来,研究表明,白血病患者体液中bFGF水平亦较正常对照明显升高,骨髓中有明显的血管新生现象。体内体外的各种实验均证实了bFGF对于血管内皮细胞的促增殖活性。人们发现白血病细胞有bFGF和或bFGFR的异常表达,bFGF可以通过自分泌或旁分泌直接刺激白血病细胞,通过加强酪氨酸激酶信号传导水平促进肿瘤细胞增殖。新生血管持续不断的为肿瘤提供营养和排除代谢产物,在肿瘤的发生、转移及预后方面起着重要作用。在很多恶性血液病中,血管增生是一个重要的病理生理过程,骨髓血管增生与AML、ALL和CML的预后不良有关。近年来,对AML和CML患者骨髓血管增生和血管内皮生长因子(VEGF)水平之间关系的研究中发现,与对照组相比,各类型白血病患者骨髓微血管密度都有显著增高,而且与VEGF有明显的相关性,其中CML患者骨髓微血管密度及VEGF水平增高最为显著。环氧合酶-2(cyclooxygenase2, COX-2)在实体瘤中可以促进肿瘤发生、发展,其在白血病中表达也有所提高,COX-2与白血病中VEGF表达及血管新生有关,需要进一步研究证明。COX-2诱导花生四烯酸合成的主要代谢产物PGE2：同样在肿瘤的血管生成中起作用,诱导血管生长因子如VEGF、bFGF合成。血细胞的增殖、分化、成熟及凋亡受多种具有刺激活性或抑制活性的两大类所谓正性或负性的细胞因子组成的网络的调控。转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGFβ1)是目前已知的作用最强的血细胞增殖的负调控因子,多种正常血细胞如单核细胞、淋巴细胞、血小板等均能产生TGFβ1,它不仅能刺激成纤维细胞的生长,修复创伤,还能调节造血,抑制肿瘤细胞的增殖。目前大多研究开展的是对COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF这四种因子单个或两三个因子进行检测,并探讨其临床意义,但理论创新不足,应用范围有限,而本研究通过检测白血病细胞COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGF β1及VEGF水平的变化情况,同时对四种因子之间的相关性予以研究,分析各检测指标在白血病的临床治疗中的指导意义,探讨白血病的发生发展与血管生成的关系。第一部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在急性白血病的表达及其意义目的检测不同类型急性白血病(AL)患者在不同时间段的COX-2、FGF、TGF β1、VEGF等指标的变化情况,分析各检测指标在AL的诊断、治疗及预后判断中的临床意义。方法以在安康市中心医院就诊的90例AL患者为研究对象,以该院体检中心健康体检者40例为正常对照,采用ELISA方法检测血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的含量,并对AL患者进行治疗前、后两个不同阶段的动态检测；对于AL患者,采用骨髓涂片在显微镜下按常规分类计数200个有核细胞,计算原始加幼稚细胞比例的方法进行诊断。结果1.初诊时,AL组的血清COX-2含量出现显著升高的趋势,与正常对照组相较,差异显著,具有统计学意义(P<0.001, t/χ2=6.082).2.初诊时,AL组的血清bFGF含量出现显著升高的趋势,与正常对照组相较,差异显著,具有统计学意义(P<0.001,t/χ2=820.000)。3.AL组初诊时血清TGFβ1含量明显减低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.001,t/χ2=860.000)。4.初诊时,AL组的血清VEGF含量出现显著升高的趋势,与正常对照组相较,差异显著,具有统计学意义(P<0.001, t/χ2=4133.000).5.治疗前AML组血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平与ALL组患者比较,差异没有统计学意义(分别为P=0.586,χ2=1077.000;P=0.646, χ2= 2906.500; P=0.986,χ2=1135.500; P= 0.729 χ2=2919.000)。6.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,患者血清TGFβ1含量逐渐恢复到正常数值,与正常对照组相较,差异无统计学意义(P=0.895,χ2=3774.000)。7.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,血清bFGF、COX2及VEGF含量出现显著降低的趋势,与正常对照组相较,差异无统计学意义(分别为P=0.806,χ2=3756.000；；P=0.868,χ2= 2173.500;P=0.905,χ2= 2181.000).8.患者接受2至3个疗程的治疗后,达到完全缓解(CR)时,bFGF、COX2、 VEGF及TGFβ1水平与治疗前相较,差异有统计学意义(分别为P<0.001,F=61.802;P<0.001,F=1342.108;P<0.001,F=458.935;P<0.001, F=1349.146)。9.AL初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与骨髓始加幼稚细胞数呈正相关(分别为R=0.0.303,P=0.005；R=0.435,P<0.001；R=0.293,P=0.006),而TGFβ1水平与骨髓始加幼稚细胞数呈负相关(R=-0.379, P<0.001)。10.AL初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与TGFβ1水平比较均呈负相关(分别为R=-0.401,P<0.001；R=-0.578,P=0.001；R=-0.388,P<0.001)。以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论研究表明,促血管生成因子COX-2、VEGF及bFGF在急性白血病患者血清中含量显著增加,化疗后完全缓解组患者血清COX-2、VEGF及bFGF含量显著下降,而血清TGF β1水平在急性白血病患者血清中含量明显减低,而化疗后完全缓解组患者血清TGFβ1含量显著升高,提示血管生成可能在急性白血病的发生、发展中具有一定作用。因此,动态监测AL患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作为急性白血病病情进展的重要参考指标。第二部分：COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF在慢性粒细胞白血病的表达及其意义目的检测不同分期慢性粒细胞白血病(CML)患者不同发展阶段血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的变化,对它们在CML的诊治和术后干预中的临床意义进行探讨。方法以在安康市中心医院就诊的50例初诊CML患者为研究对象,以该院体检中心健康体检者40例为正常对照,采用ELISA方法检测血清COX-2、bFGF、 TGFβ1及VEGF的含量,并对CML患者进行治疗前、后两个不同阶段的动态检测；对于AL患者,采用骨髓涂片在显微镜下按常规分类计数200个有核细胞,计算原始加幼稚细胞比例的方法进行诊断。结果1.初诊时,CML组各期患者的血清COX-2含量显著升高,与正常对照组比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.001,t/χ2=34.862)。2.初诊时,CML组各期患者的血清bFGF含量显著升高,与正常对照组比较,差异显著,具有统计学意义差异(P<0.001,t/χ2=820.000)。3.CML组各期初诊时血清TGFβ1含量明显减低,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.001,t/χ2=1289.000);4.初诊时,CML组各期患者的血清VEGF含量显著升高,与正常对照组比较,差异显著,具有统计学意义(P<0.001,t/χ2=1402.000)。5.治疗前CML组急变期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平较慢性期患者增高,而TGF β 1水平减低,差异均有统计学意义(分别为P<0.001,t/χ2=-6.974; P<0.001,t/χ2=485.000;P<0.001,t/χ=465.000; P<0.001,t/χ2=55.000));26.治疗前CML组加速期患者血清bFGF、COX2及VEGF水平较慢性期患者增高,差异有统计学意义(P<0.05),而TGFβ1水平减低,差异有统计学意义(分别为P<0.001,t/χ2=6.117；P<0.001,t/χ2=575.000；P<0.001,t/χ2= 445.000;P<0.001,t/χ2=65.000)。7.经过甲磺酸伊马替尼治疗后,达到完全缓解(包括完全血液学缓解、完全遗传学缓解及完全分子学缓解)(CR)时,血清bFGF、COX2及VEGF含量明显下降,而TGFβ1含量基本恢复到正常水平,与正常对照组相较,差异均无统计学意义(分别为P=0.950,t/χ2=-0.063;P=0.983,t/χ2=1518.000; P=0.584, t/χ2=1468.500;P=0.742,t/χ2=1299.000)。8.患者接受甲磺酸伊马替尼治疗后,未达到缓解(包括部分缓解、血液学复发和耐药)时,血清bFGF、COX2、VEGF及TGFβ1水平与CR组比较差异显著,有统计学意义(分别为P<0.001,t/χ2=-28.355;P<0.001,t/χ2=630.000;P <0.001,t/χ2=137.000;P<0.001,t/χ2=123.000)9.CML初诊患者治疗前血清bFGF、COX2及VEGF水平与TGFβ1水平呈负相关(分别为R=-0.315,P=0.026；R=-0.330,P=0.020；R=-0.632,P<0.001)以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论CML患者初诊时存在COX-2、VEGF及bFGF的高表达,TGFβ1在CML初诊时存在低表达,经过甲磺酸伊马替尼治疗后,达到完全缓解时,血清COX-2、VEGF、bFGF及TGFβ1含量基本恢复正常,提示与CML的发生、发展有密切关系。根据以上研究,说明动态监测CML患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF水平,可作为CML病情进展的重要参考指标。第三部分：白藜芦醇对K562细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达的影响摘要目的：探讨COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF对人白血病细胞增殖的影响机制。方法：采用不同浓度白藜芦醇(Res)及伊马替尼(IM)对K562细胞进行干预,通过MTT法、台盼蓝染色、Hoechst 33258染色及流式细胞术观察细胞凋亡情况,同时将K562细胞株分为空白对照组、IM单药组(0.1μmol/L、0.2μmol/L)、Res单药组(50μmol/L)；100μmol/L)、200μmol/L)、IM联合Res组(IM0.1μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.1μmol/L+Res 200μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 50μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 100μmol/L、IM 0.2μmol/L+Res 200μmol/L)。采用荧光定量PCR及Western blot检测其给药后COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF的变化。结果：1、细胞抑制率随白藜芦醇及伊马替尼药物浓度的增高而呈上升趋势,各组间相比差异具有统计学意义(P<0.05),与单独使用白藜芦醇或者伊马替尼相比,细胞增殖的抑制率明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05),其中200μmol/mL白藜芦醇+200μmol/L伊马替尼组细胞的抑制率最高；随着时间的延长,白藜芦醇与伊马替尼联合作用组细胞的增殖抑制作用明显增高,且当作用72 h时细胞的增殖抑制作用最高。2、台盼蓝拒染实验检测两种药物联合运用后对K562细胞的细胞毒作用。结果表明,各联合用药浓度组对K562细胞的细胞毒作用均高于单用白藜芦醇组和伊马替尼组,且当用200μmol/ml白藜芦醇+0.2μmol/L伊马替尼作用K562细胞时细胞的凋亡率最高；随着时间的延长,白藜芦醇与伊马替尼联合作用后使细胞的凋亡率明显增高,且当作用72 h时细胞凋亡率为最高。3、采用伊马替尼及白藜芦醇对CML细胞株caspase-3进行检测发现,随着白藜芦醇或伊马替尼浓度升高,其caspase-3活性逐渐增强。4、流式细胞术检测显示单用白藜芦醇及单用伊马替尼对人白血病细胞K562均具有凋亡作用,而随着白藜芦醇浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐增高；随着伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐上升。5、Hoechst 33258染色实验检测显示单用白藜芦醇及单用伊马替尼对人白血病细胞K562均具有凋亡作用,而随着白藜芦醇浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐增高；随着伊马替尼浓度的增加,K562细胞的凋亡率逐渐上升。6.PCR及Western blot结果显示,相较于对照组,0.2μmol/L伊马替尼组的COX-2、bFGF及VEGF的表达量明显降低,而TGFβ1 mRNA的表达均显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05)；而用200μmol/mL白藜芦醇±0.2μmol/L伊马替尼联合作用于K562细胞后,细胞中TGFβ1 mRNA的表达明显增高,而COX-2、bFGF及VEGF mRNA的表达均显著降低,与对照组和0.2μmol/L伊马替尼组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。以上数据均采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学分析。结论 白藜芦醇及伊马替尼对白血病K562细胞株均具有促进凋亡作用,其联用可明显增加其凋亡率。对血管生成具有抑制作用的白藜芦醇能够增加TGFβ1 mRNA和蛋白的表达,减低COX-2、bFGF及VEGF mRNA和蛋白的表达,从而促进K562的凋亡,间接反映血管生成在白血病中的作用。
鹿全意[3]1996年在《急性白血病细胞癌基因表达及其临床意义的研究》文中提出抑癌基因P~(?)和原癌基因c-myo是与细胞增殖、分化调节有关的，在人类肿瘤中失常频率最高的两种癌基因。在白血病的发生、发展过程中也涉及多种癌基因的异常，包括p~(?)、c-myc的突变与异常表达。因为急性白血病细胞中癌基因的突变不多见，所以癌基因的表达异常是细胞增殖异常及耐药形成的重要原因。为了研究p~(?)和o-myo基因在急性白血病细胞中表达状况、相互关系及其对白血病诊断、预后的影响，我们对40例急性白血病进行了研究。 采用~3H-dATP标记癌基因探针，DNA-RNA斑点杂交方法检测基因的RNA表达，用单抗标记，免疫组化方法检测蛋白产物在细胞内的表达。根据治疗结果，把40例患者分成有效及耐药组，以P_(170)表达为参照，分析癌基因表达异常对白血病预后的影响，并对o-myc异常表达所致的耐药机理进行了初步分析。 实验结果表明：85％的病例有o-myo RNA表达的升高，与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，各亚型之间o-myo表达水平无差异(P＞0.5)，同一亚型之间，c-myc表达水平与骨髓中白血病细胞的比值有关。p~(?)基因表达在粒、淋白血病之间有显著不同，急淋细胞均表达P~(?)的RNA与对
佚名[4]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中指出14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显著差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
晏建国[5]2016年在《三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞WNT信号通路抑制基因（HDPR1、WIF-1、DKK3）组蛋白和DNA甲基化修饰调控及其机制研究》文中提出目的:本研究主要是选择急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞株NB4细胞中异常高甲基化的WNT信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因为靶点,从表观遗传学的DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰两个方面,探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As203)治急性早幼粒细胞白血病(APL)可能的表观遗传学机制;通过对As203作用NB4细胞前后DNA甲基转移酶、组蛋白甲基化酶、组蛋白去甲基化酶表达差异的检测,分析三氧化二砷调控DNA和组蛋白甲基化可能的作用机理;并通过对As203作用NB4细胞前后β-catenin、Survivin基因、cyclin-D1基因以及C-myc基因表达差异的检测,进一步分析三氧化二砷对WNT信号通路下游重要靶基因表达影响;从而比较完整的从DNA甲基化和组蛋白甲基化的表观遗传学层面阐释三氧化二砷影响NB4细胞WNT/β-catenin信号通路发挥抗APL作用的可能机制。方法:1.采用CCK-8法检测As203对急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞存活率的影响;Annexin V FITC/PI流式细胞仪检测As203作用NB4细胞前后凋亡率;流式细胞仪检测As203作用NB4细胞前后细胞周期百分率;采用重亚硫酸盐测序聚合酶链反应(bisulfite sequencing polymerase chain reaction BSP)联合TA克隆测序方法,定量分析不同实验组三氧化二砷作用前后NB4细胞株其WNT信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因DNA启动子区甲基化水平的变化,并通过与MSP、焦磷酸测序相比,探讨BSP优缺点;2.采用染色质免疫共沉淀(chromatin immunopreciprtation assay CHIP)技术检测As203作用NB4细胞前后WIF-1、DDK3、HDPR1基因启动子区组蛋白H3K9单甲基化、二甲基化和三甲基化的水平;采用荧光实时定量PCR法(q RT PCR)检测As203作用NB4细胞前后DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B,H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a,H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C和JMJD2D,进一步探讨三氧化二砷对NB4细胞WNT通路抑制基因组蛋白H3K9甲基化和DNA甲基化影响的可能的机制。3.采用荧光实时定量PCR法(q RT PCR)检测As203作用NB4细胞前后WNT/β-catenin信号通路抑制基因WIF-1、DDK3、HDPR1基因,WNT信号转导通路重要调节蛋白β-catenin以及WNT信号通路下游重要靶基因Survivin、cyclin-D1和C-myc m RNA的表达,比较完整的从组蛋白甲基化和DNA甲基化的表观遗传学层面阐释As203影响NB4细胞WNT/β-catenin信号通路发挥抗APL作用的可能机制。结果:1.不同浓度As203作用NB4的细胞后,NB4细胞增殖抑制率随时间和浓度增加而显著升高;细胞凋亡比例也逐渐增加,24 h、48 h以早期凋亡为主,72h细胞以中晚期凋亡为主;细胞周期24 h、48 h以G2/M期增加的较为明显,72 h有轻度的G0/G1期增加。2.经过BSP联合TA克隆测序方法检测发现,As203处理NB4细胞后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,WIF-1、DDK3、HDPR1基因甲基化率进行性下降,甲基化程度明显减弱。通过与MSP、焦磷酸测序相比,用BSP具有较高的甲基化状态检出率,且方法较为简单,重复性较强,能准确检测目的基因片段中各Cp G位点的甲基化情况,对分析Wnt信号通路抑制基因甲基化状态具有较高的特异性和敏感性。3.经过q RT PCR检测发现,As203处理NB4细胞后,As203处理NB4细胞前后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,HDPR1基因的m RNA相对表达量呈上调趋势,甲基转移酶DNMTl、DNMT3A、DNMT3B的表达呈下降趋势。4.采用CHIP检测发现,As203处理NB4的细胞后,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,WIF-1、DDK3和HDPR1基因启动子区的组蛋白H3K9me3均有不同程度的下降,以HDPR1基因明显;而H3K9me1,2表达不受影响。经过q RT PCR检测发现,As203作用NB4细胞后,随着浓度的增加,作用时间延长,H3K9组蛋白甲基转移酶SUV39a、G9a的m RNA相对表达量呈下调趋势,其中G9a m RNA的下调更为明显;同时H3K9组蛋白去甲基化转移酶JMJD2D m RNA的表达上调,而JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C表达不受影响。5.经过q RT-PCR检测发现,As203作用NB4细胞后,随着药物浓度的增加,干预时间的延长,β-catenin表达水平明显下调,同时,survivin、c-myc和cyclin-D1表达也随之下降,与未处理组细胞相比差异有统计学意义。结论:1.As203能够明显的抑制急性早幼粒细胞白血病NB4细胞的生长和增殖,随着药物浓度的增加,作用时间的延长,细胞凋亡率随之逐渐增加,而且使细胞周期阻滞于G2/M期;2.As2O3能逆转急性早幼粒细胞白血病NB4细胞WIF-1、DKK3、HDPR1基因启动子区的DNA异常高甲基化和下调WIF-1、DKK3、HDPR1基因启动子区的H3K9 me3甲基化水平而使表达受抑的肿瘤抑制基因WIF-1、DKK3、HDPR恢复表达;3.BSP具有较高的甲基化状态检出率,且方法较为简单,重复性较强,能准确检测目的基因片段中各Cp G位点的甲基化情况,对分析Wnt信号通路抑制基因甲基化状态具有较高的特异性和敏感性,可广泛应用于筛选不同类型标本基因启动子甲基化分析;4.As203可能通过抑制组蛋白甲基化酶SUV39a和G9a和DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表达来逆转组蛋白和DNA的高甲基化;5.As203通过下调组蛋白和DNA甲基化基础上,可能通过组蛋白-DNA循环反馈机制,进一步下调组蛋白和DNA甲基化水平;6.通过下调组蛋白甲基化酶SUV39h1的表达来减少PML-RARa/SUV39h1复合物形成,抑制H3K9甲基化,促进基因转录表达,促进血细胞分化。7.通过下调DNA甲基转移酶DNMT1和组蛋白甲基化酶G9a的表达来减少DNMT1-UHRF1-G9a复合体形成,抑制H3K9甲基化,促进基因转录表达。8.As203处理NB4细胞后,随着药物浓度的增加,干预时间的延长,c-myc和cyclin-D1表达水平明显下调,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
韩燕燕[6]2011年在《SARI基因与白血病相关性的实验研究》文中认为目的①探讨sari mRNA、SARI蛋白在白血病细胞株中的表达情况及相关性;探讨SARI信号通路在白血病细胞中的可能相关基因及在白血病中的作用。②探讨IFN-β作用于白血病细胞后对细胞生长、细胞周期的影响及对SARI信号通路可能相关基因表达的影响。③分析探讨sari mRNA及SARI信号通路可能相关基因mRNA在白血病患者中的表达情况及临床意义。方法①收集急慢性髓系、淋系白血病细胞株,采用逆转录聚合酶链反应检测白血病细胞株sari及AP-1、白血病相关基因(bcl-2、bax、c-myc、p53、cyclinD1、caspase3)mRNA的表达;采用Western蛋白免疫印迹法检测白血病细胞株SARI蛋白的表达。②一定浓度的IFN-β作用于白血病细胞一定时间后,MTT法检测IFN-β对细胞生长的影响;流式细胞周期分析检测IFN-β对细胞生长周期的影响;逆转录聚合酶链反应检测IFN-β对细胞中sari及SARI信号通路可能相关基因mRNA的表达情况的影响。③收集血病患者标本218例,依据MIC分型诊断标准分型,并分为初治组、复发组、缓解组;收集正常对照标本30例。采用逆转录聚合酶链反应检测白血病患者及正常对照标本sari及AP-1、cyclinD1、p53 mRNA的表达。结果①sari mRNA在髓系白血病细胞株中的表达量明显高于在急性淋系白血病细胞株的表达量(p<0.05);在慢性髓系白血病细胞株中的表达量明显高于在急性髓系白血病细胞株中的表达量(p<0.05);在急性髓性白血病细胞株的野生型的表达量高于耐药株(p<0.05)。il-8 mRNA在急性髓系白血病细胞株中的表达量明显高于在慢性髓系白血病细胞株的表达量(p<0.05);在急性淋系白血病细胞株中没有表达;在白血病细胞株野生型和耐药株之间表达量没有显著差异。bcl-2 mRNA在急性髓系白血病细胞株中的表达量明显高于在慢性髓系白血病细胞株中的表达量(p<0.05);在急性淋系白血病细胞株中的表达量高于在慢性髓系白血病细胞株的表达量而低于在急性髓系白血病细胞株中的表达量(p<0.05);在急性髓系白血病细胞株的野生型中的表达量明显高于耐药株(p<0.05)。p53 mRNA在HL60、H/A、KAR细胞株中表达缺失,而在K562、Jurakt、CEM白血病细胞株中表达阳性。cyclinD1 mRNA在NB4、H/A、K562中呈阳性表达,而在其他几个白血病细胞株中表达缺失。bax mRNA在急性髓性白血病各细胞株中的表达量没有统计学差异,在慢性髓性白血病细胞株K562和KAR中的表达具有显著的统计学差异(p<0.05),在急性淋系白血病细胞株Jurkat和CEM中的表达具有显著的统计学差异(p<0.05)。caspase3 mRNA在急性髓性白血病细胞野生株和耐药株之间表达量没有差异,在慢性粒细胞白血病细胞耐药株中的表达量高于野生株(p<0.05)。c-myc mRNA在髓系白血病细胞株和急性淋系白血病细胞株的表达量没有显著差别。SARI蛋白在白血病细胞株的表达量与sari mRNA的表达具有正性相关性(p<0.05)。在髓性白血病细胞株(HL60、NB4、H/A、K562、KAR)中,sari mRNA与il-8 mRNA、bcl-2 mRNA的表达经Pearson相关分析,具有负相关性(p<0.05);il-8 mRNA与bcl-2 mRNA的表达经Pearson相关分析,具有正相关性(p<0.05)。②一定浓度的IFN-β作用于白血病细胞一定时间后,对白血病细胞的生长、细胞周期及SARI、SARI信号通路可能相关基因的表达没有显著影响。③各型白血病患者(初治组、复发组、缓解组)sari mRNA的表达量均小于正常对照组(p<0.01)。各型白血病患者初治组间sari mRNA的表达量不同,从收集到的各型白血病初治组结果分析,表达量水平为M3<M2<M5<CML<ALL<CLL。各型白血病初治组、复发组/未缓解组的表达量均小于对应的缓解组, (p<0.01);各型白血病初治组与复发组/未缓解组的表达量比较,没有统计学差异。慢性粒细胞白血病慢性期初治组、加速期组、急变期组、干细胞移植后组sari mRNA的表达量依次增加,且相邻的两组之间比较均具有统计学差异(p<0.01)。在髓性白血病初治组中sari mRNA与il-8 mRNA具有负相关(p<0.05)。结论①SARI在各种白血病细胞株中均有表达,SARI蛋白的表达与SARI转录水平的调控有关。②在髓性白血病细胞株中,SARI的表达水平与细胞的分化程度有关,在髓性白血病细胞株中SARI与AP-1、bcl-2的表达呈负相关(p<0.05),这三种基因在白血病的发生发展过程中可能存在相互作用;SARI与急性髓性白血病细胞的耐药性可能有关。③IFN-β对白血病细胞的生长和凋亡以及“SARI-AP1-下游基因”信号通路没有显著的影响。④sari mRNA在各型白血病患者中的表达有一定的差异,但均小于在正常对照中的表达,且各型白血病初治组、复发组/未缓解组的表达量均小于相应的缓解组,SARI可作为白血病诊断、疗效监测和预后判断的生物学指标之一。
罗玲清[7]2009年在《WWOX及其相关分子在白血病中的表达及相关性研究》文中进行了进一步梳理目的①探讨WWOX mRNA在白血病患者以及白血病细胞株中的表达情况及其临床意义。②分析探讨WWOX及其相关分子在白血病中表达的相关性及其临床意义。方法①收集白血病患者标本182例,依据FAB分型诊断标准分型并分为初治组、缓解组、复发组;收集正常人标本43例,白血病细胞株5例。采集单个核细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测以上标本WWOX的阳性表达率和mRNA含量,并进行比较,分析其临床意义。②采用Western蛋白免疫印迹法检测白血病患者和白血病细胞株中WWOX蛋白、bcl-2蛋白、p73蛋白的表达情况;分析探讨WWOX、bcl-2、p73在白血病患者中表达的相关性及其临床意义。结果①白血病患者WWOX mRNA表达的总阳性率为46.15%,明显低于正常对照组90.7%(P<0.01)。急性白血病(AL)组和慢性慢性粒细胞白血病(CML)组、急性髓性白血病(AML)组和急性淋巴细胞白血病(ALL)组的WWOX mRNA阳性表达率及阳性表达患者WWOX mRNA的表达均值均低于正常对照组(P<0.01),但在AL和CL之间、AML和ALL之间差异无统计学意义(P>0.05)。AL初治组、复发组、AML初治组/复发组及ALL初治组/复发组的WWOX mRNA表达阳性率均低于缓解组(P<0.01);而AL、AML、ALL各缓解组与正常对照组差别无统计学意义(P>0.05)。AL、AML、ALL初治、复发组中阳性标本的WWOX mRNA表达均值均低于各自缓解组阳性标本(P<0.01);而缓解组与正常对照比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。CML初治组、急变/加速组的WWOX mRNA阳性率低于正常对照组(P<0.01),而CML缓解组与正常对照组的WWOX mRNA阳性率差别无统计学意义(P>0.05)。在CML患者中,不管是初治组或者是缓解组,其阳性标本WWOX mRNA表达值均低于正常对照组(P<0.01);且CML初治组表达低于缓解组(P<0.05),急变组表达低于初治组和缓解组(P<0.05)。WWOX mRNA阳性表达率在初治患者不同性别、不同年龄、不同幼稚细胞百分比组之间的差异无统计学意义。WWOX mRNA阳性表达初治患者的缓解率(76.32%)高于WWOX阴性表达患者的缓解率(35.71%),差别有显著性意义(P<0.01)。4种白血病细胞株WWOX mRNA表达缺失或低表达,与临床标本检测结果基本一致。②Western blot结果显示,AL组、CL组患者WWOX蛋白、p73蛋白表达阳性率及水平均低于正常对照组(P<0.01),而bcl-2蛋白则高于正常对照组(P<0.01)。WWOX蛋白、p73蛋白、bcl-2蛋白的表达水平在AL和CL组中进行比较,差别均无统计学意义(P>0.05)。在AL缓解组与AL初治组之间,WWOX蛋白、bcl-2蛋白表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05),但p73蛋白差别无统计学意义(P>0.05)。白血病患者WWOX蛋白的表达阳性率与p73阳性率呈正相关(r=0.715,P<0.01);与bcl-2阳性率呈负相关(r=-0.305,P<0.01)。WWOX蛋白的表达阳性率与WWOX mRNA阳性率也呈正相关(r=0.771,P<0.01)。5种白血病细胞株WWOX蛋白、p73蛋白的表达减弱或缺失,而bcl-2蛋白高表达。结论①WWOX在急性和慢性白血病患者及白血病细胞株中常表达缺失,与白血病的发生有一定联系。②白血病完全缓解者WWOX表达水平升高,复发时又降低,表达缺失者预后较差,WWOX可作为白血病诊断、疗效监测和预后判断的生物学指标之一。③白血病细胞中WWOX蛋白的表达与其转录水平的调控有关。④白血病患者WWOX蛋白的表达与p73蛋白的表达呈正相关,与bcl-2呈负相关,这三种蛋白在白血病发生发展过程中可能存在相互作用。
时昊[8]2001年在《c-kit R在急性白血病中的表达及其临床意义研究》文中进行了进一步梳理[目的]本研究主要探讨c-kit受体（c-kit R，CD117）在急性白血病（AL）中的表达及其临床意义。重点了解c-kit R表达对在急性非淋巴细胞白血病（ANLL）与急性淋巴细胞白血病（ALL）鉴别诊断的价值及与ANLL的临床和生物学特征的关系。同时，观察可溶性c-kit R（s-kit）表达在AL中的变化以及造血因子对c-kit R表达的调控。[方法]采用流式细胞术（FCM）分别检测比较了24例ALL和47例ANLL初诊患者骨髓单个核细胞（MNC）跨膜c-kit R表达，并设立10例正常人骨髓标本作为阴性对照组。同时，采用酶联免疫吸附试验法（Elisa）分别检测20例ALL和35例初诊ANLL患者的血清s-kit浓度，并初步观察了促红细胞生成素（EPO），白细胞介素-3（IL-3）和干细胞因子（SCF）对ANLL患者骨髓MNC共培养前后c-kit表达水平的变化。[结果]1．ALL患者的c-kit R阳性率及血清s-kit R含量与正常人相比无明显差异（P＞0.05）。ANLL患者的c-kit R表达率和s-kit R含量则均明显高于正常人和ALL患者（P均＜0.01）。ANLL患者的c-kitR表达率与FAB亚型有一定关系。表现为c-kit R阳性率以M_1、M_2最高，M_1、M_5最低，二者间差异显著。2．ANLL患者c-kit R和s-kit R表达水平的高低与外周血白细胞计数、肝脾肿大、骨髓及外周血原始（或早幼粒）细胞百分比无关（P＞0.05）；但与染色体核型异常及LDH水平和预后明显相关（P均＜0.05）。3．c-kit阳性表达对ANLL诊断的特异度70.8％，灵敏度为85.1％，而CD13则分别为50％和72.3％。CD34/c-kit在ALL中的共表达率为4.2％；4．经SCF+IL-3+EPO三种造血生长因子联合刺激后，正常人骨髓单个核细胞c-kit阳性水平出现明显上调，在4小时～12小时内，随着时间的延长而稳定上升，而ANLL患者骨髓单个核细胞在加入造血生长因子刺激后，其c-kit表达水平出现明显下调。 C－hi在急性白血病中的表达及其临床意义的研究 摘要 ［＄ie］1．ANLL患者的 C十it表达和 S寸it含量均明显高于正常人 ALL，可以此作为诊断 ANLL、鉴别 ALL和 ANLL参考指标。C－k i t在 ANLL 各 FAB亚型表达率和阳性细胞水平不一致，以 M1十。最高，M厂Ms最 低。因此，C十 i t R可用作 ANLL分型的参考指标。 2．C－k i t R、S－k i t R在 ANLL的表达呈正相关趋势。。－k i t R 表达、S十 i t R含量与 ANLL患者外周血白细胞计数、肝脾肿大、外 周血和骨髓白血病细胞百分比均无关系，而与LDH水平、染色体异 常、和化疗CR率有关。 3．C十 i t R阳性表达对 ANLL诊断的特异度和灵敏度均优于 CD13；较之CD13，C－kit R更具应用价值。CD34／C－kit共表达可用 于ALL的排除诊断。 4．通过 C－k i t R调控的研究，提示 ANLL存在。－k i t R功能与 结构的异常，属恶性克隆性血液病。
王畅[9]2008年在《急性白血病相关基因甲基化异常的研究》文中指出DNA甲基化异常是急性白血病(AL)重要发病机制之一。ZO-1是一种紧密连接蛋白,在细胞连接及信号传导中起重要作用,参与调控细胞的增殖与分化。前期工作表明,该基因在白血病小鼠中呈高甲基化状态,推测其可能是一个新的白血病相关基因。本研究通过对细胞系及大量临床标本ZO-1基因启动子区甲基化状态进行检测,首次证明ZO-1基因是一个新的人白血病相关基因,该基因启动子区在各种类型AL中呈特异性高甲基化状态,与AL发生发展密切相关,是一个新的预后不良因素;ZO-1基因的表达受甲基化状态调控。ZO-1基因启动子区高甲基化是一个新的白血病通用分子标志物,对其进行检测可作为AL早期诊断、疗效评估、预后判断、复发预测、靶向治疗、微小残留病(MRD)监测和指导个体化治疗的有效手段,具有深远的临床意义及推广应用价值。首次成功建立用于定量检测ZO-1基因启动子区甲基化水平的SYBR-GreenI RQ MS-PCR方法,灵敏度高、特异性好,可作为一种新的、良好的白血病MRD监测手段。在国内首次将RLGS技术用于白血病研究,获得了AL及正常人基因组扫描图谱。经RLGS扫描图谱比对,获得300多个因甲基化程度不同而显影强度不等的差异点,在NotI-EcoRV文库中寻找到其中46个点所对应的基因序列信息。经初步验证已经获得3个新的白血病相关候选基因。为更好的揭示急性白血病发病机理,寻找新的白血病分子标记及治疗靶点做好前期工作及理论铺垫。
姬静璐[10]2006年在《儿童急性白血病MDM2基因与p73基因的表达及其临床意义》文中研究说明目的:本课题旨在通过应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MDM2基因与p73基因在儿童急性白血病中的表达情况,并探讨其临床意义。材料与方法:1病例及分组:本研究将2004年1月～2005年6月于我院确诊的初诊未治急性白血病患儿72例作为实验组;包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)组45例、急性髓性白血病(acute myelocytic leukemia, AML)组27例。ALL组包括L_117例、L_228例(无L_3病例);其中40例ALL患儿进行了流式细胞学分析:T-ALL8例、B-ALL32例。AML组包括M_25例、M_312例、M_44例、M_53例、M_63例(无M_1、M_7病例)。除3例失访外,其余69例患儿在首次化疗缓解后,经继续治疗观察六个月,其中50例为持续完全缓解;19例呈不良预后(6例部分缓解、9例缓解后再次复发、4例死于颅内出血)。另将10例非恶性血液病患儿及10例健康儿童作为对照组。2标本采集及处理:从实验组、非恶性血液病患儿的骨髓液及健康儿童的外周血标本中分离出单个核细胞,在提取RNA后应用RT-PCR方法得到MDM2、p73及内参照β-actin基因的cDNA扩增产物。3电泳分析:经琼脂糖凝胶电泳后,分别测定MDM2、p73
参考文献：
[1]. 浙贝黄芩汤对急性髓系白血病化疗敏感性的影响[D]. 杨臻. 北京中医药大学. 2016
[2]. 白血病细胞COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF基因表达与白血病患者血清COX-2、bFGF、TGFβ1及VEGF测定及其意义[D]. 王晓军. 南方医科大学. 2016
[3]. 急性白血病细胞癌基因表达及其临床意义的研究[D]. 鹿全意. 浙江医科大学. 1996
[4]. 肿瘤生物标志物与肿瘤转移[C]. 佚名. 第三届中国肿瘤学术大会论文集. 2004
[5]. 三氧化二砷对急性早幼粒细胞白血病细胞WNT信号通路抑制基因（HDPR1、WIF-1、DKK3）组蛋白和DNA甲基化修饰调控及其机制研究[D]. 晏建国. 福建医科大学. 2016
[6]. SARI基因与白血病相关性的实验研究[D]. 韩燕燕. 福建医科大学. 2011
[7]. WWOX及其相关分子在白血病中的表达及相关性研究[D]. 罗玲清. 福建医科大学. 2009
[8]. c-kit R在急性白血病中的表达及其临床意义研究[D]. 时昊. 苏州大学. 2001
[9]. 急性白血病相关基因甲基化异常的研究[D]. 王畅. 吉林大学. 2008
[10]. 儿童急性白血病MDM2基因与p73基因的表达及其临床意义[D]. 姬静璐. 河北医科大学. 2006
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