黎为能，赖术，肖刚，韦健全，罗莹，廖长秀
（右江民族医学院，广西 百色 533000）
中图分类号: R285.5 文献标识码:A
本文基金项目：广西教育厅科研项目（桂教科研[2008]27号，项目编号：200810LX379）.
[摘要] 目的：研究露兜竻蔃水提物对实验性肝损伤模型的保护作用及其急性毒性。方法：采用四氯化碳引发小鼠的急性肝损伤模型，观察露兜竻蔃水提物不同剂量组对血清ALT、AST活性和肝组织中MDA含量以及SOD活性的影响。同时用最大耐受量法检测露兜竻蔃水提物对小鼠的急性毒性。结果：露兜竻蔃水提物对小鼠最大耐受量为240g生药/Kg,能明显降低四氯化碳所致急性肝损伤模型小鼠血清中的ALT、AST活性(P﹤0.01), 亦能明显降低肝组织中MDA含量，增加SOD的活性 (P﹤0.01)。结论: 露兜竻蔃水提物毒性很低，属无毒级。对实验性肝损伤模型有一定的保护作用，其机制可能与抗脂质过氧化有关。
[关键词] 露兜竻蔃；急性毒性；四氯化碳；肝损伤；小鼠
露兜竻蔃[1]为露兜树科植物露兜树 Pandanus tectorius Soland. 的根及根头，又名勒角蔃(《岭南草药志》)，露兜根(《云南思茅中草药选》)，生于海边地区。主要分布于广西龙州、南宁、容县、桂平，广东、云南等地亦有分布。据广州部队《常用中草药手册》记载：“性味甘淡，凉。具有发汗解热，利水化湿。主治感冒发热，肾炎水肿，尿路感染，肝炎等。”已知化学成分含大黄素甲醚、中国蓟醇、棕榈酸、硬脂酸、三十烷醇-1、β-胆固醇、豆固醇、菜油固醇、胡萝卜固醇及胡萝卜固醇、豆固醇葡萄糖式和菜油固醇葡萄糖式的混合物。另据报道[2]，又含豆固-4-烯-3-酮，豆固-4-烯-3，6-二酮。桂平民间有人用其治疗肝炎，特别是黄疸型肝炎，疗效显著。本文对露兜竻蔃水提物急性毒性实验进行了研究,并采用四氯化碳(CCl4)造成小鼠实验性肝损伤,来探讨露兜竻蔃水提物对肝组织的保护作用，为其临床应用提供理论依据。
1 材料
1.1 动物
健康昆明小鼠 60只，雌雄各半，体质量20±2g，清洁级，由右江民族医学院实验动物中心提供［许可证号：SYXK桂2011-0010］。
1.2 药物
露兜竻蔃（采集于百色市阳圩）；丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒（批号20130323，20130320），超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（批号20130608），丙二醛（MDA）测试盒（批号20130314）和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（批号20130321），均购自南京建成生物工程研究所。联苯双酯，为北京协和药厂产品，批号1301016。四氯化碳（CCl4）分析纯，成都市科龙化工试剂厂产品，批号20090926，实验时用花生油配成0.1%CCl4溶液。
1.3 主要仪器
FA2004N电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；FSH-2A可调高速电动匀浆机（金坛市金南仪器厂）；XW-80A型旋涡混匀器（上海医科大学仪器厂）； TD24A-WS低速台式离心机； 722型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。
2 方法
2.1 露兜竻蔃水提取物的制备
将露兜竻蔃粉碎成粗粉，按料液比1：10加水浸泡15min，加热煎煮两次，每次1h，过滤后合并两次滤液，浓缩溶液得水提取物，于4℃冰箱保存备用。
2.2对小鼠急性毒性的实验研究
根据前期预实验，因其毒性较低，无法测出其LD50，故改做小鼠试验最大耐受量(MTD)的测定。取小鼠40只，雌雄各半，禁食不禁水，12 h后试验组小鼠以露兜竻蔃水提取物最大浓度3g/ml、最大体积0.4ml/10g灌胃，间隔6h给药1次，共2次，空白对照组给予等体积生理盐水。给药后让小鼠自由摄食及饮水，并观察小鼠的活动、行为、呼吸、皮毛、二便、进食、饮水、体重、鼻、眼、口腔有无异常分泌物等情况，每天上、下午各观察1次，连续7 d。给药后第8天处死小鼠，观察内脏器官的变化情况。
2.3对CCl4致小鼠肝损伤的影响[3-4]
取昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、联苯双酯组、露兜竻蔃水提物高剂量组、中剂量组、低剂量组(分别相当于生药12g/Kg、6g/Kg、3g/Kg)。空白组和模型组给予等体积生理盐水，其余各组给予相应药物灌胃，0.1ml/10g，1次/d，连续7d，末次给药后禁食不禁水， 4h后除空白对照组给予等剂量的花生油外以外，其余各组均腹腔注射（ip）0.1%CCl4花生油溶液0.1 ml/10g，16h后眼球取血，分离血清，测定ALT、AST的活性。同时小鼠颈椎脱臼处死，迅速剖取肝脏，称取肝湿重，制备10%肝匀浆，离心后取上清液，检测肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）的水平。
2.4数据处理
所有实验数据以均数±标准差表示，采用统计软件SPSS17.0进行组间t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1对小鼠急性毒性的实验结果
小鼠经受试药物灌胃后均出现活动减少现象，2h小时后恢复正常，这说明露兜竻蔃水提物对小鼠可能具有一定的中枢抑制作用。之后的7天内小鼠毛色、活动、饮食、二便均正常，无震颤、扭体及翘尾；鼻、眼、口腔无异常分泌物，未出现其他不良反应和死亡情况。第8d颈椎脱臼法处死，经解剖和尸检，肉眼未见未发现内脏器官异常。
3.2对CCl4致肝损伤小鼠体质量及肝脏指数的影响
实验结果表明，各组小鼠体质量无显著性差异。模型组小鼠肝指数较空白对照组明显升高（P﹤0.01），表明 CCl4能够导致小鼠肝脏损伤明显肿大；与模型组比较，联苯双酯组、露兜竻蔃水提物高、中、低剂量组肝脏指数均降低，差异有高度统计学意义（P﹤0.05）。见表1。
4 讨论
露兜竻蔃水提物对小鼠最大耐受量测试结果表明，各项观察指标在给药组与对照组之间无显著差异，且未见毒性反应，故该药对小鼠1日最大耐受量为240 g生药/kg，相当于成人（50 Kg）临床用量（0.6 g生药/Kg）的400倍，因为半数致死量（LD50）﹥5 g/Kg时药物实际属于无毒性物质，表明露兜竻蔃急性毒性极低，因此在临床上应用是十分安全的。
四氯化碳（Carbon Tetrachloride，CCl4）又称四氯甲烷，是一种选择性肝脏毒性物质，进入体内后，经肝细胞色素P450激活为自由基·CCl3，继而与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，使蛋白质代谢障碍，细胞膜磷脂分子出现脂质过氧化，引起膜结构和功能完整性的破坏，通透性增加，导致肝细胞浆中可溶性溶酶渗出入血，启动了肝脏损伤。因此，血清转氨酶活性升高是肝细胞受损的敏感性指标[5]。实验结果显示，模型组小鼠血清ALT、AST活性与正常对照组相比明显升高，露兜竻蔃水提物可呈剂量依赖性明显降低血清ALT、AST活性，提示露兜竻蔃水提物对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用。
氧化性损伤与多种毒性物质引起的肝损伤及病毒性肝炎的病理学有关。MDA作为过氧化脂质代谢产物，是细胞氧化损伤的一个重要检测指标。MDA可与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性脂褐质，沉积于组织细胞，破坏细胞膜结构，最终导致细胞无法维持正常代谢而死亡[6]。能够对抗氧化损伤的抗氧化酶包括SOD、GSH-PX、CAT等，SOD可清除自由基，其活性的减弱，可引起不饱和脂肪酸氧化生成过氧化物，形成脂褐质以及使DNA、蛋白质和酶等改变、破坏，加速肝脏损伤。实验结果显示，模型对照组小鼠肝脏MDA明显升高，抗氧化酶SOD活性却明显下降，提示CCl4可引起肝脏氧化损伤。与模型组比较，不同剂量露兜竻蔃水提物可使升高的MDA明显降低， SOD活性明显升高，且表现出剂量依赖性的特点，提示露兜竻蔃水提物的保肝作用与其清除氧自由基，抗脂质过氧化损伤密切相关。
综上所述，露兜竻蔃水提物可能通过抗氧化作用而发挥了对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用，从而为露兜竻蔃作为护肝药物提供了理论依据，使其具有一定的临床应用价值。
参考文献：
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[6] Dlugosz A, Srednicka D, Boratymski J. The influence of tracrolimus on oxidatives stress and free-radical processes [J].Postepy Hig Med Dosw.2007，61:466-471.
论文作者:黎为能，赖术，肖刚，韦健全，罗莹，廖长秀
论文发表刊物:《世界复合医学》（下）2015年第1卷总第8期
论文发表时间:2015/10/30
标签：小鼠论文; 损伤论文; 毒性论文; 活性论文; 固醇论文; 肝脏论文; 模型论文; 《世界复合医学》（下）2015年第1卷总第8期论文;