中国医学科学院 北京协和医学院 医药生物技术研究所 北京 100050
摘要：固体斜面培养基常规灭菌后会出现培基溢液、灭菌不彻底的现象。经过细致的工艺参数改变实验和关键技术控制，最后确定了新的灭菌条件：预热恒温30分钟左右灭菌后排汽30分钟并分别控制灭菌内舱和夹层排汽操作，使灭菌彻底同时无逃液不焦化，达到了理想效果，建立了一套特殊的灭菌技术方法。
关键词：固体斜面培养基；溢液与通透焦化；特殊灭菌条件
一、设备与方法：
1．设备：半自动压力蒸汽灭菌器 基本灭菌参数（121℃ 0.15MP）
2．方法：
固体斜面培基用于放线菌培养，含有琼脂、N源和C源成分，按照常规灭菌（预热25分钟左右、有效灭菌30分钟、排气降温20分钟左右）会出现逃液、灭菌不彻底或者焦化现象，使灭菌后的培基成分有折损，不利于放线菌生长，影响科研结果。
避免逃液出现，通常采用灭菌后延长排汽时间的办法。同时培基N源灭菌需要加温彻底，采取了预热加强和灭菌后排汽保温法保证了灭菌通透。在灭菌后排汽环节尝试打破常规，分隔时间关闭内舱与套层，最后使逃液和灭菌通透两个问题同时得到了技术保证。
备注：1】首推的3#锅，为半自动压力蒸汽灭菌器。2#锅是传统手动压力蒸汽灭菌器。
2】灭菌通透培基颜色显示为正常黄色
上表灭菌实验详解：
首先针对琼脂培基易逃液的特点采取延长排汽时间的办法增加10分钟。首试无逃液出现，再试排汽延时至40分钟，则灭菌后有焦化现象出现，培基暗黄色（3月4日灭菌显示），影响使用。经重复实验最后确定了排汽保温30分钟治止逃液现象。
其次，根据培基含N源不易消毒透彻的性质特点加强灭菌时效保证工作，夹层预热必须充分，根据环境冷热差异适当调节预热温度高低，天气冷则增加预热时间，热环境（前面热锅启动过），则可以适当减少预热时间（如2月25日预热25分钟），确保正式灭菌前热锅温度，才可以保证灭菌内舱恒温时间30分钟有效灭菌，使含N培基消毒彻底，显示正常合格黄颜色。之后，接下来的夹层迟后排汽操作也起了加强保温作用。另外，选择锅次也很关键，2#锅，内室比较宽阔而且封闭不如3#严密，加上机械设备比较慢热，同样条件下灭菌热时效会有些差异（如3月11日同样预热30分钟会使灭菌后培基颜色显示稍微浅淡黄色说明灭菌虽然无菌合格但却不十分彻底）。
再次，在预热30分钟左右热灭菌保证30分钟排气降温30分钟参数确定的前提下，注意细节，灭菌后先关闭容器内舱进汽阀，稍后再关闭套层进汽阀。缓慢降温处理防止逸液同时也能进一步保证琼脂灭菌热时效通透到位。
通过以上工艺参数改变实验和关键技术控制试验，成功解决了固体培养基灭菌逃液、焦化和灭菌不通透的复杂问题，确定了固体培基的最适灭菌条件方法。
二、结果：
固体斜面培基最适灭菌工艺参数是：预热30分钟左右，有效灭菌时间30分钟，灭菌后延长排汽降温时间至30分钟。特殊灭菌技术处理包括：1．夹层升温恒温保证，例如，排除冷热空气影响因素，延长或缩短预热5分钟；消除灭菌器的差别因素，固定选择内室严密的3号锅。2．灭菌结束后排汽降温技术关键，先关闭内舱汽阀，稍后再关套层，于准确计时30分钟后开舱取物。
新的灭菌参数结合这种特殊技术处理进行消毒，在保证了固体培基无逃液的同时使N源消毒彻底通透，C源成分也无焦化现象，灭菌效果超出设备性能级的合格、理想，令研究科室非常满意。灭菌条件确定之后一直沿用至今，已经形成了一种成熟的特殊灭菌技术方法！可以推广于类似条件的其它待消培养基的特殊灭菌工作。
三、讨论：
1．应对特殊培基灭菌问题及时摸索确定的一套特殊灭菌操作技术方法，使科研进程顺利进展，节省了时间，提高了效率。这对于现有设备性能和设备技术条件是一种突破，为科研院所节约了设备开支。后勤灭菌技术工作给了科研工作有力的支持，起了不容忽视的科技基础支撑作用。
2．在科研工作进程中，灭菌消毒工作不容忽视，灭菌效果的差异，直接影响着科研进度。目前我们科研院所后勤常规灭菌供应工作已经不能满足科研日益发达的科研业务的需求，送消物品灭菌条件也日趋苛刻，有的超出了现有设备技术性能，后勤岗位人员需要在完成常规灭菌任务之外，增加工作负荷钻研技术才能达到与科研匹配的灭菌效果。因此，加强灭菌力量亟待解决！加强设备技术支持，及时更新升级灭菌设备；增强岗位技术软实力，增加技术力量并加强岗位人员培训学习，提高灭菌工作生产力，使灭菌技术供应工作更好地与科研技术工作同步，更高效更便捷地为科研课题提供灭菌保障服务。
参考文献：
[1]放线菌的选择分离培养，厦门大学，《生命科学导论》。
[2]有关湿热灭菌的标准-过度杀灭法-无菌保证水平，上海市食品药品监督管理局，《湿热灭菌以及湿热灭菌工艺的验证指南》。
论文作者:曹凤华
论文发表刊物:《健康世界》2018年7期
论文发表时间:2018/6/7
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