一、转录因子hB1F的融合表达及抗体制备（论文文献综述）
方文秀[1]（2021）在《鸡细胞表面受体Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用》文中进行了进一步梳理新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的多种禽类的急性高度接触性传染病。NDV可感染多种禽类动物,具有明显的细胞、组织和宿主嗜性。目前的研究表明,NDV的主要受体是唾液酸或含唾液酸的蛋白,其配体是病毒HN蛋白。然而,唾液酸在禽类组织细胞内的分布情况无法解释NDV的嗜性现象。目前,陆续有学者提出NDV可能存在唾液酸以外的受体。其它副粘病毒的受体包括Nectin4、SLAMF1和CD46等,对NDV粒子表面糖蛋白HN进行结构预测分析,发现HN头部区侧面存在可能与Nectin4和SLAMF1结合活性区域。因此,我们对鸡Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用开展了以下研究:首先,开展NDV利用唾液酸以外受体吸附入侵细胞的可能性研究。使用广谱性唾液酸消化药物预处理细胞后,唾液酸酶并不能完全阻断对NDV的感染。病毒与宿主细胞结合过程中可能涉及除唾液酸以外的其它受体。然后,扩增获得了鸡Nectin4和SLAMF1。本研究尝试了鸡的不同来源细胞和组织样品,最终在CEF中扩增得到鸡Nectin4和SLAMF1基因。经比对,扩增获得的序列确实为鸡Nectin4和SLAMF1完整阅读框,说明这两个基因在鸡细胞中是正常表达的。两个基因连入原核表达载体并诱导表达,最终包涵体形式表达的重组蛋白。将原核表达产物免疫小鼠,得到多克隆抗体,两者在禽类细胞上均具有Western Blotting效价。通过建立标准曲线建立鸡Nectin4和SLAMF1荧光定量PCR检测方法,并检测了不同禽类细胞中Nectin4和SLAMF1的mRNA水平。结果显示,Nectin4在DF-1细胞中mRNA表达水平相对较高,而SLAMF1在免疫细胞中mRNA表达水平相对较高。NDV感染能够刺激CEF中Nectin4和SLAMF1 mRNA水平和蛋白水平的显着上调,表明鸡Nectin4和SLAMF1与NDV感染具有一定的相关性。为了研究NDV感染后Nectin4和SLAMF1在鸡体内的变化,将NDV人工感染SFP鸡,检测不同组织脏器中Nectin4和SLAMF1的mRNA水平和蛋白水平的变化。将对照组中的健康鸡数据经统计学分析并绘制柱状图,以得到正常健康鸡组织中Nectin4、SLAMF1的mRNA相对分布。结果表明,Nectin4和SLAMF1在鸡体内的分布与新城疫典型病变呈正相关。感染NDV后,鸡组织细胞中Nectin4和SLAMF1的基因和蛋白表达量在感染最初上调,随着感染时间的增加表现下调。构建的鸡Nectin4、SLAMF1真核表达质粒得到正确表达且在细胞膜上表达。通过转染过表达基因后,在不同细胞上均表现为Nectin4和SLAMF1增强NDV的吸附能力。过表达后感染NDV,qPCR检测上清中的NP以及检测上清TCID50,结果显示Nectin4和SLAMF1可以促进NDV的感染与增殖。通过CRISPR Cas9技术将受体基因敲低后感染NDV,结果显示NDV感染显着减少。将Nectin4、SLAMF1原核表达产物预处理病毒后接种DF-1细胞,通过qPCR检测细胞上清中的NP并检测上清TCID50,结果表明Nectin4和SLAMF1原核表达产物对NDV具有遮蔽作用。利用内源性Co-IP实验研究Nectin4和SLAMF1与NDV相互作用的关系,转染受体蛋白质粒后感染NDV,Co-IP检测到Nectin4和SLAMF1与病毒蛋白的互作。将NDV-HN与NDV-F分别与受体蛋白共转染后进行Co-IP试验,结果表明Nectin4和SLAMF1的配体是HN而非F。综上表明,鸡Nectin4和SLAMF1是NDV与宿主细胞结合过程中除唾液酸以外的受体,两者在鸡体内的分布与NDV的组织嗜性相关,且能够促进NDV的吸附和感染,确定鸡Nectin4和SLAMF1的配体为HN。本文研究了 NDV感染相关的细胞受体,揭示受体差异对于NDV细胞、组织嗜性的影响,为NDV的防制研究奠定理论基础。
吕明芯[2]（2020）在《牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立》文中指出牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）是一种非分节的单股负链RNA病毒,在世界分布广泛,是引起牛呼吸道综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）的重要病原。BPIV3感染牛症状各异,轻者出现咳嗽发热等症状,严重的会引起继发的细菌感染,导致支气管细胞坏死,出现肺炎等状况。该病的广泛存在严重制约养牛产业的进一步发展,对养牛业的经济与发展造成了严重的损失。基于目前国内对BPIV3的研究较少,还没有商品化BPIV3检测试剂盒,国外虽有检测试剂盒,但检测成本较高。因此,建立一种具有自主知识产权的BPIV3血清学检测方法至关重要。另一方面,对BPIV3感染的研究离不开机制机理的研究,而检测BPIV3机理及基因功能的研究,需要定量检测蛋白的表达,但缺乏相应抗体。据报道,BPIV3的N蛋白是病毒核衣壳的主要成分,具有良好的免疫原性,可以用来制备检测抗体。因此本项目主要从三个方面进行研究。首先,进行N蛋白原核表达载体的构建与N蛋白的表达纯化。根据文献报道与对N基因生物信息学分析,本实验克隆了编码N蛋白388 aa500 aa优势抗原区域基因,成功构建pET-32a-N原核表达载体,转化并获得重组表达截短的N蛋白的基因工程菌株。当IPTG浓度为1 mM,诱导时间为8 h的条件下该蛋白表达量较高,并主要以可溶性形式表达。纯化时采用Ni-NTA亲和层析方法,当用NPI 70溶液洗脱时蛋白纯化较好,成功制备浓度约为0.6 mg/mL的N蛋白。其次,制备N蛋白多克隆抗体。将制备的截短表达的N蛋白与弗氏佐剂1:1混合后免疫昆明小鼠,初次免疫后进行两次加强免疫,采取小鼠血液吸取血清。用该血清为一抗通过Western Blotting检测接种和未接种BPIV3的MDBK细胞样本,相较于未接种的细胞,该抗体与接种病毒细胞样本在约70 KDa左右处出现特异条带,与预期的N蛋白分子量一致,表明该多克隆抗体可作为Western Blotting抗体,用于BPIV3基础理论研究中N蛋白表达的检测。最后,建立可用来检测BPIV3的ELISA检测方法。经反复实验确定的优化条件为:抗原包被浓度1.4μg/mL,37℃包被2 h;10%马血清37℃封闭1.5 h;1:50稀释血清,37℃孵育1 h;1:2000稀释二抗,37℃孵育1 h;TMB显色15 min。重复性和特异性实验表明,该ELISA检测方法重复性好、特异性强,可用作BPIV3的初步检测。利用所建立的方法检测牛血清,与进口试剂盒相比较,总符合率为90.2%。用该方法检测来自天津的牛血清,阳性率达55.3%,该牛场BPIV3防控形势严峻。本研究原核表达、纯化了BPIV3 N蛋白,用其制备的多克隆抗体可为BPIV3基础理论研究中Western Blotting检测N蛋白表达时提供支持;利用N蛋白建立的ELISA检测方法,可初步用作BPIV3的检测,在一定程度上可降低检测成本,并为检测试剂盒的开发铺设条件。
王二龙[3]（2019）在《斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究》文中指出渔用疫苗作为替代抗生素和化学药物进行鱼类细菌性疾病防治更为安全有效的防治方法,得到了世界各国的广泛重视。多联疫苗因其可预防多种疾病、减少接种次数、简化免疫程序等特点,已成为当今世界疫苗的研究和发展方向。鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）和鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）作为近年来斑点叉尾鮰养殖频发的两种细菌性疾病病原,给我国斑点叉尾鮰乃至整个水产养殖业的健康发展造成了严重危害。本研究以斑点叉尾鮰源E.ictaluri外膜蛋白OmpN2和Y.rucker外膜蛋白OmpF为研究对象,在对其进行分子克隆、生物信息学分析、原核表达和免疫原性分析基础上初步研究其作为疫苗候选目的抗原的潜力。通过添加多肽Linker接头序列、酶切连接、融合基因技术等分子生物学手段构建二联融合基因N2-F,通过分子克隆和原核表达制备二联基因N2-F亚单位疫苗。此外,采用海藻酸钠-壳聚糖等天然高分子复合物作为包被材料,研制二联基因N2-F口服微球疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式将二联基因N2-F亚单位疫苗和口服疫苗免疫接种斑点叉尾鮰,通过特异性抗体水平、非特异性免疫指标、免疫相关基因的表达和相对免疫保护率等方面综合评价其免疫保护效果并初步探讨其免疫保护机制,为生产上开发安全有效的多联疫苗,进行斑点叉尾鮰的鮰爱德华氏菌病和鲁氏耶尔森氏菌病的免疫防治提供参考。本研究具体内容包括以下几个方面:1.OmpN2与OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析通过对鮰爱德华氏菌外膜蛋白OmpN2基因和鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白OmpF基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行全面的分子特性分析和抗原表位预测,结果发现OmpN2和OmpF基因序列全长分别为1122 bp和1095 bp,分别编码373和364氨基酸序列,均具有革兰氏阴性菌穿孔蛋白保守结构域,分别属于E.ictaluri和Y.rucker外膜孔蛋白,分别具有9个和12个潜在抗原决定簇区域,两者氨基酸序列相似性为65.96%,三维结构预测显示均为三聚体的空间构象,均与同一个模板有60%以上的相似性,表明两者在结构和功能上有一定的相似性,推测其作为疫苗候选抗原可能提供一定的交叉保护作用。2.OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析通过体外原核表达技术,成功诱导表达了去除信号肽后的目的重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF,大小分别约为56 kDa和55 kDa;细菌表面显色技术和间接免疫荧光分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri能分别与兔抗rtOmpN2抗体和兔抗rtOmpF抗体发生特异性结合反应,显示显示阳性反应信号,表明OmpN2和OmpF蛋白分别位于E.ictaluri和Y.ruckeri的菌体表面,是一种细菌表面抗原。Western bloting分析显示,rtOmpN2蛋白和rtOmpF蛋白能分别被兔抗E.ictaluri和兔抗Y.ruckeri抗体识别并发生特异性反应,表明OmpN2和OmpF蛋白不仅是E.ictaluri和Y.ruckeri的抗原之一,且具有良好的免疫原性,可用作基因工程疫苗候选目的抗原。3.融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析;通过添加多肽Linker接头序列和BamH I酶切位点连接法成功构建了N2-F融合基因,大小为2133 bp;通过体外原核表达,成功诱导表达了重组融合蛋白N2-F,大小约为96 kDa;Western blotting分析显示,N2-F能分别与兔抗6×His抗体、兔抗E.ictaluri抗体和兔抗Y.ruckeri抗体发生特异性反应,显示单一、明显条带,表明融合蛋白N2-F融合表达成功,且同时具有OmpN2和OmpF的蛋白构象,能被相应的抗体识别;细菌表面显色分析显示,E.ictaluri和Y.ruckeri均能与兔抗N2-F抗体发生特异性结合反应,显示阳性反应信号,表明融合蛋白N2-F同时具有OmpN2和OmpF的免疫原性,可用作研制同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的二联基因工程疫苗候选抗原。4.二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单价疫苗rtOmpN2和rtOmpF相比,二联疫苗N2-F分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰相应的血清抗体水平及血清溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率（Relative Percent Survival,RPS）分别为76.67%和82.71%,均高于rtOmpN2（RPS为73.33%）和rtOmpF（RPS为75.86%）,表明N2-F不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更高更好的免疫保护效果。5.二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析采用响应面分析法优化了海藻酸钠-壳聚糖复合微球的制备工艺,得到最优制备条件为:海藻酸钠浓度为1.58%,水油相比例为4.0:6.0,CaCl2浓度为8.60%,壳聚糖溶液浓度为0.82%,在此条件下,重组蛋白N2-F海藻酸钠壳聚糖复合微球疫苗的包封率为93.26%,粒径为4.35±1.08μm。通过对复合微球的理化性质进行分析发现,N2-F复合微球对溶液的温度,pH和离子强度均有不同程度的敏感性,在温度较高,碱性环境以及离子强度较高的溶液中,溶胀性增强;通过体外模拟胃肠液环境分析复合微球的释放性能,发现微球能在模拟胃液（酸性环境）中释放缓慢,在模拟肠液（碱性环境）中释放速率较快,既能保护目的蛋白在胃部不被胃酸降解破坏,又能保证目的蛋白在肠道释放以供吸收;通过Western blotting检测显示,复合微球释放的蛋白为目的蛋白抗原,且保持了良好的免疫原性。安全性检测表明复合微球的安全性好,可用作鱼用口服疫苗。6.二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析与单基因rtOmpN2和rtOmpF口服疫苗相比,二联基因N2-F口服疫苗分别显着性（P<0.05）增强了斑点叉尾鮰免疫后肠黏液和血清中相应的抗体水平及溶菌酶、补体C3、总蛋白含量、SOD活性等非特异性免疫指标,提高了头肾和脾脏中免疫相关基因的表达量,对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染的相对保护率分别为73.33%和79.31%,分别高于rtOmpN2微球疫苗组（RPS为63.33%）和rtOmpF微球疫苗组（RPS为65.52%）,表明二联基因N2-F口服疫苗不仅能同时抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri两种病原菌的感染,还提供了更好的免疫保护效果。综上,通过构建二联基因N2-F,分别制备了二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗,分别以腹腔注射和拌饲口服方式免疫接种斑点叉尾鮰综合分析和评价其相应的免疫保护效果,结果显示,两种疫苗对斑点叉尾鮰抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri感染均取得理想的免疫保护效果,表明本研究制备的二联基因N2-F亚单位疫苗和N2-F口服疫苗能有效增强斑点叉尾鮰的免疫能力,对抵抗E.ictaluri和Y.ruckeri的感染起到较好的免疫防御和保护效果。其中二联基因亚单位疫苗的保护效果略优于二联基因口服疫苗,但结合水产养殖生产实践,口服免疫接种的二联基因口服疫苗更易被认可和接受。
郑浩[4]（2019）在《MultiBac高效展示系统构建及其应用于多联疫苗的模型研究》文中认为杆状病毒展示系统（Baculovirus Display System,BDS）是一种优秀的真核生物表面展示系统,具备安全、高效和经济等优点。由于杆状病毒载体对哺乳动物安全,兼具基因表达水平高、蛋白修饰完善等特点,BDS被广泛应用于抗原呈递、基因治疗和基因工程疫苗等领域。近年来研究发现,BDS的应用和推广主要受到如下4个方面的限制:（1）传统BDS利用目标基因与Class Ⅲ型囊膜蛋白基因的融合表达,实现目标蛋白囊膜展示的同时,杆状病毒自身Class Ⅲ型囊膜蛋白也高量表达,从而产生2种囊膜蛋白之间的强烈竞争,导致目标蛋白的展示效率低;（2）由于转移载体和外源基因引入方式等限制,BDS多局限于单一/双目标蛋白的研究,针对多目标蛋白的融合共展示研究尚无深入探索;（3）传统BDS一般使用病毒极晚期活性启动子介导融合基因的表达,启动子表达时序性差异同样引起蛋白竞争、降低展示效率,且杆状病毒启动子具有典型的宿主蛋白依赖性,在多数非宿主细胞内不具有表达活性;（4）囊膜蛋白可介导杆状病毒转导哺乳动物细胞,但转导效率较低,无法满足BDS的应用需求。因此,提高BDS展示效率、深入探索多目标蛋白的共展示能力、筛选出一种不依赖宿主细胞特异性转录因子的极早期高效表达启动子和提高杆状病毒对非宿主细胞转导效率,成为BDS系统亟待开发应用的关键因素。该研究首先筛选并设计出含有博莱霉素抗性基因（ZeocinR）的同源重组基因gp64F-ZeocinR-gp64R,Red-gam重组等技术构建gp64基因缺失型菌株E.coli Ac Multi Bac/Δasd Sw106/PGB2ΩInv/Δgp64（Sw106-Δgp64）,并基于Sw106-Δgp64重组菌确定了囊膜蛋白GP64的缺失将导致重组杆状病毒无法完成出芽、成熟等过程;内部核糖体进入位点序列（Internal Ribosome Entry Site,ires）介导的荧光素酶（Luciferase）表达量测定结果表明,ires在昆虫sf9细胞的表达效率显着低于上游启动子的直接作用,12 h.p.i达到差异极显着水平（p<0.01）;且ires补偿表达方式的引入,可显着降低野生型GP64的表达量,并拯救重组杆状病毒完成复制循环;TEM检测也表明低GP64组装对重组病毒粒子的滴度、复制周期和形态结构等无显着影响。其次,为探究ires介导GP64低量表达对BDS展示效率和展示能力的提升,基于Sw106-Δgp64重组菌的Luciferase和荧光蛋白融合展示测定结果表明,ires介导的GP64低量表达可将Luciferase的展示效率提高约5倍（p<0.01）;LSCM和Western Blot检测结果显示,Zero-Background Tn7和Cre-loxP特异性转座,成功实现了3种荧光蛋白（GFP、mCherry和YFP）稳定、高效的共展示在sf9细胞和重组病毒囊膜表面。基于启动子表达时序性研究,系统测定了杆状病毒启动子（p10、p64、pvp39）和哺乳动物细胞活性启动子（pcmv、psv40、pie1）在昆虫sf9、BHK-21和293T细胞的表达效率,并筛选出杆状病毒极早期活性启动子p64和非病毒蛋白依赖性启动子WSSV-pie1可介导融合基因的高效表达和展示;此外,结合流式细胞术,验证了Invasin和VSVG在病毒囊膜的修饰作用,可提高重组病毒粒子对非宿主细胞（BHK-21、293T）的转导效率。最后,利用Sw106-Δgp64重组菌和ires介导的野生型GP64低量表达等方式,成功构建出一种高效率、共展示4种目标蛋白（PCV2-Cap、PRRSV-Gp5、CSFV-E2、Invasin）的重组杆状病毒,Western Blot和囊膜抗原ELISA检测结果表明,4种目标蛋白的展示效率相较于传统BDS均有极显着提升（p<0.01）;以BALB/c小鼠为模型,进一步验证了Sw106-Δgp64系统和ires-V5gp64补偿表达等方式,比传统BDS可诱导小鼠产生更高水平的特异性抗体（p<0.01）。综上所述,该研究成功构建了一种gp64基因缺陷型E.coli Ac Multi Bac/Δasd Sw106/PGB2ΩInv/Δgp64,通过ires介导GP64低量表达等方式,在不影响重组病毒滴度、复制周期和病毒形态的基础上,显着提高了多目标蛋白的囊膜展示效率和展示稳定性;利用启动子表达时序性,实现了杆状病毒极早期活性启动子p64和非病毒蛋白依赖性启动子pie1介导融合基因的高效表达;利用Invasin、VSVG对病毒囊膜的修饰,进一步提高了重组病毒对非宿主细胞的转导效率。基于上述研究构建出一种新型、多目标蛋白高效共展示的重组杆状病毒,成功应用于BALB/c小鼠,系统性探索了Sw106-Δgp64-ires-V5gp64应用于多蛋白高效共展示、多联疫苗等领域的开发前景,为BDS的发展奠定研究基础。
曹棉富[5]（2019）在《TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制和多基因风险评分的预后价值》文中研究说明胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,预后极差。研究表明,肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）是胶质母细胞瘤微环境中浸润数目最多的免疫细胞,可通过高分泌细胞因子如TGF-β1、PTN等促进胶质母细胞瘤恶性进展。除此之外,TAM还可能与肿瘤细胞发生杂交从而影响肿瘤的多种生物学行为。然而,TAM与胶质母细胞瘤细胞杂交（TAM-GBM细胞杂交）是否存在,以及其在胶质母细胞瘤中的生物学作用及机制尚不清楚。另一方面,胶质母细胞瘤起源于神经胶质细胞或神经胶质前体细胞,其发生发展受多基因的调控。筛选调控胶质母细胞瘤发生发展的关键基因,并建立一个可用于胶质母细胞瘤预后预测的多基因风险评分模型具有十分重要的临床意义。因此,本研究包括以下两部分内容:第一部分肿瘤相关巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制本部分从细胞杂交的角度出发,研究TAM-GBM细胞杂交是否存在,TAM-GBM杂交细胞的转录组特征,以及TAM-GBM细胞杂交对胶质母细胞瘤侵袭的影响及机制。其主要的研究方法、结果及结论如下:1.胶质母细胞瘤中存在TAM-GBM细胞杂交（1）采用流式分析和免疫荧光对胶质母细胞瘤临床样本进行检测,结果显示胶质母细胞瘤临床样本中存在TAM-GBM杂交细胞,比例为1.35%1.96%;杂交细胞同时表达胶质母细胞瘤标记物(GFAP、PDGFRα和IDH1R132H)与巨噬细胞标记物（CD68和CD14）,并且杂交细胞的细胞核数量具有异质性,含13个细胞核不等。（2）采用流式检测、免疫荧光和荧光原位杂交对胶质母细胞瘤原位移植瘤进行分析,结果显示胶质母细胞瘤原位移植瘤中存在TAM-GBM杂交细胞,比例为1.91±0.01%;杂交细胞同时表达胶质母细胞瘤荧光标记RFP与小鼠巨噬细胞标记物CD11b,并且其在性别错配原位移植瘤（雌性来源的胶质母细胞瘤细胞原位注射于雄性C57BL/6小鼠）中的性染色体核型以“XXY”或“XXXY”多倍体为主。（3）采用流式检测、免疫荧光和EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）标记细胞核对TAM-GBM共培养体系进行分析,结果显示共培养体系中存在TAM-GBM杂交细胞,杂交效率与两种细胞共培养比例有关,以胶质母细胞瘤细胞比巨噬细胞的比例为1:4达最佳（相应杂交效率为1.20±0.02%）;杂交细胞共表达胶质母细胞瘤荧光标记RFP和巨噬细胞荧光标记GFP;在EdU标记的巨噬细胞-EdU未标记的胶质母细胞瘤细胞共培养体系中,以及在EdU未标记的巨噬细胞-EdU标记的胶质母细胞瘤细胞共培养体系中,均可检测到同时含1个EdU阳性细胞核和1个EdU阴性细胞核的杂交细胞。2.TAM-GBM杂交细胞的转录组特征采用转录组测序、生物信息学技术、实时荧光定量PCR等研究手段对TAM-GBM杂交细胞的转录组特征进行了分析,结果显示TAM-GBM杂交细胞形成了不同于两种亲本细胞的独特的转录组特征,其含有39个相对于两种亲本细胞均显着上调的基因和39个相对于两种亲本细胞均显着下调的基因;GO（Gene Ontology）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析显示TAM-GBM杂交细胞在趋化因子介导的信号通路、JAK-STAT信号通路等多条通路上呈显着富集。3.TAM-GBM细胞杂交促进胶质母细胞瘤侵袭我们采用了体外Transwell侵袭实验对TAM-GBM杂交细胞和亲本胶质母细胞瘤细胞的侵袭能力进行了比较,结果显示TAM-GBM杂交细胞具有比亲本胶质母细胞瘤细胞更强的体外侵袭能力;通过对胶质母细胞瘤组织切片进行免疫荧光染色,并对比TAM-GBM杂交细胞在胶质母细胞瘤组织侵袭前沿与肿瘤核心区域的分布情况,我们发现相比于肿瘤核心区域,肿瘤侵袭前沿区域具有更多的TAM-GBM杂交细胞,提示TAM-GBM细胞杂交可促进胶质母细胞瘤侵袭。4.TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭机制的初步探讨我们对TAM-GBM杂交细胞和亲本胶质母细胞瘤细胞进行了胶质瘤侵袭相关基因的富集分析,结果显示胶质瘤侵袭相关基因在TAM-GBM杂交细胞中呈显着富集（NES=1.65,p<0.001）（NES,normalized enrichment score）。进一步采用了实时荧光定量PCR和流式检测对基因富集分析的结果进行验证,结果显示相比于亲本胶质母细胞瘤细胞,Hgf、Tmsb4x、St3gal1、Mmp13、Adam8和Cxcr4等侵袭相关基因在TAM-GBM杂交细胞中显着高表达,提示胶质瘤侵袭相关基因可能介导了TAM-GBM细胞杂交的促侵袭作用。第二部分多基因风险评分在胶质母细胞瘤中预后价值本部分从胶质母细胞瘤受多基因调控的角度出发,筛选调控胶质母细胞瘤发生发展的关键基因,并建立可用于胶质母细胞瘤预后预测的多基因风险评分模型。其主要的研究方法、结果及结论如下:1.胶质母细胞瘤差异基因的筛选及多基因风险评分模型的建立（1）我们首先分别对TCGA和GEO数据库中的胶质母细胞瘤数据集进行了差异分析,然后再对来自不同数据集的差异分析结果取交集,结果显示相比于正常脑组织,胶质母细胞瘤含有483个差异显着的上调基因和765个差异显着的下调基因。（2）上述差异基因行单因素和多因素COX回归分析,结果显示,OSMR、HOXC10、SCARA3和SLC39A10的表达水平与胶质母细胞瘤患者预后最为相关,其中差异上调基因OSMR、HOXC10和SCARA3与患者预后呈负相关（hazard ratio>1,p<0.05）,差异下调基因SLC39A10与患者预后呈正相关（hazard ratio<1,p<0.05）。（3）Western blot验证了OSMR、HOXC10和SCARA3在胶质母细胞瘤中高表达,而SLC39A10在胶质母细胞瘤中低表达。（4）基于OSMR、HOXC10、SCARA3和SLC39A10的基因表达水平和多因素COX回归系数,我们建立了胶质母细胞瘤的多基因风险评分模型。2.多基因风险评分在胶质母细胞瘤中的预后价值评估（1）我们采用了Kaplan-Meier曲线和log-rank检验分别在TCGA和GEO胶质母细胞瘤数据集中对多基因风险评分的预后价值进行了评估,结果均显示多基因风险评分对患者生存时间有显着影响,风险评分越高,患者预后越差;进一步行单因素和多因素COX回归分析,结果显示多基因风险评分可作为胶质母细胞瘤患者的独立预后指标。（2）多基因风险评分联合胶质母细胞瘤IDH突变状态或表达谱亚型能更加具体、准确地预测不同亚组胶质母细胞瘤患者的预后:风险评分高且为IDH野生型的胶质母细胞瘤患者预后差,风险评分高且为间质型胶质母细胞瘤的患者预后也差。
许伟凡[6]（2019）在《家蚕核型多角体病毒F-like蛋白的分子特征及功能研究》文中研究说明杆状病毒的典型特征之一是存在两种表型和功能截然不同的病毒粒子,即出芽型病毒粒子（BV）和包涵体衍生型病毒粒子（ODV）,其囊膜来源的不同是它们的主要区别之一。已知的BV囊膜蛋白主要为GP64蛋白和F-蛋白。而在Group INPVs中,F蛋白的膜融合活性被GP64取代,转而通过行使其它的生物学功能被保留了下来,因而被命名为F-like蛋白。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是引起蚕丝业生产危害最严重的主要病原之一,且作为GroupINPV中极具代表性的病毒,其囊膜蛋白F-like（Bm14）的生物学功能却并不清楚。因此,本论文比较系统地研究了 Bm14的分子特征及其在BmNPV病毒生活史中的生物学功能。主要结论如下:1.Bm14的序列特征及其同源物的进化关系。BmNPVbm14基因位于基因组13,586 nt～15,607 nt之间,在其编码序列的上游存在多个保守的启动子元件,包括一个早期元件CAGT及两个晚期元件TAAG,表明bm14可能是一个早晚期基因。氨基酸结构域分析表明,Bm14缺少膜融合蛋白所特有的关键功能域,因而无法直接介导病毒与细胞膜的融合。系统进化分析表明,Bm14的同源物广泛存在于Alpha和Beta属杆状病毒属中,但不同分支间的序列一致性存在较大差异。2.Bm14的表达规律、亚细胞定位及其在病毒粒子中的分布。在病毒感染后6 h便可检测到bm14基因的转录本,但其蛋白信号在感染后24h才出现,并持续表达至96 h,表明bm14虽然是一个早晚期基因,但主要在晚期及极晚期表达。免疫荧光结果显示,Bm14在病毒感染的细胞中呈动态分布,早期出现在细胞核膜,然后逐渐向细胞质扩散,最终分布于细胞质膜。病毒粒子纯化及组分分离实验表明,Bm14是BV和ODV共有的囊膜组分。3.缺失bm14基因对子代病毒形成和多角体的影响。敲除bm14基因导致子代病毒核衣壳无法正常出芽,被束缚在变形的宿主细胞核外膜与核内膜所形成的封闭空间内,从而减缓了感染性BV的形成,同时引起胞内多角体产量的显着降低。此外,通过与多角体囊膜蛋白PE相互作用,Bm14参与调控了多角体的形态发生,其缺失会导致多角体表面粗糙有凹痕,布满孔洞,因而无法正常包埋具有感染力的ODV。4.缺失bm14基因对病毒经口感染和体内传播的影响。Bm14蛋白在被感染的中肠组织中稳定表达。敲除bm14基因减弱了 BmNPV对家蚕幼虫的经口感染毒力,主要表现为幼虫的存活时间延长、致死剂量升高,可能的原因是通过与经口感染因子（PIF-4、PIF-7、PIF-8和Bm91）相互作用进而影响ODV与中肠上皮细胞的吸附和融合。此外,敲除bm14基因不仅降低了血淋巴中感染性BV的产量,而且延缓了病毒在脂肪体、气管及中肠组织的有效传播。进一步分析表明,Bm14是通过与GP64的DomainI相互作用,进而调控GP64所介导的低pH膜融合过程,并最终影响BV病毒在幼虫体内的传播。5.Bm14的互作蛋白筛选。利用酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术,以Bm14的胞质尾结构域作为诱饵,共筛选到10个宿主及病毒互作蛋白,分别为家蚕钙网蛋白、家蚕E3泛素连接酶SINA样蛋白10、家蚕BAG家族分子伴侣调节蛋白2、家蚕磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶以及病毒核衣壳蛋白38K、EXON0、VP39、VP80、VP1054和ODV tegument蛋白GP41。进一步研究表明,Bm14胞质尾结构域的第603位氨基酸至第673位氨基酸是决定Bm14蛋白与上述宿主及病毒蛋白相互作用的关键区域。
连雪[7]（2018）在《马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究》文中认为马立克病（Marek’s Disease,MD）是由马立克病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）引起的鸡恶性T淋巴细胞增生性肿瘤病,是危害世界养禽业的严重传染病之一。目前随着病毒进化,新的超强毒株出现,已造成鸡的免疫失败,因此,新的疫苗和防控策略亟待开发,这离不开对MDV病毒基因功能和致病机理的深入研究。此外,由于MDV与人类疱疹病毒相似的基因组成和生理特性,其可作为研究淋巴瘤发病机制和免疫调控的生物医学模型。综上所述,深入研究MDV致病分子机理,阐明疱疹病毒与细胞信号传导通路的相互作用机理,对MD的防控及人类肿瘤学研究都具有重要意义。本研究基于以上背景,开展了以下5个方面的研究:1.MDV感染引起细胞DNA损伤病原微生物感染可造成机体DNA损伤并激活DNA损伤应答通路（DNA Damage response,DDR）。本研究通过建立 CEF（Chicken embryo fibroblast）细胞的彗星试验,检测细胞内DNA损伤程度。收集Md5和CVI988感染1、2、3和4天的CEF细胞样品,发现MDV感染可引起DNA损伤,并随着感染时间的延长,含有DNA损伤的细胞逐渐增多,损伤程度逐渐加大,说明DNA损伤有可能与病毒复制产生的复制压力有关。通过Western-blot检测DDR的下游标志物p53和p21发现,MDV感染细胞中p53和p21的蛋白表达水平升高,说明MDV感染激活细胞中DDR通路。由此可见,MDV感染造成细胞内DNA损伤并激活DDR通路。2.DNA损伤应答通路对MDV复制的影响病毒感染细胞中DDR通路的激活是机体抵御病原体入侵的机制之一,相反,病毒也可以抑制DDR通路,以消除其对自身繁殖的不利影响。本研究通过使用特异性抑制剂分别阻断ATM、ATR或DNA-PK介导的DDR通路。Western-blot检测发现,当使用VE-821阻断CEF细胞内ATR通路后,MDV的VP22蛋白表达量升高,说明病毒复制增加。相反,使用DNA损伤药物羟基脲（Hydroxyurea,HU）处理细胞,激活细胞内ATR-Chk1通路时,MDV的VP22蛋白表达量下降,说明MDV的复制被显着抑制。进一步的研究发现,MDV感染早期12 h,激活细胞内的ATR-Chk1通路,pChk1水平升高,而感染16至24 h后,病毒感染细胞中pChk1水平低于对照组。当使用DNA损伤药物ETP激活ATR-Chk1通路时,MDV感染可阻断ETP引起的Chk1磷酸化。此外,Western-blot检测STAT3通路发现,MDV感染可激活STAT3磷酸化,且pSTAT3的上升与pChk1的下降存在对应关系。上述研究结果表明,MDV感染通过抑制Chk1的磷酸化,阻碍ATR-Chk1通路下游信号的转导,促进病毒自身的复制,而这一调控机制与STAT3通路的激活存在一定联系。3.MDV激活STAT3调控ATR-Chk1通路STAT3作为一种重要的核转录因子,在多种生理过程中起作用,包括胚胎发育、炎症、免疫、伤口愈合和肿瘤的发生。Western-blot检测Md5和CVI988感染3、6、12、24、48和72 h的CEF细胞样品,发现MDV在感染早期3 h即引起STAT3的705位酪氨酸和727位丝氨酸磷酸化激活,并随着感染时间增加,pSTAT3和STAT3含量逐渐升高。使用抑制剂Stattic阻断细胞内STAT3激活,可导致细胞内pChk1升高,并且在STAT3被抑制的情况下,MDV感染无法抑制Chk1磷酸化。Western-blot和RT-PCR检测Md5和CVI988感染细胞证实,使用抑制剂Stattic预处理CEF细胞后,抑制剂处理组与对照组相比,MDV的病毒蛋白VP22表达量下降、病毒基因VP22和pp38的mRNA水平下降,说明细胞内STAT3通路被抑制,导致MDV无法阻断ATR-Chk1通路,造成病毒复制减少。本研究表明,STAT3是MDV抑制ATR-Chk1通路的关键分子。4.细胞氧化应激反应调控MDV复制活性氧（ROS）会损害脂质,蛋白质和DNA,从而引起各种疾病,如衰老、癌症和退行性神经元疾病等。在致瘤病毒中,氧化应激反应与细胞癌变以及病毒再激活有关。本研究使用活性氧的细胞渗透性指示剂H2DCFDA测定Md5感染细胞中ROS的水平,通过荧光显微镜和流式细胞分析技术,发现Md5感染1 d后,实验组细胞与对照组相比ROS增加,随着感染天数增加,ROS在MDV感染细胞中逐渐积累。已有研究表明ROS作为信号分子,可提高细胞内NADPH氧化酶活性,从而激活JAK/STAT3通路。因此本研究使用NADPH氧化酶抑制剂 Apocynin（APO）和 Diphenyleneiodonium（DPI）处理 CEF 细胞,Western-blot检测Md5的复制发现,使用NADPH氧化酶抑制剂APO和DPI处理细胞,可抑制细胞内STAT3通路,使pChk1水平升高,MDV复制减少。RT-PCR检测也证实,抑制剂APO和DPI处理组中病毒基因VP22和pp38的mRNA水平低于对照组。上述研究结果表明,MDV感染可引起细胞内ROS积累,通过氧化应激反应,提高NADPH氧化酶活性,从而激活STAT3通路,导致ATR-Chk1通路的抑制,促进病毒增殖。而打破细胞氧化还原平衡,抑制NADPH氧化酶活性,病毒复制减少,这一发现证明ROS-STAT3在MDV感染中起到重要作用。5.丹顶鹤马立克病临床病例的分子生物学诊断MDV可以感染鸡形目、鸮形目、雁形目和隼形目。通过对南京红山动物园的丹顶鹤进行剖检和组织病理切片检查发现,发病丹顶鹤全身布满肿瘤结节,心脏和肝脏切片显示组织中存在大、中、小三型多形型淋巴样细胞,为肿瘤细胞典型特征。利用分子生物学诊断技术鉴定丹顶鹤组织样品,分别通过RT-PCR和PCR方法在两只疑似感染MDV鹤的羽毛、肝脏、肾脏,肌肉和脾脏等组织的cDNA和基因组中均检测到MDV基因Meq和gB的基因片段。从鹤的脾脏和肝脏组织中扩增获得Meq、VP22和L-Meq全长基因,测序后对其蛋白质序列进行同源性比对和进化树分析,证实丹顶鹤中发现的MDV为血清1型强毒株,说明MDV可感染鹤形目并导致肿瘤发生。虽然动物园中人工饲养的丹顶鹤可考虑通过疫苗接种,预防MDV感染,但是野生鹤群无法接种疫苗,一旦感染MDV,可能对这一濒危种群产生巨大影响,而其迁徙特性,也会造成MDV扩散的风险。
戴杰雨,姜永华,张玉洁,王豪杰,刘潇然,刘翠华,任小林[8]（2018）在《苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备》文中指出HD-Zip转录因子在植物生长发育过程中具有重要作用,蛋白水平的研究有助于进一步阐释其功能。将苹果转录因子基因Md HB1分别连接到p GEX-6p-1和p ET-28a（+）表达载体,热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,随后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导培养,分别得到了带有GST和6×His标签的Md HB1融合蛋白（分别命名为Md HB1-GST和Md HB1-His6）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,在18、28℃和37℃3个温度诱导条件下都是沉淀中Md HB1-GST融合蛋白的量较多,37℃尤为明显,较低的诱导温度（18℃和28℃）能够提高融合蛋白Md HB1-GST可溶性形式存在的比例;28℃条件下50 mg/L IPTG诱导的总蛋白量在8 h左右达到最大,且受IPTG质量浓度（10、50、100 mg/L）的影响不大。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白Md HB1-His6为抗原,成年兔免疫以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。蛋白质免疫印迹实验结果说明,所制备多克隆抗体特异性良好,能够从菌体和苹果幼叶总蛋白中成功检测Md HB1蛋白。综上所述,本实验所得多克隆抗体能够用于深入研究Md HB1在植物体内的功能。
朱雯娴[9]（2017）在《NDV介导IL-1β的产生依赖NLRP3炎症小体激活的研究》文中提出新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的主要以禽类呼吸道和消化道渗出性炎症反应为主要特征的高度接触性传染病。NLRP3炎症小体介导着caspase-1的活化以及IL-1β的成熟和分泌,在病毒诱导产生的炎症反应中起着关键的免疫调节作用,但是目前关于鸡NLRP3炎症小体的功能研究鲜有报道,鸡NLRP3炎症小体在NDV引起的炎症反应中的功能值得探究。本研究主要内容如下:1.鸡源NLRP3炎症小体研究体系的建立本研究首先建立了鸡源NLRP3炎症小体的研究体系。本研究使用大肠杆菌原核表达系统表达caspase-1和IL-1β两种目的蛋白,然后通过切蛋白胶胶回收的办法,进行重组蛋白的纯化,免疫新西兰兔后制备的多克隆抗体经Western-Blot鉴定具有良好的特异性,在1:500稀释度下多克隆抗体能够检测出相应蛋白,证明能够用于鸡源NLRP3炎症小体的研究,建立了NDV激活鸡NLRP3炎症小体的研究体系,为后续的研究奠定了基础。2.NDV感染SPF鸡后NLRP3炎症小体及相关分子的表达本研究首先选取本实验室利用反向遗传系统筛选的强、弱NDV毒株rGM株和IGM株感染SPF鸡,通过qPCR对NDV在体内的复制、促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的转录以及NLRP3炎症小体的表达进行分析。结果表明NDV在不同组织中的表达情况与NLRP3炎症小体、IL-1β和IL-18是一致的,具体为rGM组在肺脏、脑和法氏囊中IL-1β、IL-18和NLRP3炎症小体的表达均显着上调,与对照组差异极显着;而在胸腺和脾脏中表达水平均较低。IGM组在肺脏和脑中IL-1β、IL-18和NLRP3炎症小体的表达显示极显着上调,而在法氏囊、胸腺和脾脏中表达水平均较低。3.NDV感染DF-1细胞后NLRP3炎症小体及相关分子的表达本研究为验证NLRP3炎症小体与NDV炎症的关系,运用qPCR方法检测了NDV rGM株感染DF-1后NLRP3炎症小体、IL-1β、IL-18的表达变化。结果显示rGM组感染后IL-1β、IL-18和caspase-1表达显着上调,NLRP3基因上调表达为1.8倍;NDV rGM感染DF-1后可检测到NLRP3的蛋白表达,且表达具有剂量依赖性。使用si-RNA-NLRP3处理细胞后,显着下调caspase-1和IL-1β的转录表达。NLRP3过表达后IL-1β的转录表达显着上调。4.NLRP3炎症小体调控NDV感染引起炎症反应的信号通路初步探索本研究为完善NLRP3炎症小体介导NDV产生的炎症反应的调控机制,对与诱导IL-1β表达相关的S1RP1和NF-κB信号通路进行研究。本研究利用siRNA-NLRP3处理DF-1细胞后用NDV rGM株感染,检测结果显示S1PR1以及P65 mRNA表达水平无显着差异。用S1PR1抑制剂W146处理后用NDV强毒rGM株感染,检测结果显示NLRP3以及P65 mRNA表达水平显着降低。过表达S1PR1处理后用NDV强毒rGM株感染,检测结果显示NLRP3以及P65 m RNA表达水平有明显升高。用si-RNA-P65处理后用NDV强毒rGM株感染,检测结果显示S1PR1的mRNA表达水平无显着差异,然而NLRP3的mRNA表达水平却显示的是明显的降低。因此,初步探索结果表明NDV强毒rGM株感染DF-1细胞后均能激活S1PR1、NF-κB和NLRP3信号通路,且NLRP3炎症小体的调控依赖于NF-κB及S1PR1信号通路。5.NDV诱导的鸡骨髓源树突状细胞（DCs）的炎症反应本研究建立了NDV感染鸡DCs的模型。通过接种NDV rGM株和IGM株,检测鸡DCs上NDV的复制和NLRP3、S1PR1以及P65的转录表达。结果显示NDV在DCs中的增殖情况与其在DF-1细胞中相似,但是NDV感染DCs后S1PR1、NLRP3和P65的转录表达却与DF-1中不同。本研究主要发现了NDV感染禽类后能通过激活NLRP3炎症小体从而促进IL-1β的产生,且可能依赖于NF-κB及S1PR1信号通路的调控。丰富了关于NDV致病机制的研究,为ND的防控以及ND的药物设计提供科学的理论基础。
戴杰雨[10]（2017）在《苹果转录因子MdHB1在GA合成过程中的功能初探》文中指出转录因子在植物生长发育的各个阶段都发挥着重要的作用,并参与多种激素的信号转导。苹果MdHB1是HD-Zip转录因子家族的一员。本试验以课题组前期得到的MdHB1过表达烟草‘NC89’植株和病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）处理的‘澳洲青萍’（Granny Smith）果实为试验材料,从转录水平和激素水平上研究了MdHB1对于赤霉素合成代谢的影响;在这过程中,我们在大肠杆菌中原核表达得到了MdHB1的融合蛋白,以此为抗原通过新西兰兔的免疫制备了MdHB1的多克隆抗体。试验结果如下:（1）将实验室前期克隆的MdHB1基因分别连接到pGEX-6p-1和pET-28a（+）两个表达载体上,转化大肠杆菌感受态BL21（DE3）,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下,表达得到了带有GST和6×His标签的融合蛋白（分别命名为MdHB1-GST和MdHB1-His6）。Ni-NTA纯化的融合蛋白MdHB1-His6为抗原经成年兔免疫以制备多克隆抗体;经间距酶联免疫法（ELASA）检测,所得抗体效价较高;蛋白质免疫印迹试验（Western blot）说明所制备多克隆抗体不仅能从菌体总蛋白中特异性识别MdHB1,也能从苹果幼叶总蛋白中成功检测MdHB1蛋白;表明本实验所得多克隆抗体能够用于进一步的蛋白研究,深入挖掘MdHB1在植物体内的功能。（2）Western blot试验说明,赤霉素合成抑制剂多效唑（Paclobutrazol,PAC）处理的‘澳洲青萍’果皮中MdHB1含量显着上升,其对于赤霉素（GA）处理可能是负响应。MdHB1过表达烟草叶片中,NtGA20ox1、NtGA2ox1表达量下调,NtGA3ox1上调,且都达到了显着水平;病毒诱导MdHB1基因沉默后,苹果果肉中MdGA3ox的转录水平显着上升,高效液相色谱（HPLC）测定的GA3含量也显着高于对照组。综合以上结果,推测MdHB1参与了赤霉素的信号转导。
二、转录因子hB1F的融合表达及抗体制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转录因子hB1F的融合表达及抗体制备（论文提纲范文）
（1）鸡细胞表面受体Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 病毒受体 |
| 1.2 副黏病毒及其主要受体研究进展 |
| 1.3 NDV主要受体研究进展 |
| 1.4 SLAMF1在副黏病毒中的研究进展 |
| 1.5 Nectin4在副黏病毒中的研究进展 |
| 第2章 NDV感染宿主细胞依赖唾液酸以外的受体初探 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株和病毒 |
| 2.1.2 酶和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的扩增 |
| 2.2.2 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.2.3 CEF的制备 |
| 2.2.4 唾液酸药物消化细胞 |
| 2.2.5 NDV吸附 |
| 2.2.6 RNA的提取和反转录 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 唾液酸酶处理禽类细胞后对NDV吸附作用的影响 |
| 2.3.2 唾液酸酶处理哺乳动物细胞后对NDV吸附作用的影响 |
| 2.4 分析讨论 |
| 第3章 Nectin4和SLAMF1在鸡细胞、组织中的分布研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体、细胞株、实验动物和病毒 |
| 3.1.2 酶和试剂 |
| 3.1.3 培养基和溶液 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 RNA的提取和反转录 |
| 3.2.3 Nectin4和SLAMF1基因的克隆 |
| 3.2.4 鸡Nectin4和鸡SLAMF1的原核表达 |
| 3.2.5 鸡Nectin4和SLAMF1多抗的制备 |
| 3.2.6 Western Blotting检测多抗效价 |
| 3.2.7 标准曲线的建立 |
| 3.2.8 禽类细胞中Nectin4、SLAMF1的分布检测 |
| 3.2.9 NDV感染细胞后Nectin4、SLAMF1的变化 |
| 3.2.10 商品鸡体内组织Nectin4、SLAMF1的分布检测 |
| 3.2.11 鸡Nectin4和SLAMF1在感染鸡体内的变化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Nectin4和SLAMF1基因的克隆 |
| 3.3.2 鸡Nectin4和SLAMF1的原核表达 |
| 3.3.3 鸡Nectin4和SLAMF1多抗的Western Blotting效价 |
| 3.3.4 标准曲线的建立 |
| 3.3.5 不同禽类细胞中Nectin4和SLAMF1的分布 |
| 3.3.6 NDV感染细胞后Nectin4、SLAMF1的变化 |
| 3.3.7 商品鸡体内组织Nectin4、SLAMF1的分布检测 |
| 3.3.8 NDV感染鸡的组织病变 |
| 3.3.9 健康SPF鸡组织中Nectin4、SLAMF1的mRNA分布 |
| 3.3.10 感染鸡组织中Nectin4和SLAMF1转录水平的变化 |
| 3.3.11 感染鸡组织中Nectin4和SLAMF1蛋白水平的变化 |
| 3.4 分析讨论 |
| 第4章 鸡Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 载体和细胞株 |
| 4.1.2 酶和试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 pcDNA3.1-Nectin4、pcDNA3.1-SLAMF1的合成与表达 |
| 4.2.2 pCMV6-Nectin4-FLAG、pCMV6-SLAMF1-FLAG的构建与表达 |
| 4.2.3 pCMV-HA-Nectin4、pCMV-HA-SLAMF1的构建与表达 |
| 4.2.4 鸡Nectin4和SLAMF1的外源性表达对NDV感染的影响 |
| 4.2.5 敲低Nectin4、SLAMF1基因对NDV感染的影响 |
| 4.2.6 Nectin4、SLAMF1原核表达产物对NDV-HN的遮蔽作用 |
| 4.2.7 Nectin4、SLAMF1蛋白与NDV的内源性相互作用 |
| 4.2.8 Nectin4、SLAMF1蛋白与NDV-HN蛋白的相互作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 pcDNA3.1-Nectin4、pcDNA3.1-SLAMF1的表达 |
| 4.3.2 pCMV6-Nectin4-FLAG、pCMV6-SLAMF1-FLAG的表达 |
| 4.3.3 pCMV-HA-Nectin4、pCMV-HA-SLAMF1的表达 |
| 4.3.4 鸡Nectin4和SLAMF1的外源性表达对NDV感染的影响 |
| 4.3.5 敲低Nectin4、SLAMF1基因对NDV感染的影响 |
| 4.3.6 Nectin4、SLAMF1原核表达产物对NDV的遮蔽作用 |
| 4.3.7 Nectin4蛋白和SLAMF1蛋白与NDV的内源性相互作用 |
| 4.3.8 Nectin4蛋白和SLAMF1蛋白与NDV-HN蛋白的相互作用 |
| 4.4 分析讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 BPIV3 病原学 |
| 1.1.1 BPIV3 分类地位与分型 |
| 1.1.2 BPIV3 生物学及理化特性 |
| 1.1.3 BPIV3 基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.2 BPIV3 流行病学 |
| 1.3 BPIV3 诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.2 RT-PCR |
| 1.3.3 荧光定量PCR技术 |
| 1.3.4 血凝与血凝抑制试验 |
| 1.3.5 病毒中和试验 |
| 1.3.6 免疫荧光与免疫组化试验 |
| 1.3.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4 BPIV3 的防控 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 BPIV3 N蛋白的原核表达与纯化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验毒株,细胞及载体 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 抗原优势区域的筛选 |
| 2.2 目的基因的克隆 |
| 2.2.1 引物合成 |
| 2.2.2 BPIV3 RNA提取及c DNA的合成 |
| 2.2.3 N基因扩增 |
| 2.2.4 原核表达载体pET-32a-N的构建 |
| 2.3 N蛋白的诱导表达 |
| 2.4 N蛋白可溶性分析 |
| 2.5 N蛋白的纯化 |
| 2.6 N蛋白的鉴定及浓度的测定 |
| 2.6.1 N蛋白的鉴定 |
| 2.6.2 N蛋白浓度的测定 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗原表位优势区的筛选 |
| 3.2 N基因的PCR扩增 |
| 3.3 表达载体pET-32a-N的构建及鉴定 |
| 3.4 N蛋白的诱导表达 |
| 3.5 N蛋白的可溶性分析 |
| 3.6 N蛋白纯化结果 |
| 3.7 N蛋白的鉴定及浓度的测定 |
| 3.7.1 N蛋白的鉴定 |
| 3.7.2 N蛋白浓度的测定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 多克隆抗体的制备与检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验耗材 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2 N蛋白多克隆抗体的Western Blotting检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MDBK细胞及BPIV3 感染细胞 |
| 3.2 多克隆抗体的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第四章 间接ELISA方法反应条件的优化与建立 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验耗材 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 间接ELISA检测方法反应条件的优化 |
| 2.1.1 间接ELISA反应的基本步骤 |
| 2.1.2 间接ELISA反应条件的优化 |
| 2.1.3 间接ELISA判定标准的确立 |
| 2.1.4 特异性试验 |
| 2.1.5 敏感性试验 |
| 2.1.6 板内和板间重复性试验 |
| 2.1.7 符合率试验 |
| 2.2 临床样品检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 间接ELISA检测方法的优化 |
| 3.1.1 包被抗原稀释浓度的确定 |
| 3.1.2 最佳封闭液及封闭时间的选择 |
| 3.1.3 最佳一抗与二抗浓度的确定 |
| 3.1.4 最佳显色时间的选择 |
| 3.1.5 BPIV3 间接ELISA判定标准 |
| 3.1.6 特异性试验 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 重复性试验 |
| 3.1.9 符合率试验 |
| 3.2 临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 斑点叉尾鮰养殖概况 |
| 2 鮰爱德华氏菌研究进展 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 宿主种类和范围 |
| 2.3 相关毒力因子研究 |
| 2.5 鮰爱德华氏菌外膜蛋白的研究 |
| 2.6 鮰爱德华氏菌的疫苗研究 |
| 3 鲁氏耶尔森氏菌研究进展 |
| 3.1 生物学特性 |
| 3.2 宿主种类和范围 |
| 3.3 相关毒力因子研究 |
| 3.4 鲁氏耶尔森氏菌外膜蛋白研究 |
| 3.5 鲁氏耶尔森氏菌疫苗研究 |
| 4 渔用疫苗研究进展 |
| 4.1 渔用疫苗的发展历程 |
| 4.2 渔用疫苗的种类 |
| 4.3 渔用疫苗的免疫方式 |
| 5 渔用口服疫苗载体研究 |
| 5.1 微囊和微球载体 |
| 5.2 减毒细菌载体 |
| 5.3 生物被膜载体 |
| 5.4 生物载体疫苗 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 鮰爱德华氏菌OmpN2 与鲁氏耶尔森氏菌OmpF基因的分子克隆与生物信息学分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 核苷酸序列特征分析 |
| 2.6 氨基酸序列特征分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的扩增和T克隆鉴定 |
| 3.2 核苷酸序列特征分析 |
| 3.3 氨基酸序列特征分析 |
| 3.4 OmpN2和OmpF核苷酸和氨基酸序列相似性比对 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 OmpN2与OmpF的原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 菌株培养、DNA提取与PCR扩增 |
| 2.3 重组克隆质粒的构建 |
| 2.4 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.5 重组表达质粒的构建 |
| 2.6 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.7 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.8 重组蛋白的大量制备及纯化 |
| 2.9 兔抗重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.10 Western blotting分析 |
| 2.11 目的蛋白在细菌表面分布验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组蛋白rtOmpN2和rtOmpF的表达及纯化 |
| 3.3 重组蛋白的免疫原性分析 |
| 3.4 目的蛋白在细菌表面的分布 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 二联融合基因N2-F的构建,分子克隆,原核表达与免疫原性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 Linker序列选择与引物设计 |
| 2.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒P-N2-linker-F的构建与鉴定 |
| 2.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 2.6 兔抗融合蛋白N2-F多克隆抗体的制备与纯化 |
| 2.7 融合蛋白N2-F免疫原性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 N2-linker与 linker-F的 PCR扩增 |
| 3.2 重组克隆质粒T-N2-linker和 T-linlker-F的构建与鉴定 |
| 3.3 重组表达质粒P-N2-linker的构建与鉴定 |
| 3.4 重组表达质粒P-N2-Linker-F的构建与鉴定 |
| 3.5 融合蛋白N2-F的诱导表达及纯化 |
| 3.6 融合蛋白N2-F的免疫原性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 二联基因N2-F亚单位疫苗对斑点叉尾鮰免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 细菌复壮 |
| 2.2 亚单位疫苗制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 收集血清 |
| 2.5 血清免疫相关指标检测 |
| 2.6 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.7 免疫相关基因表达分析 |
| 2.8 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清抗体水平检测 |
| 3.2 血清溶菌酶活性检测 |
| 3.3 血清补体C3 活性检测 |
| 3.4 血清总蛋白含量检测 |
| 3.5 血清SOD活性检测 |
| 3.6 免疫相关基因表达分析 |
| 3.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 二联基因口服微球疫苗的制备、条件优化及理化特性分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 蛋白与主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 海藻酸钠-壳聚糖复合微球制备流程 |
| 2.2 包封率和载药率测定 |
| 2.3 单因素试验 |
| 2.4 响应面试验 |
| 2.5 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 2.6 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 2.7 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 单因素试验 |
| 3.2 响应面试验结果 |
| 3.3 响应面分析及结果验证 |
| 3.4 口服微球疫苗的理化特性分析 |
| 3.5 口服微球疫苗的抗原性检测 |
| 3.6 口服微球疫苗的安全性检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第七章 二联基因口服疫苗对斑点叉尾鮰的免疫效果分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 疫苗、菌株与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 口服微球疫苗制备 |
| 2.2 口服疫苗饲料制备 |
| 2.3 免疫程序 |
| 2.4 血清和肠粘液采集 |
| 2.5 肠黏液免疫相关指标检测 |
| 2.6 血清免疫相关指标检测 |
| 2.7 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 2.8 免疫相关基因表达分析 |
| 2.9 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肠黏液免疫指标 |
| 3.2 血清免疫相关指标 |
| 3.3 免疫相关基因表达分析 |
| 3.4 攻毒试验及相对保护率检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）MultiBac高效展示系统构建及其应用于多联疫苗的模型研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1.2 囊膜蛋白和杆状病毒 |
| 1.1.1.3 杆状病毒复制周期 |
| 1.1.2 杆状病毒载体系统 |
| 1.1.2.1 杆状病毒载体系统概述 |
| 1.1.2.2 DNA线性化应用于杆状病毒载体系统 |
| 1.1.2.3 体外酶促反应应用于杆状病毒载体系统 |
| 1.1.2.4 细菌转座子应用于杆状病毒载体系统 |
| 1.1.3 膜融合与多基因共展示 |
| 1.1.3.1 展示系统概述 |
| 1.1.3.2 杆状病毒囊膜融合展示技术 |
| 1.1.3.3 杆状病毒多基因共展示原理 |
| 1.1.4 杆状病毒多基因共展示的应用前景 |
| 1.1.4.1 应用于基因治疗载体的研究 |
| 1.1.4.2 应用于动物疫苗载体的研究 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第二章 基于ires依赖的杆状病毒GP64 低表达型Bacmid的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 基因、质粒、菌株及细胞 |
| 2.2.1.2 试剂、酶类、试剂盒及抗体 |
| 2.2.1.3 相关溶液配方 |
| 2.2.1.4 培养基配方 |
| 2.2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 基因工程操作 |
| 2.2.2.2 昆虫细胞操作 |
| 2.2.2.3 PCR引物设计 |
| 2.2.2.4 化学转化与重组子筛选 |
| 2.2.2.5 Red-gam同源重组与重组子筛选 |
| 2.2.2.6 Tn7转座与重组子筛选 |
| 2.2.2.7 重组杆状病毒的构建及传代 |
| 2.2.2.8 重组杆状病毒的滴度测定 |
| 2.2.2.9 SDS-PAGE与 Western Blot |
| 2.2.2.10 昆虫细胞内荧光素酶表达量的测定 |
| 2.2.2.11 杆状病毒的浓缩与纯化 |
| 2.2.2.12 透射电镜对杆状病毒的观测 |
| 2.2.3 gp64基因同源重组片段的构建 |
| 2.2.4 gp64 基因缺失型Bacmid的构建 |
| 2.2.5 gp64基因缺失型杆状病毒的构建 |
| 2.2.6 ires介导荧光素酶表达的载体构建 |
| 2.2.7 ires介导荧光素酶表达的重组杆状病毒构建 |
| 2.2.8 ires-V5gp64 依赖的重组杆状病毒构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 E.coli Sw106 电转化条件的分析 |
| 2.3.2 Red- gam重组基因gp64F-Zeocin~R-gp64R的鉴定 |
| 2.3.3 Sw106-Δgp64的鉴定 |
| 2.3.4 AcBV-Δgp64 的鉴定及其复制循环周期检测 |
| 2.3.5 ires介导荧光素酶表达的重组病毒鉴定与病毒滴度检测 |
| 2.3.6 ires介导荧光素酶在sf9 细胞表达的Western Blot与表达量分析 |
| 2.3.7 AcBV-Δgp64-ires-V5gp64 的电镜检测与复制循环周期测定 |
| 2.3.8 AcBV-Δgp64-ires-V5gp64 介导GP64 表达的Western Blot |
| 2.3.9 ires依赖的GP64 低量组装对病毒滴度影响的测定 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 基于AcBV-Δgp64-ires-V5gp64 展示效率和稳定性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 基因、质粒、菌株及细胞 |
| 3.2.1.2 试剂、酶类、试剂盒及抗体 |
| 3.2.1.3 相关溶液、细胞培养基配方 |
| 3.2.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 基因工程和细胞工程的操作方法 |
| 3.2.2.2 PCR引物设计 |
| 3.2.2.3 化学转化、Tn7转座与重组子筛选 |
| 3.2.2.4 Cre-loxP特异性转座与重组子筛选 |
| 3.2.2.5 重组杆状病毒的传代、浓缩和纯化 |
| 3.2.2.6 昆虫细胞膜表面荧光素酶含量的测定 |
| 3.2.3 单基因融合的转移载体构建 |
| 3.2.4 单目标蛋白融合展示的重组杆状病毒构建 |
| 3.2.5 单目标蛋白融合展示的重组杆状病毒滴度测定 |
| 3.2.6 单目标蛋白融合表达的Western Blot |
| 3.2.7 目标蛋白的囊膜展示效率测定 |
| 3.2.8 多基因融合的转移载体构建 |
| 3.2.9 多蛋白融合共展示的重组病毒构建及滴度测定 |
| 3.2.10 LSCM对荧光蛋白融合共展示的亚细胞定位 |
| 3.2.11 融合蛋白囊膜展示的Western Blot |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 rSw106-Δgp64-R64-F-G-Igp64 的鉴定 |
| 3.3.2 AcBV-Δgp64-R64-F-G-Igp64 的鉴定及病毒滴度检测 |
| 3.3.3 荧光素酶蛋白共表达的Western Blot |
| 3.3.4 荧光素酶的囊膜展示效率的测定 |
| 3.3.5 rSw106-Δgp64-G64-M64-Y64-Igp64 的鉴定 |
| 3.3.6 AcBV-Δgp64-G64-M64-Y64-Igp64 的电镜检测及病毒滴度测定 |
| 3.3.7 多目标蛋白融合共展示效果的LSCM检测 |
| 3.3.8 多目标蛋白融合共展示的Western Blot |
| 3.4 小结 |
| 第四章 BDS高效表达启动子的筛选及提高哺乳动物转导效率的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 基因、质粒、菌株及细胞 |
| 4.2.1.2 试剂、酶类、试剂盒及抗体 |
| 4.2.1.3 相关溶液、培养基等配方 |
| 4.2.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 哺乳动物细胞293T、BHK-21的操作 |
| 4.2.2.2 PCR引物设计 |
| 4.2.2.3 转化、转座与重组子筛选 |
| 4.2.2.4 重组杆状病毒的构建、传代和浓缩 |
| 4.2.3 基于启动子表达时序性测定的中间载体构建 |
| 4.2.4 基于启动子表达时序性测定的杆状病毒构建 |
| 4.2.5 启动子时序性介导荧光素酶在昆虫细胞共表达的Western Blot |
| 4.2.6 启动子时序性在BHK-21和293T细胞介导荧光素酶表达量的测定 |
| 4.2.7 VSV病毒基因组RNA的提取与检测 |
| 4.2.8 Invasin和 VSVG介导囊膜修饰的转移载体构建 |
| 4.2.9 Invasin和 VSVG介导囊膜修饰的重组杆状病毒构建 |
| 4.2.10 Invasin和 VSVG囊膜展示的Western Blot |
| 4.2.11 重组病毒转导293T和BHK-21的流式细胞仪检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 rSw106-Δgp64-p X-F-R-G-Igp64 的鉴定 |
| 4.3.2 重组病毒Ac BV-Δgp64-pX-F-R-G-Igp64 的鉴定及病毒滴度检测 |
| 4.3.3 启动子介导荧光素酶在sf9 细胞表达的Western Blot |
| 4.3.4 启动子在sf9细胞的表达时序性分析 |
| 4.3.5 pcmv、psv40和pie1在293T和BHK-21 细胞的表达时序性分析 |
| 4.3.6 rSw106-Δgp64-G-Igp64-Inv64和rSw106-Δgp64-G-Igp64-VSVG的鉴定 |
| 4.3.7 Invasin或 VSVG囊膜修饰的重组杆状病毒鉴定和病毒滴度检测 |
| 4.3.8 Invasin或 VSVG在杆状病毒囊膜展示的Western Blot |
| 4.3.9 基于Invasin或VSVG囊膜展示的重组病毒转导BHK-21和293T的效率测定 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基于BALB/c小鼠的Sw106-Δgp64-ires-V5gp64 系统诱导特异性免疫提升的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.1.1 基因、质粒和菌株 |
| 5.2.1.2 毒种、细胞及实验动物 |
| 5.2.1.3 试剂、酶类、抗体及试剂盒 |
| 5.2.1.4 相关溶液、培养基等配方 |
| 5.2.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 PCR引物设计 |
| 5.2.2.2 转化、转座与重组子筛选 |
| 5.2.2.3 重组杆状病毒的构建、传代、纯化和浓缩 |
| 5.2.2.4 实验动物福利伦理声明 |
| 5.2.2.5 PCV2 病毒基因组DNA的提取与检测 |
| 5.2.2.6 PRRSV、CSFV病毒基因组RNA的提取与检测 |
| 5.2.2.7 多抗原蛋白融合共展示的转移载体构建 |
| 5.2.2.8 多抗原蛋白融合共展示的重组杆状病毒构建 |
| 5.2.2.9 多抗原融合蛋白囊膜展示的Western Blot |
| 5.2.2.10 多抗原融合展示的重组杆状病毒免疫原制备 |
| 5.2.2.11 重组杆状病毒多抗原融合共展示的效率测定 |
| 5.2.2.12 BALB/c小鼠的免疫接种与血清采集 |
| 5.2.2.13 血清特异性抗体的ELISA检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 融合四种抗原基因的转移载体构建 |
| 5.3.2 rSw106-Δgp64-E64-G64-I64-P64-G-M-Igp64 的鉴定 |
| 5.3.3 AcBV-Δgp64-E64-G64-I64-P64-G-M-Igp64 的构建及电镜检测 |
| 5.3.4 AcBV-Δgp64-E64-G64-I64-P64-G-M-Igp64 的滴度测定 |
| 5.3.5 多抗原蛋白囊膜融合的Western Blot |
| 5.3.6 多抗原蛋白囊膜展示效率的测定 |
| 5.3.7 AcBV-Δgp64-E64-G64-I64-P64-G-M-Igp64 对小鼠特异性免疫提升力的测定 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文讨论与结论 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 进一步提高展示效率的杆状病毒载体系统 |
| 6.1.2 基于重组杆状病毒囊膜展示效率测定的初探 |
| 6.1.3 目标蛋白展示融合的结构预测与活性分析 |
| 6.1.4 重组病毒转导哺乳动物细胞及介导基因表达能力的分析 |
| 6.1.5 杆状病毒及应用于囊膜展示系统的展望 |
| 6.2 全文总结 |
| 6.3 论文创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间论文发表情况 |
| 博士期间专利授权情况 |
（5）TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制和多基因风险评分的预后价值（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一部分 肿瘤相关巨噬细胞与胶质母细胞瘤细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 TAM-GBM细胞杂交的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 TAM-GBM杂交细胞的转录组特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 TAM-GBM细胞杂交对胶质母细胞瘤侵袭的影响及机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第二部分 多基因风险评分在胶质母细胞瘤中的预后价值 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 胶质母细胞瘤多基因风险评分模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 多基因风险评分在胶质母细胞瘤中的预后价值评估 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细胞杂交在肿瘤发生发展中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）家蚕核型多角体病毒F-like蛋白的分子特征及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1.1 杆状病毒分类 |
| 1.1.1.2 杆状病毒生活史 |
| 1.1.2 杆状病毒功能基因组学 |
| 1.1.2.1 BV的主要囊膜蛋白 |
| 1.1.2.2 经口感染因子 |
| 1.1.2.3 BV和ODV共有的囊膜蛋白 |
| 1.2 本研究的目的与科学意义 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 家蚕核型多角体病毒bm14基因的序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 BmNPV bm14基因序列 |
| 2.1.2 软件及分析方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 BmNPV bm14阅读框分析 |
| 2.2.1.1 bm14在基因组中的位置 |
| 2.2.1.2 bm14阅读框的序列分析 |
| 2.2.2 BmNPV Bm14蛋白特征分析 |
| 2.2.2.1 氨基酸序列特征分析 |
| 2.2.2.2 蛋白质疏水性分析 |
| 2.2.2.3 信号肽及跨膜结构域的预测分析 |
| 2.2.2.4 二级结构及三级结构的预测分析 |
| 2.2.2.5 亚细胞定位预测分析 |
| 2.2.2.6 系统进化和同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Bm14缺失型以及bm14补回型重组病毒的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 bm14缺失型bacmid(vBm~(bm14KO))的构建 |
| 3.1.2.1 同源重组线性打靶片段的制备 |
| 3.1.2.2 BW25113感受态细胞的制备 |
| 3.1.2.3 电击转化 |
| 3.1.2.4 Bacmid DNA的提取 |
| 3.1.3 具有绿色荧光蛋白基因(egfp)和多角体蛋白基因(polh)双标或多角体蛋白基因(polh)单标的野生型、bm14缺失型以及bm14补回型重组病毒的构建 |
| 3.1.3.1 vBmWT~(PH-EGFP)重组病毒的构建 |
| 3.1.3.2 vBm~(bm14KO-PH-EGFP)重组病毒的构建 |
| 3.1.3.3 vBm~(bm14Flag-REP-PH-EGFP)重组病毒的构建 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 vBm~(bm14KO)的构建与鉴定 |
| 3.2.2 野生型、bm14缺失型以及bm14补回型重组病毒的构建与鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Bm14的表达规律、亚细胞定位及其在病毒粒子中的分布 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 重组病毒Bacmid DNA对昆虫细胞的转染 |
| 4.1.3 BV上清的收集及其滴度的测定 |
| 4.1.4 重组病毒上清对昆虫细胞的感染及细胞样品的收集 |
| 4.1.5 细胞总RNA的提取 |
| 4.1.6 qRT-PCR |
| 4.1.7 Bm14多克隆抗体的制备 |
| 4.1.8 激光共聚焦观察重组病毒感染的细胞 |
| 4.1.9 虫体来源多角体的分离纯化 |
| 4.1.10 ODV的分离纯化 |
| 4.1.11 BV的分离纯化 |
| 4.1.12 病毒粒子核衣壳和囊膜的分离 |
| 4.1.13 免疫电镜 |
| 4.1.14 蛋白免疫印迹 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Bm14基因的转录时相及其蛋白表达 |
| 4.2.2 Bm14蛋白在病毒感染细胞中的定位 |
| 4.2.3 Bm14蛋白在病毒粒子组分中的定位 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 Bm14基因缺失对子代病毒形成和多角体的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 病毒生长曲线分析 |
| 5.1.3 病毒基因组复制分析 |
| 5.1.4 重组病毒转染细胞的透射电镜观察 |
| 5.1.5 多角体产量分析 |
| 5.1.6 多角体基因的转录及其蛋白表达分析 |
| 5.1.7 细胞来源多角体的分离纯化 |
| 5.1.8 多角体的形态分析 |
| 5.1.9 ODV包埋进多角体分析 |
| 5.1.10 多角体中DNA的提取 |
| 5.1.11 ODV体外感染分析 |
| 5.1.12 病毒蛋白的表达 |
| 5.1.13 免疫共沉淀实验 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 显微镜观察重组病毒转染的细胞 |
| 5.2.2 重组病毒BV生长曲线的测定 |
| 5.2.3 Bm14基因缺失对病毒基因组DNA复制水平的影响 |
| 5.2.4 重组病毒转染细胞的透射电镜观察 |
| 5.2.5 Bm14基因缺失对多角体基因转录、蛋白表达及产量的影响 |
| 5.2.6 多角体外部形态的扫描电镜观察 |
| 5.2.7 Bm14基因的缺失对ODV包埋进多角体的影响 |
| 5.2.8 包埋进多角体的ODV毒力分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 Bm14基因缺失对病毒经口感染和体内传播的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 经口感染后幼虫的存活情况 |
| 6.1.3 中肠组织中Bm14蛋白的特异性检测 |
| 6.1.4 ODV与中肠上皮细胞的结合实验 |
| 6.1.5 TrionX-114法提取整合膜蛋白 |
| 6.1.6 选择性通透处理 |
| 6.1.7 vBmWT~(VP39-EGFP-PH)及vBm~(bm14KO-VP39-EGFP-PH)重组病毒的构建 |
| 6.1.8 皮下注射病毒后幼虫的感染情况 |
| 6.1.9 低pH诱导的合胞体形成实验 |
| 6.1.10 病毒入侵宿主细胞的效率检测 |
| 6.1.11 病毒蛋白的表达 |
| 6.1.12 免疫共沉淀实验 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 Bm14基因缺失对幼虫经口感染的影响 |
| 6.2.1.1 重组病毒对幼虫的半致死剂量及半致死时间的测定 |
| 6.2.1.2 中肠组织中Bm14蛋白的特异性检测 |
| 6.2.1.3 ODV与中肠上皮细胞的结合分析 |
| 6.2.1.4 Bm14蛋白与经口感染因子的作用关系分析 |
| 6.2.2 Bm14基因缺失对幼虫系统感染的影响 |
| 6.2.2.1 vBmWT~(VP39-EGFP-PH)及vBm~(bm14KO-VP39-EGFP-PH)重组病毒构建 |
| 6.2.2.2 皮下注射重组病毒后幼虫的生存情况分析 |
| 6.2.2.3 重组病毒在幼虫体内传播的荧光观察 |
| 6.2.2.4 低pH诱导的合胞体形成及病毒入侵细胞的效率分析 |
| 6.2.2.5 Bm14蛋白与GP64蛋白的作用关系分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 Bm14与宿主及病毒互作蛋白筛选和鉴定 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 Activation/Binding Domain(AD/BD)重组载体的构建 |
| 7.1.3 酵母感受态细胞的制备 |
| 7.1.4 酵母感受态细胞的转化 |
| 7.1.5 家蚕卵巢细胞cDNA文库筛选 |
| 7.1.6 一对一酵母双杂交鉴定互作关系 |
| 7.1.7 病毒及宿主蛋白的表达 |
| 7.1.8 免疫共沉淀实验 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 酵母双杂交文库筛选Bm14的宿主互作蛋白 |
| 7.2.1.1 诱饵蛋白的毒性与自激活检测 |
| 7.2.1.2 文库筛选与候选蛋白的鉴定 |
| 7.2.2 双向酵母双杂交验证Bm14与宿主及病毒候选蛋白的互作 |
| 7.2.3 免疫共沉淀验证Bm14与宿主及病毒候选蛋白的互作 |
| 7.2.4 分段表达的Bm14与宿主及病毒互作蛋白的作用关系 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论、创新点与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间学术成果 |
| 致谢 |
（7）马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 马立克病毒的研究进展 |
| 1 马立克病毒的基本特征 |
| 1.1 马立克病毒的形态特征 |
| 1.2 马立克病毒基因组结构 |
| 1.3 马立克病毒与α-疱疹病毒同源的基因 |
| 1.4 马立克病毒特有基因 |
| 2. 马立克病毒的发病机理与宿主的免疫应答 |
| 2.1 早期溶细胞感染 |
| 2.2 潜伏感染 |
| 2.3 再次溶细胞感染 |
| 2.4 转化期 |
| 2.5 宿主的免疫应答 |
| 3. 病毒的流行病学研究进展 |
| 4. 马立克病的诊断 |
| 4.1 临床诊断 |
| 4.2 病毒抗原诊断 |
| 4.3 聚合酶链式反应诊断 |
| 5. 马立克病的防控 |
| 第二章 DNA损伤应答通路与病毒相互作用的研究进展 |
| 1. DNA损伤应答通路的基本特征 |
| 1.1 DNA损伤类型 |
| 1.2 DNA损伤应答通路 |
| 1.3 DNA损伤修复 |
| 2. DNA损伤应答通路与病毒的相互作用 |
| 2.1 病毒激活DNA损伤应答通路 |
| 2.2 病毒抑制DNA损伤应答通路 |
| 3. STAT3信号通路 |
| 3.1 STAT3信号通路的特征 |
| 3.2 STAT3信号通路与肿瘤发生 |
| 3.3 STAT3信号通路与病毒感染 |
| 4. 研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究部分 |
| 第三章 MDV感染引起细胞DNA损伤 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液的配制 |
| 1.7 MDV病毒滴度的测定 |
| 1.8 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.9 彗星试验方法的建立 |
| 1.10 检测鸡p53和p21多克隆抗体的特异性 |
| 1.11 检测细胞内p53和p21水平 |
| 2. 结果 |
| 2.1 彗星试验检测细胞DNA损伤方法的建立 |
| 2.2 MDV感染引起CEF细胞DNA损伤 |
| 2.3 MDV感染引起细胞中p53和p21水平的变化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DNA损伤应答通路对MDV复制的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液的配制 |
| 1.7 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.8 pcDNA3-2×Flag-Chk1和pcDNA3-Chk1真核表达载体的构建 |
| 1.9 检测DDR通路抑制剂对MDV感染的影响 |
| 1.10 检测ATR-Chk1信号通路对MDV复制的影响 |
| 1.11 检测MDV感染对细胞内Chk1磷酸化的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 DDR通路调控MDV感染 |
| 2.2 ATR-Chk1通路对病毒感染的影响 |
| 2.3 MDV感染调控Chk1的磷酸化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 MDV激活STAT3调控ATR-Chk1通路 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.7 检测MDV感染细胞中STAT3磷酸化水平变化 |
| 1.8 检测STAT3通路在MDV感染抑制Chk1磷酸化中的作用 |
| 1.9 检测抑制STAT3通路对MDV复制的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 MDV感染激活细胞内STAT3通路 |
| 2.2 MDV感染通过激活STAT3通路调控Chk1的磷酸化 |
| 2.3 抑制STAT3通路对MDV复制的影响 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 细胞氧化应激反应调控MDV复制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.7 细胞内ROS的检测 |
| 1.8 检测APO抑制剂对Md5复制的影响 |
| 1.9 检测DPI抑制剂对Md5复制的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 MDV感染引起CEF细胞内产生ROS |
| 2.2 细胞内氧化应激反应调控MDV复制 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 丹顶鹤马立克病临床病例的分子生物学诊断 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 临床丹顶鹤病例 |
| 1.7 临床组织切片HE染色 |
| 1.8 组织样本基因组的提取和病毒基因PCR检测 |
| 1.9 组织样本RNA的提取和病毒基因RT-PCR检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 丹顶鹤的临床剖检和组织学染色 |
| 2.2 丹顶鹤组织样本中MDV病毒基因的的检测 |
| 2.3 丹顶鹤组织样本中MDV病毒基因序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文创新点 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（8）苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 Md HB1蛋白结构预测 |
| 1.3.2 引物的设计与基因片段克隆 |
| 1.3.3 原核表达载体构建 |
| 1.3.4 表达载体6p HB在大肠杆菌中的表达 |
| 1.3.5 Md HB1融合蛋白的可溶性分析与表达条件的优化 |
| 1.3.6 表达载体28a HB的诱导表达与蛋白纯化 |
| 1.3.7 多克隆抗体的制备 |
| 1.3.8 间接ELISA法检测抗体效价 |
| 1.3.9 Western Blot实验检测抗体的特异性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Md HB1的生物信息学分析 |
| 2.2 质粒28a HB的构建 |
| 2.3 重组质粒28a HB的表达与蛋白纯化 |
| 2.4 间接ELISA法测定多克隆抗体的效价 |
| 2.5 原核表达载体6p HB的构建 |
| 2.6 重组质粒6p HB的原核表达 |
| 2.7 融合蛋白Md HB1-GST的可溶性分析 |
| 2.8 诱导时间和诱导物质量浓度对融合蛋白Md HB1-GST表达的影响 |
| 2.9 多克隆抗体特异性检测结果 |
| 2.9.1 菌体总蛋白的Western Blot实验 |
| 2.9.2 苹果幼叶蛋白Western Blot实验 |
| 3 讨论 |
（9）NDV介导IL-1β的产生依赖NLRP3炎症小体激活的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.2 NDV致病性与宿主免疫应答 |
| 1.1.3 鸡骨髓源树突状细胞参与炎症反应的研究 |
| 1.1.4 NLRP3炎症小体 |
| 1.1.5 病毒感染与S1PR1信号通路 |
| 1.1.6 病毒感染与NF-κB信号通路 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 病毒株和细胞 |
| 2.2 鸡胚和实验动物 |
| 2.3 菌株和质粒 |
| 2.4 抗体 |
| 2.5 主要试剂 |
| 2.6 主要溶液的配制 |
| 2.6.1 基因克隆相关溶液的配制 |
| 2.6.2 蛋白变性及纯化相关溶液的配制 |
| 2.6.3 SDS-PAGE及Western blot相关溶液配制 |
| 2.7 主要仪器设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 鸡源NLRP3炎症小体研究体系的建立 |
| 3.1.1 鸡NLRP3、caspase-1和IL-1β基因的克隆 |
| 3.1.2 caspase-1、IL-1β的蛋白表达与纯化 |
| 3.1.3 caspase-1、IL-1β多克隆抗体的制备 |
| 3.1.4 caspase-1、IL-1β多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 3.2 NDV感染SPF鸡后NLRP3炎症小体及相关分子的mRNA水平 |
| 3.2.1 病毒的分离纯化 |
| 3.2.2 病毒的部分生物学特性的鉴定 |
| 3.2.3 NDV感染SPF鸡 |
| 3.2.4 qPCR分析NLRP3炎症小体及相关分子的mRNA表达及组织分布 |
| 3.3 NDV感染DF-1后NLRP3炎症小体及相关分子的表达 |
| 3.3.1 NDV感染DF-1 |
| 3.3.2 qPCR检测NLRP3炎症小体及相关分子的mRNA表达水平 |
| 3.3.3 WB检测NLRP3炎症小体的蛋白表达水平 |
| 3.3.4 WB检测NDV感染DF-1引起IL-1β的分泌依赖NLRP3炎症小体 |
| 3.4 NDV感染后NLRP3炎症小体与S1PR1、P65之间的关系初步探索 |
| 3.4.1 过表达NLRP3炎症小体，检测S1PR1和P65的mRNA表达 |
| 3.4.2 沉默NLRP3炎症小体时S1PR1和P65的mRNA表达水平 |
| 3.4.3 过表达S1PR1时NLRP3、P65的mRNA表达水平 |
| 3.4.4 沉默S1PR1时NLRP3、P65的mRNA表达水平 |
| 3.4.5 沉默P65时S1PR1、NLRP3的mRNA表达水平 |
| 3.5 NDV感染鸡DCs后NLRP3炎症小体及相关分子的表达 |
| 3.5.1 鸡骨髓源细胞的制作 |
| 3.5.2 qPCR检测NLRP3炎症小体及相关分子的mRNA表达水平 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 鸡源NLRP3炎症小体研究体系的建立 |
| 4.1.1 鸡NLRP3、caspase-1、IL-1β基因的克隆 |
| 4.1.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 4.1.3 caspase-1、IL-1β多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4.2 NDV感染SPF鸡后NLRP3炎症小体及相关分子的mRNA表达 |
| 4.2.1 rGM毒株和IGM毒株的部分生物学特性的鉴定 |
| 4.2.2 rGM毒株和IGM毒株在细胞中的增殖 |
| 4.2.3 NDV感染SPF鸡后病毒在各组织中的分布 |
| 4.2.4 NDV感染SPF鸡后IL-1β和IL-18的表达 |
| 4.2.5 NDV感染SPF鸡后NLRP3炎症小体的表达 |
| 4.3 NDV感染DF-1 后NLRP3炎症小体及相关分子的表达 |
| 4.3.1 qPCR检测NDV感染DF-1引起NLRP3炎症小体及相关分子的表达 |
| 4.3.2 WB检测NDV感染DF-1引起NLRP3的蛋白表达 |
| 4.3.3 WB检测NDV感染DF-1引起caspase-1和IL-1β的蛋白表达 |
| 4.3.4 WB检测NDV感染DF-1引起IL-1β的分泌依赖NLRP3炎症小体 |
| 4.4 NDV感染后NLRP3炎症小体与S1PR1、P65之间的关系初步探索 |
| 4.4.1 过表达NLRP3时S1PR1和P65的mRNA表达水平 |
| 4.4.2 沉默NLRP3炎症小体时S1PR1和P65的mRNA表达水平 |
| 4.4.3 过表达S1PR1时NLRP3、P65的mRNA表达水平 |
| 4.4.4 沉默S1PR1，检测NLRP3、P65的mRNA表达水平 |
| 4.4.5 沉默P65时S1PR1、NLRP3的mRNA表达水平 |
| 4.5 NDV感染鸡DCs后NLRP3炎症小体及相关分子的表达 |
| 4.5.1 NDV感染鸡DCs |
| 4.5.2 NDV在DCs中的增殖情况 |
| 4.5.3 qPCR检测NLRP3炎症小体及相关分子的mRNA表达水平 |
| 5 讨论 |
| 6 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：硕士研究生期间所获科研成果 |
（10）苹果转录因子MdHB1在GA合成过程中的功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物转录因子概述 |
| 1.1.1 转录因子的功能结构域 |
| 1.1.2 植物转录因子家族分类 |
| 1.1.3 植物转录因子的生物学功能 |
| 1.2 转录因子HD-Zip I概述 |
| 1.2.1 HD-ZipI亚家族的结构与分类 |
| 1.2.2 HD-Zip I亚家族的研究进展 |
| 1.3 HD-Zip家族与GA合成代谢、信号转导 |
| 1.3.1 高等植物GA的合成代谢途径 |
| 1.3.2 HD-Zip家族成员与GA合成代谢、信号转导 |
| 1.4 苹果转录因子MdHB1的研究进展 |
| 1.4.1 MdHB1与果实的成熟衰老 |
| 1.4.2 MdHB1与GA的研究 |
| 1.4.3 MdHB1的其他研究 |
| 1.5 研究方法概述 |
| 1.5.1 基因的原核表达与多克隆抗体制备 |
| 1.5.2 Western blot试验 |
| 1.6 研究的目的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒载体和菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.1 MdHB1蛋白结构预测 |
| 2.2.2 氨基酸的聚类分析 |
| 2.3 引物设计与表达载体的构建 |
| 2.4 MdHB1的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备 |
| 2.5 间接ELISA法检测抗体效价 |
| 2.6 Western blot试验检测抗体的特异性 |
| 2.7 苹果果实的激素处理 |
| 2.8 VIGS瞬时转化苹果 |
| 2.9 RNA提取与实时荧光定量检测 |
| 2.10 苹果果肉内源GA3的提取与测定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 MdHB1的生物信息学分析 |
| 3.1.1 MdHB1蛋白结构预测 |
| 3.1.2 氨基酸的聚类分析 |
| 3.2 MdHB1融合蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.1 pET-28a-MdHB1(28a HB) 表达载体的构建 |
| 3.2.2 重组质粒 28aHB的表达与蛋白纯化 |
| 3.3 间接ELISA法测定MdHB1多克隆抗体的效价 |
| 3.4 MdHB1多克隆抗体特异性检测 |
| 3.4.1 pGEX-6p1MdHB1 (6pHB) 表达载体的构建 |
| 3.4.2 重组质粒 6pHB的原核表达 |
| 3.4.3 菌体总蛋白的western blot试验 |
| 3.4.4 苹果幼叶蛋白western blot试验 |
| 3.5 MdHB1对赤霉素(GA)处理的响应 |
| 3.6 MdHB1基因沉默对GA代谢的影响 |
| 3.7 MdHB1过表达烟草‘NC89’的验证 |
| 3.8 MdHB1过表达对GA代谢相关基因的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 生物信息学对MdHB1的分析 |
| 4.2 MdHB1多克隆抗体的制备 |
| 4.3 苹果MdHB1的存在形式分析 |
| 4.4 苹果转录因子MdHB1参与GA的信号转导 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、转录因子hB1F的融合表达及抗体制备（论文参考文献）
- [1]鸡细胞表面受体Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用[D]. 方文秀. 扬州大学, 2021
- [2]牛副流感病毒3型核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立[D]. 吕明芯. 山东师范大学, 2020(08)
- [3]斑点叉尾鮰E.ictaluri与Y.ruckeri二联基因OmpN2-OmpF亚单位和口服疫苗的制备与免疫效应研究[D]. 王二龙. 四川农业大学, 2019(07)
- [4]MultiBac高效展示系统构建及其应用于多联疫苗的模型研究[D]. 郑浩. 华南农业大学, 2019(02)
- [5]TAM-GBM细胞杂交促胶质母细胞瘤侵袭及机制和多基因风险评分的预后价值[D]. 曹棉富. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019
- [6]家蚕核型多角体病毒F-like蛋白的分子特征及功能研究[D]. 许伟凡. 浙江大学, 2019(11)
- [7]马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究[D]. 连雪. 南京农业大学, 2018
- [8]苹果转录因子MdHB1的原核表达与多克隆抗体制备[J]. 戴杰雨,姜永华,张玉洁,王豪杰,刘潇然,刘翠华,任小林. 食品科学, 2018(08)
- [9]NDV介导IL-1β的产生依赖NLRP3炎症小体激活的研究[D]. 朱雯娴. 华南农业大学, 2017(08)
- [10]苹果转录因子MdHB1在GA合成过程中的功能初探[D]. 戴杰雨. 西北农林科技大学, 2017(02)