王春辉[1]2004年在《井冈胺产生菌的选育与工艺条件的研究》文中认为井冈霉素是我国最大的一类农用抗生素，对纹枯病有好的防治作用，目前在我国大量使用，其市场价格低廉。井冈胺是井冈霉素的组成部分，是重要的医药中间体，其销售价格是井冈霉素的几十倍。因此以井冈霉素为原料生产井冈胺具有巨大的经济效益和社会效益。 本实验拟从井冈霉素出发，利用微生物培养和酶催化的基本原理和技术，研究微生物菌株的生理生化特性，实现井冈霉素的有效微生物酶降解。通过菌种的诱变和培养工艺的优化，提高微生物菌株的分解酶活力。 首先对本实验室已筛选到的菌株经过紫外诱变和亚硝基胍诱变后，得到了一株在生理特性上有较大区别的菌株，诱变后的菌株能使井冈胺的产量提高到一倍以上。 对新筛选到的菌株进行了培养工艺条件的优化，得到发酵培养基的最适初始pH值为8.0，最佳发酵温度为30℃，最适底物浓度为1％。在培养基优化过程中，研究了碳源、氮源、磷源和无机离子对发酵的影响。碳源以井冈霉素为好，最佳浓度为1％，氮源选择了1％的(NH_4)_2SO_4；选择了有促进作用的CaCl_2、KCl、MgSO_4和ZnSO_4，对其浓度进行了单因素试验和正交试验，结果表明，在最佳培养基条浙江工业大学硕士学位论文件下发酵液中井冈胺的含量达到了2.43mg/ml，井冈胺得率有71 .5%，比在原培养基基础上所得的结果l.6omg/ml，产量提高了51.9%。 最后对菌种产生的酶进行了分离纯化和酶的性质研究。经过一系列的纯化酶的纯化倍数达到了巧.37，产率为9.6%。对酶的性质经过初步研究，结果表明:酶的最适pH值为8.0，pH值稳定范围为7一8，最适反应温度为40℃，温度稳定范围在40℃以下，CaZ+和K+对该酶有强烈的激活作用，而FeZ十和SDS对该酶有明显的抑制作用，以井冈霉素为底物该酶的Km一22.smmol几，vm一59.17ogml一‘h一’。
陈明兆[2]2015年在《井冈霉素规模化生产工艺优化研究》文中研究指明农用抗生素---井冈霉素,在中国研发生产已有四十多年的历史,至今仍为水稻纹枯病的特效农药,其市场地位依旧无法超越。随着井冈霉素在市场的广度与深度不断地拓广,现已用于小麦、玉米、棉花、油菜等多种农作物,还推广运用于蔬菜和果树,甚至在鱼类的养殖防病也有所涉及。作为性价比高的微生物农药,井冈霉素现在依旧是国内农业种植者使用生物农药时的首选。目前,在井冈霉素的生产中,发酵水平的提高是其生产的瓶颈。本文通过自然选育进行筛选,获得在摇瓶培养中井冈霉素效价达30500μg/mL的高产菌株98#。通过稳定实验发现,该菌株不仅井冈霉素的产量高,而且具有较高的稳定性。高产菌株98#,提高规模化生产的发酵水平,降低单罐生产成本,进一步提高井冈霉素的市场竞争力。其次,运用正交试验法分别考察了碳源、氮源等不同因素及其配比在摇瓶以及发酵罐等不同尺度对井冈霉素效价的影响。结果表明:7%的大米粉不但不影响发酵水平,还能分摊企业生产成本。发酵罐尺度考虑原材料的价格、运输便利程度等因素,种子罐培养基为:大米粉3%,花生饼粉2%,酵母粉1%,蚕蛹1%,NaCl 0.2%,KH2PO4 0.0625%,CaCO3 0.2%,消泡剂0.03%,调pH=7.5,种龄为22-24h;发酵罐培养基培养基为:大米粉7%,花生饼粉1%,酵母粉2%,氨基酸粉1%。在空气流量1:1 V/V·min的条件下,井冈霉素的效价可达24981μg/mL。在此基础上,通过对补料的种类、用量、时机等方面的考察,表明补料工艺可提高井冈霉素的发酵水平。在发酵液中残糖≤3.5%一次性补加2%量的淀粉液化糖,可提高发酵水平达19.0%,效价达到26060μg/mL。另外,后期溶氧控制在一定程度对效价无影响,在用电负荷较大时,此措施可以减轻用电负荷,节约电力成本。最后,通过对井冈霉素分子结构和性状的分析,采用改良的大孔交联离子交换吸附剂对井冈霉素进行分离纯化。初步研究了大孔交联离子交换吸附剂与滤液的物理性状的相关性,试图进一步完善大孔交联离子交换吸附剂对井冈霉素的提纯工艺流程,提高井冈霉素产品纯度,为企业生产七十万单位高浓度井冈霉素粉剂提供合理的理论指导。
董至恒[3]2008年在《井冈霉素生物转化菌种的筛选与产物鉴定》文中研究说明井冈霉素(Validamycins),又称有效霉素,是我国科学家沈寅初开发成功的一个农用抗生素,由吸水链霉菌变种(Streptomyces.hygroscopicus vag.jinggangensis)产生。井冈霉素对水稻纹枯病有较好的防治作用,以井冈霉素为原料开发井冈胺类物质是一种很有前景的方法。井冈胺类物质包括:井冈霉亚基胺A(Validoxylamine A)、井冈霉胺(Validamnie)、井冈胺(Valienamine)、井冈霉醇胺(Valiolamine)。井冈霉亚基胺A对海藻糖苷酶有一定的抑制作用,有望开发成为一种新型杀虫剂。井冈霉胺、井冈胺是糖苷酶如α-淀粉酶、糖化酶、蔗糖酶、麦芽糖酶的竞争性抑制剂,这两种物质可被开发成为药品或保健品,用于Ⅱ型糖尿病的防治,也可作为医药中间体合成一些降糖药,如伏格列波糖(Voglibose)和阿卡波糖(Acarbose)。本文研究探索出一条以微生物转化法降解井冈霉素生产井冈胺类物质的方法,该方法有高效、清洁、低成本等优点。通过混菌培养法,筛选出了能够转化井冈霉素为井冈霉亚基胺A的叁株真菌:Y07F-1287、Y07F-1248、Y07F-1239。并根据形态学如菌落特征、菌丝体形态以及ITS序列分析,菌株Y07F-1287初步鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、Y07F-1248初步鉴定为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)、Y07F-1239初步鉴定为因卡纳镰刀菌(Fusarium incarnatum)。通过富集培养法,筛选出了能够转化井冈霉素为井冈霉胺的一株细菌:Y07B-0134。根据其生理生化特征及其16S rDNA序列分析,菌株Y07F-0134初步鉴定为多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)。对转化产生井冈霉胺的菌株Y07B-0134进行了转化条件的初步优化,优化结果为:培养时间5d;底物投料量2.5%;培养基初始pH6.5;以井冈霉素为唯一碳源;0.5%的硝酸铵作为氮源。结果表明,在优化的培养条件下,井冈霉胺的含量达到3.18mg·mL~(-1),摩尔转化率达28.89%,比优化前提高了19.37%。在对井冈霉亚基胺A的分离纯化过程中,采用阳离子树脂法分离产物,阴离子树脂脱色,乙醇沉淀产物,获得井冈霉亚基胺A的结晶,经HPLC法检测含量超过95%。在对井冈霉胺的分离纯化过程中,采用先后两次上样阳离子树脂法分离产物,阴离子树脂脱色,乙醇沉淀产物,获得井冈霉胺的结晶。
徐利剑, 赵维, 曹聪, 王健, 王茜[4]2015年在《井冈霉素的研究进展》文中提出井冈霉素是最成功的生物源杀菌剂之一,也是防治水稻纹枯病的最常用与最有效的农药之一。文章综述了井冈霉素的理化性质及关于井冈霉素生物活性的研究,井冈霉素不仅抑制海藻糖酶活性,而且还具有抑制真菌的纤维素降解酶、多聚半乳糖醛酸酶和肌醇生物合成的活性;总结了井冈霉素的检测方法,通过色谱与质谱联用等方法来完成,最低检测量达到了0.4 ng。提出井冈霉素的生物合成是先将葡萄糖经过戊糖磷酸途径生成景天庚酮糖-7-磷酸,然后将葡萄糖与景天庚酮糖-7-磷酸经过10个酶催化,最终合成了井冈霉素A。最后评价了井冈霉素的发酵生产工艺,经过培养基组分优化、补料添加、发酵条件控制与分离工艺改进,井冈霉素的生产工艺也日趋完善。
秦俊伟[5]2012年在《氨基环醇类化合物对阿卡波糖发酵过程的影响》文中研究表明阿卡波糖是治疗Ⅱ型糖尿病的有效药物,能控制病人在进食含有淀粉的食物后的血糖含量,对肠道内的一些消化酶都有强烈的抑制作用,有良好的药动学性质和低毒性,自上市以来,迅速占领市场,其需求量逐年上升。实验室筛选到一株高产的阿卡波糖菌株Actinoplanes.utahensis ZJB-08196,本文旨在通过添加氨基环醇类化合物,以提高阿卡波糖的发酵水平,并减少其发酵过程中杂质组分C的含量。本文的主要工作如下:论文建立了阿卡波糖发酵过程中各种发酵参数的检测方法;实验结果确立了 250 ml叁角瓶体系的最适接种量和装液量分别为10%和30 ml,并考察了种子和发酵进程曲线;并初步挑选出几种具有代表性的氨基环醇类化合物,实验表明只有C7N类氨基环醇类化合物对阿卡波糖发酵产量的提高有促进作用。建立了一种较适合的补料分批发酵方案:在72 h和96 h两次补加6 g/l葡萄糖,14 g/l麦芽糖和9 g/l黄豆饼粉的混合物。结果发现有效霉素类化合物中,只有有效霉素A能促进阿卡波糖的合成,发酵时添加有效霉素A终浓度为0.08 g/l,并且补料条件下,阿卡波糖的效价达到5602 mg/l,相比对照提高了 57%,组分C相对降低了54%;井冈胺类化合物中,有效霉烯胺、有效霉胺和有效霉素裂解液都能不同程度促进阿卡波糖的合成,其中发酵时添加前体物质有效霉胺终浓度为20 mg/l,并且补料条件下,阿卡波糖效价达到最高的6606 mg/l,比对照提高了 90%左右,组分C与对照相比降低了 64%。通过进一步对不同发酵情况下发酵进程中发酵参数的研究,发现加入适量的有效霉素A和有效霉胺都可以促进发酵过程中麦芽糖和葡萄糖的代谢,提高生物量,来增加阿卡波糖的效价,同时降低发酵液中组分C的含量,为后期的分离降低了难度。本实验的研究为阿卡波糖的发酵提供了一种有效的调控方法。有效霉素A、有效霉烯胺和有效霉胺很可能作为合成阿卡波糖前体物质直接和间接地参与了阿卡波糖的生物合成过程,在培养基中添加这些物质不仅能提高阿卡波糖产量,还能为后期的产物分离减轻负担。下一步将对这些现象的机理进行深入研究,为实现工业应用提供理论基础。
周祥[6]2011年在《井冈霉素生物合成限速步骤解析及高产》文中认为井冈霉素作为抗水稻纹枯病的重要农用抗生素,在中国等亚洲国家被广泛使用,是我国的科研人员开发的具有自主知识产权的安全、高效、低价的抗真菌农药。由于其诸多优点,被迅速推广。目前我国对井冈霉素需求已经超过6万吨,年产值超4亿元。因此深入研究井冈霉素发酵过程及其产生菌的基因表达与代谢具有重要的经济价值和社会效益。在井冈霉素的发酵过程中,作为井冈霉素生物合成前体的有效氧胺有较大量的积累。这种积累对于工业生产井冈霉素的发酵过程而言,是不经济的。如果能够消除这种前体物的积累,将可能提高发酵终产物井冈霉素的产量。我们首先系统分析了有效氧胺积累的原因。造成有效氧胺积累的可能原因有两类:是菌体将已经合成的井冈霉素再次分解生成有效氧胺,即在菌体中存在有效氧胺完全转化生成井冈霉素,再分解形成有效氧胺的过程(有效氧胺→井冈霉素→有效氧胺)。这可能是由于井冈霉素的β-糖苷键不稳定,在发酵过程中分解。针对于这种可能性,我们设计了将井冈霉素添加到发酵培养基中,在不接种的情况下在发酵温度(37°C)下连续培养个发酵周期(5天),检测发现没有有效氧胺的生成,表明井冈霉素在发酵过程中是稳定的,不会被分解生成有效氧胺。这种积累也可能由于菌体在发酵过程中能够产生水解井冈霉素生成有效氧胺的β-糖苷酶。我们将井冈霉素分别添加到井冈霉素生物合成基因valA缺失突变株JXH1的胞外蛋白体系和cell-free体系中,同样也未检测到井冈霉素的分解和有效氧胺的产生,因此这种积累也不是由于菌体所产生的β-糖苷酶的酶解所造成的。有效氧胺积累的第二类可能原因是由于糖基化不完全造成的。糖基化过程受到糖基转移酶的催化活力和糖基供体的供给的影响。我们将糖基转移酶基因valG分别克隆到红霉素启动子PermE*和井冈霉素生物合成基因valA的启动子PvalA的下游,并通过整合型载体pPM927将糖基转移酶基因valG在井冈霉素高产菌株中进行超量表达。转录分析表明valG基因在PvalA启动子的控制下,其转录水平在发酵前期(24小时)及发酵中期(48小时)提高到2.5倍以上,而在发酵后期(120小时),则仍保持在1.7倍以上。而在红霉素启动子PermE*的控制下,valG的转录水平则始终保持在1.1-1.3倍。这表明使用此超量表达系统,糖基转移酶valG基因的转录水平有定的提升。同时我们还发现在井冈霉素产生菌中,井冈霉素生物合成基因valA的启动子PvalA的作用优于红霉素启动子PermE*。对ValG的酶活验证表明,使用PvalA超量表达valG基因,糖基转移酶活力由234 pkat/毫克总蛋白提高到460 pkat/毫克总蛋白,酶活力提高了近倍。但通过对井冈霉素的产量和井冈霉素与有效氧胺的比例的检测,我们发现超量表达糖基转移酶ValG没有能够减少有效氧胺的积累,同时井冈霉素的产量也没有明显的增加。证明糖基转移酶的酶活不足不是有效氧胺积累的原因。糖基化的过程,除了受到糖基转移酶活力的影响外,还与糖基供体的供给有关。因此我们进步分析糖基供体UDP-葡萄糖的供给对于糖基化过程的影响。当我们添加UDP-葡萄糖至井冈霉素产生菌TL01小量发酵液中以及cell-free体系中时,检测结果表明糖基化过程均被显着地加强。在含有大量UDP-葡萄糖存在的体系中,几乎未见有效氧胺的积累,此实验充分说明了井冈霉素产生菌中UDP-葡萄糖的供给不足可能是造成有效氧胺积累的原因。我们继而分析了井冈霉素产生菌中的UDP-葡萄糖的合成过程,并对参与UDP-葡萄糖合成过程的6-磷酸葡萄糖激酶(4779.0pkat/毫克总蛋白)、6-磷酸葡萄糖变位酶(1763.4pkat/毫克总蛋白)以及UDP-葡萄糖焦磷酸酶(26.4pkat/毫克总蛋白)之间酶催化活力进行了测定和比较。结果表明,相对于参与UDP-葡萄糖合成的其它酶的活力,UDP-葡萄糖焦磷酸酶的催化活力明显较低,其催化活力同时远低于次级代谢过程中的糖基转移酶的活力(234 pkat/毫克总蛋白)。通过以上实验,我们基本确定了井冈霉素产生菌中UDP-葡萄糖焦磷酸酶的活力不足是造成有效氧胺积累的主要原因。我们继而通过超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶以提高菌体内UDP-葡萄糖的供给。我们在吸水链霉菌井冈变种5008中成功克隆到了UDP-葡萄糖焦磷酸酶合成基因(ugp),并对其体外催化活力进行了验证。将此基因克隆到PvalA启动子的下游,并通过整合型载体将ugp导入TL01中。对基因工程菌株的基因转录和体外酶活的测定表明ugp在转录水平上提高了2.5倍,而UDP-葡萄糖焦磷酸酶酶活力则从26.4pkat/毫克总蛋白提高到54.2pkat/毫克总蛋白,从而确定了ugp在TL01中的超量表达。进步的产量检测显示通过超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶,井冈霉素高产菌株TL01的产量从18克/升提高到了22克/升。并且井冈霉素与有效氧胺的比例(mol/mol)从3.15提高到了5.75,有效氧胺积累量显着下降。因此,我们通过系统分析和实验证明,通过超量表达UDP-葡萄糖焦磷酸酶的方式增加糖基供体UDP-葡萄糖的供给,能够显着地减少糖基配体有效氧胺的积累,并且能够有效的提高井冈霉素的产量。此外,我们还建立了井冈霉素高产菌株的高通量筛选方法。井冈霉素及其生物合成前体有效氧胺是海藻糖酶的抑制剂,其中有效氧胺的体外抑制活性是井冈霉素的100倍以上。我们通过体外添加抑制剂的方法,检测海藻糖酶水解生成葡萄糖反应的抑制程度,并利用在定浓度范围内抑制剂浓度与生成葡萄糖浓度之间的线性关系,间接测量所添加的抑制剂的浓度。但由于有效氧胺和井冈霉素以定的比例存在于发酵产物中,因此对于后续的高通量筛选而言,少量的有效氧胺所带来的抑制活性可能会超过大量的井冈霉素的抑制活性。因此,本实验采用突变井冈霉素生物合成基因簇中的糖基转移酶的策略,使得发酵产物中只存在有效氧胺。以高产菌株糖基转移酶突变菌株XZ2为出发菌株,通过全基因组转座子突变的方法,筛选显着影响有效氧胺产量的突变株。在研究过程中我们分别建立了利用颜色反应高通量的筛选突变株的方法、高通量的培养链霉菌的方法,同时优化了链霉菌体内转座系统。1.高通量的筛选有效氧胺突变株的方法对于高通量的筛选过程,我们利用了前述的有效氧胺在体外抑制海藻糖酶的原理。首先对水解反应体系进行了优化,通过100倍稀释微孔培养体系中有效氧胺的发酵提取液,使得海藻糖水解反应在加入定浓度范围内(1-10 mg/L)的有效氧胺发酵提取液后,所生成的葡萄糖的浓度能够在20μg/ml至80μg/ml的浓度范围内。在此线性范围内,即可利用颜色的深浅来反映有效氧胺对于此水解反应的抑制程度。颜色越深,所生成的葡萄糖越多,反应体系中的有效氧胺的量越低。颜色越浅,所生成的葡萄糖越少,反应体系中的有效氧胺的量越高。此颜色反应可通过酶标仪进行高通量的检测。2.高通量的培养链霉菌的方法由于需要培养大量的突变株以验证其产量的差异,故传统的摇瓶发酵策略无法满足实验的需要。我们设计使用1ml深孔96孔板对大量的突变体进行固体培养发酵,有效地缩小了培养体系的体积。400μL的固体培养基添加至1mL的微孔中至培养结束后将培养基碾碎。添加400μL的无菌水至每个孔中作为提取液。将96孔板使用密封条密封后,置入超声波清洗器中超声提取30分钟。再置于37°C,220转摇床中提取6个小时。经此提取步骤后,有效氧胺的残留量低于首次提取量的5%。对微孔固体发酵的发酵曲线进行测定,最终确定了8天的培养周期。此培养体系具有良好的平行性和重复性,8株平行株的产量误差在5%以内,能够满足后续实验所需的高通量筛选的要求。3.链霉菌体内转座系统的优化。我们使用了能够在天蓝色链霉菌中高效转座的pTNM,此质粒上携带有Tn5转座系统以及温敏型复制子,能够通过提高培养温度使质粒丢失。但由于以温敏型复制子pSG5衍生的质粒在井冈霉素产生菌中以高温(超过42°C)培养依然难以完全丢失,因此我们构建了由pIJ101衍生的转座质粒。含有新转座质粒的井冈霉素产生菌在没有抗生素添加的情况下培养,质粒将会由于没有选择压力而完全丢失。通过硫链丝菌素的诱导并松弛培养,能够得到大量随机的插入突变体,转座发生的频率在103-104之间。对14株突变株的总DNA使用BamHI进行酶切处理,其中含有转座子元件的片段,通过酶联反应后能够形成具有特殊复制子的环形DNA。通过转化大肠杆菌并使用转座子元件内部的引物进行测序反应,能够对插入位点进行定位。使用此方法得到了14个不同的插入位点,表明插入位点具有很好的随机性。本研究共对836株有效氧胺的突变株进行了高通量的筛选,并对于此筛选体系进行了评估。其中有8株突变株,其有效氧胺的产量较出发菌株存在明显的变化(±>20%)。其中2株有效氧胺的产量有提高,6株有效氧胺的产量有降低。本研究还对2株产量提高的菌株进行了回补实验,结果表明当携带有完整基因的质粒进入突变株体内后,2株突变株的产量回到了出发菌株的水平。
参考文献：
[1]. 井冈胺产生菌的选育与工艺条件的研究[D]. 王春辉. 浙江工业大学. 2004
[2]. 井冈霉素规模化生产工艺优化研究[D]. 陈明兆. 浙江工业大学. 2015
[3]. 井冈霉素生物转化菌种的筛选与产物鉴定[D]. 董至恒. 沈阳药科大学. 2008
[4]. 井冈霉素的研究进展[J]. 徐利剑, 赵维, 曹聪, 王健, 王茜. 中国农学通报. 2015
[5]. 氨基环醇类化合物对阿卡波糖发酵过程的影响[D]. 秦俊伟. 浙江工业大学. 2012
[6]. 井冈霉素生物合成限速步骤解析及高产[D]. 周祥. 上海交通大学. 2011