王玮[1]2002年在《逆转录病毒介导的转基因技术在白血病耐药机理研究中的应用》文中研究表明一急性白血病中MDR1、MRP和Bcl-2基因表达及其临床意义 以MDR表型显着、具有MDR1／P-gp高表达的白血病细胞株HL-60／VCR为参照，应用敏感的DIG掺入半定量RT-PCR方法，检测了9种肿瘤和白血病细胞株以及54例急性白血病患者MDR1基因表达，建立了较为客观、量化的判定阳性的指标，同时采用常规RT-PCR方法检测了这批患者MRP和Bcl-2基因的表达。结果表明，54例急性白血病中，16.7％(9／54)的患者MDR1／MRP／Bcl-2叁基因表达均为阳性，46.3％(25／54)的患者MDR1／MRP／Bcl-2叁基因表达均为阴性。46例资料完整的白血病患者中，叁基因表达均阴性者其完全缓解率(CR)为80.0％，而MDR1／MRP或MDR1／MRP／Bcl-2共表达者则无一人获得CR(P＜0.005)。单基因分析表明MDR1、MRP、Bcl-2基因表达阳性率分别是28.3％、41.3％和47.8％，其中MDR1阳性者CR率15.4％，明显低于MDR1阴性者的CR率(72.7％， P＜0.005)；MRP阳性CR率26.3％，明显低于MRP阴性者的CR率(77.8％，P＜0.005)；Bcl-2阳性CR率36.4％，亦低于阴性CR率75.0％(P＜0.05)。MDR1／MRP或MDR1／MRP／bcl-2共表达的患者临床上不易获得CR。以上结果表明，白血病患者的耐药除了与MDR1高表达密切相关外，还与非P-糖蛋白介导的MRP及bcl-2表达相关。 二转移MDR1基因的白血病细胞K562／MDR的耐药特性研究 采用PA317／HaMDR细胞的病毒上清转染白血病细胞K562，获得了MDR1转基因细胞K562／MDR，PCR和RT-PCR证实了原病毒在靶细胞中的整合和表达。FCM进一步分析了K562／MDR中MDR1基因产物P-gp以及MRP、LRP、BCRP 逆转录病毒介导的转基因技术在白血病耐药机理研究中应用 摘 要 以及GST。等多种与非经典耐药相关蛋白的表达。结果发现，与K562母株相比， K562／MDR细胞高表达P－gp，gyl增加了96．2％，卜性表达率从0．58％上升至 98．0％；其它耐药蛋白的gyl和阳性率均无明显差异。MTT试验证实K562／MDR 细胞对化疗药物的耐受性，CsA与CRE单独或联合使用可逆转其耐药表型。以 上结果表明K562／MDR细胞的耐药表型全为外源性MDRI基因表达的P唱p所致 的经典MDR表型，而非其它耐药相关蛋白所介导，基因修饰的耐药细胞株由于 其单因素耐药更能作为理想的研究多药耐药逆转的体外实验模型。 叁 逆转录病毒介导的反义MDRI基因的转移 以HL60／VCR细胞总KNA为模板，自行设计引物，应用RTPCR方法获得 MDRI基因CDNA片段，利用分子克隆方法反向插入逆转录病毒载体pLXSN， 获得了携带反义MDRI基因的重组逆转录病毒载体pLASSN，应用脂质体转导 包装细胞，单、双噬型包装细胞的交互感染，获得较高滴毒的病毒上清成功转染 耐药靶细胞K562／MDR，PCR和RTPCR证实了反义MDRI基因在靶细胞中的 整合和表达。巢式PCR和补救分析证实双噬型重组病毒的安全性，表明逆转录 病毒介导的基因转移系统以其高效、安全、稳定整合等优点，对转移反义基因也 不失为一个较好的实验系统。希望通过逆转录病毒介导的MDRI基因转移从基 因水平阻断MDRI基因的转录和翻译，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从 而达到杀灭肿瘤细胞的目的。 四MDRI基因反义RN＾抑制P飞P表达及功能的研究 首先通过细胞计数配合台盼蓝染色测定K562MDWLAASN的生长曲线，半 定量RTPCR分析内源性MDRI基因的表达，FCM测定了P唱p的表达，结果表 明，K562MDRjLAASN细胞的生长未受反义基因转移的影响；MDRI基因mRNA 的转录基本不受的影响，而P唱p的表达明显受抑，与对照相比，其相对荧光强。＿度Afl下降了86o，阳性率也从96．20降至52．60，表明MDRI反义RNA对靶 基因的影响发生在转录后的水平上。采用细胞形态、MTT检测、集落生成试验。 DNA Ladder分析及凋亡相关基因的表达等检测方法，分析了多种药物对 ，K562MDR／LASSN细胞增殖和凋亡的作用。结果显示，当化疗药物VCR、COL＼4’＊ 作用于K562MDR／LASSN时，它对药物的耐受性比耐药对照细胞明显下降，如 ICS。VCR、IC50C。Lb耐药对照K562MDR／NC＊细胞分别下降了 56．7％和 56＊％； －－多 逆转录病毒介导的转基因技术在白血病耐药机理研究中应用 摘 要 在 100 p g／L VCR作用下，K562MDR／LASSN细胞的集落生成能力比对照细胞下 降了92．4％；随着VCR作用浓度的增加、作用时间的延长，K562MD肌A驼N 细胞比对照在更早的时间或更低的浓度上出现DNA梯带。以上结果证实了反义 RNA的有效性。反义KNA的表达，抑制了P唱p的表达和功能，以致细胞内被 泵出的药物减少，蓄积增加，使化疗药物的细胞毒效应得到有效
潘请[2]2016年在《miR-125a-3p在急性髓系白血病患者外周血中的表达及作用机制研究》文中研究表明目的:急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种常见的高度异质性的血液系统恶性肿瘤,其特征为髓系造血祖细胞克隆增殖异常、分化障碍、凋亡受阻。micro RNAs(mi RNAs)是一种小分子非编码RNA,在细胞增殖、转移、凋亡和分化等生物学进程中发挥着重要的调控作用。近年来研究报道了mi RNAs的异常与急性髓系白血病的发生、发展密切相关,并为mi RNAs应用于白血病的诊断和治疗提供新依据。本课题检测mi R-125a-3p在不同病期、不同分型急性髓系白血病患者外周血中的表达情况,并研究mi R-125a-3p诱导AML细胞凋亡和分化、抑制AML细胞迁移的作用,初步探索其作用机制。方法:(1)采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测143例AML患者外周血标本中mi R-125a-3p的表达水平,其中,初诊组64例,复发组15例,治疗组64例。另选择16例正常人作为对照。随机选择初诊组中7例患者进行mi R-125a-3p动态监测。(2)使用0.1μM维甲酸、10μM地西他滨、1μM叁氧化二砷、10μM阿糖胞苷四种药物处理人急性髓系白血病细胞株THP-1、HL-60、NB4,共同孵育24小时,采用q RT-PCR方法检测mi R-125a-3p表达水平。(3)构建mi R-125a-3p慢病毒过表达载体、慢病毒空载体(Non-carrier,NC)分别转染THP-1细胞,转染后培养48-72小时,采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b,CD14和细胞凋亡率,分光光度法检测caspase-3、caspase-8、caspase-9酶活性,Transwell方法检测迁移能力,q RT-PCR检测细胞分化和凋亡相关基因的m RNA水平变化。结果:(1)与正常对照组比较,初诊组和复发组患者外周血中mi R-125a-3p的表达水平明显减低,且差异有显着性(P<0.05);而治疗组患者外周血中mi R-125a-3p的表达水平较初诊组显着升高(P<0.05),接近正常人水平。在各型AML患者中(除M3外),初诊组mi R-125a-3p水平较正常对照组均有不同程度的降低(P<0.05),M0型最低,M5型次之;治疗组mi R-125a-3p水平较初诊组显着上调(P<0.05),甚至高于正常对照组水平,以M2、M4型增高较为明显。7例患者mi R-125a-3p动态监测结果显示,在治疗过程中,mi R-125a-3p表达一直维持在较高的水平;1例患者缓解4~5个疗程后复发,其mi R-125a-3p表达再次降低。(2)叁氧化二砷、地西他滨处理叁种细胞株后mi R-125a-3p表达都上调,以叁氧化二砷处理后增加较为明显。(3)流式细胞术检测发现,与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞表面CD11b,CD14表达和凋亡率均显着增加(p<0.05)。分光光度法检测结果显示,与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9活性显着增加,提示细胞凋亡显着增加(p<0.05)。Transwell方法检测发现,与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞迁移显着减慢(p<0.05)。进一步采用q RT-PCR检测细胞分化和凋亡相关基因,发现与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组细胞分化相关的转录因子ATF-2表达明显增加(p<0.05);与空载体组相比,mi R-125a-3p过表达组促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9表达均增加(p<0.05),抗凋亡基因Bcl-2、c-myc、NF-KB、Bcl-xl表达均减少(p<0.05)。结论:(1)mi R-125a-3p在初诊AML患者外周血中低表达,在诱导治疗过程中其表达升高,复发时再次降低,mi R-125a-3p有望成为AML诊断、疗效评价和复发监测的指标。(2)AML化疗药物叁氧化二砷、地西他滨可上调mi R-125a-3p表达,尤以叁氧化二砷为显着。(3)过表达mi R-125a-3p能促进THP-1细胞分化和凋亡,抑制细胞迁移,其诱导细胞分化的机制可能与上调细胞分化相关的转录因子ATF2相关,而诱导细胞凋亡则是通过激活线粒体途径完成,NF-KB通路、c-myc基因可能参与了mi R-125a-3p诱导的细胞凋亡。
参考文献：
[1]. 逆转录病毒介导的转基因技术在白血病耐药机理研究中的应用[D]. 王玮. 苏州大学. 2002
[2]. miR-125a-3p在急性髓系白血病患者外周血中的表达及作用机制研究[D]. 潘请. 蚌埠医学院. 2016