3 成都中医药大学附属医院内分泌科 四川 成都610000
摘要： 目的：观察人参总皂苷联合大鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）对高糖损伤INS-1细胞胰岛素分泌功能的影响。方法：将体外培养INS-1细胞给予连续性高糖刺激后与BM-MSCs进行间接共培养。分为正常对照组、INS-1细胞损伤模型对照组、无TSPG共培养组、 TSPG共培养组，ELISA检测各组INS-1细胞基础胰岛素分泌、葡萄糖刺激的胰岛素分泌。结果：与正常对照组相比，高糖损伤模型组INS-1细胞基础胰岛素和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量均减少。与损伤对照组比较，共培养各组INS-1细胞基础胰岛素和葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加（P﹤0.05）。与无TSPG共培养组比较，不同浓度的TSPG干预共培养组基础胰岛素的分泌量无明显差异，而100和200 mg/L TSPG干预共培养组葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加（P﹤0.05）。结论： BM-MSCs能促进高糖损伤INS-1细胞胰岛素分泌功能的恢复，一定浓度的TSPG能促进这种作用。
关键词：高糖；骨髓间充质干细胞；胰岛β细胞；共培养；人参总皂苷； PDX-1
1.材料与方法
1.1细胞与主要试剂
大鼠骨髓间充质干细胞，大鼠胰岛素分泌细胞INS-1，人参总皂苷，CCK-8试剂盒，大鼠Insulin ELISA 试剂盒。
1.2方法
1.2.1 INS-1细胞高糖损伤模型的建立
将INS-1细胞用含10%胎牛血清的INS-1细胞专用培养基接种于96孔板，培养于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞融合达70%改用无血清的RPMI1640基础培养液同步化24h。分为空白组、对照组、葡萄糖干预组。
1.2.2 TSPG干预浓度的选择：
细胞培养同前。分组：空白组：RPMI1640基础培养液；对照组：RPMI1640基础培养液培养的INS-1细胞；TSPG干预组：分别含有50、100、200、400、800mg/L的TSPG干预基础培养液培养。
1.2.3 实验分组
待培养瓶中INS-1细胞生长达90%融合后，均匀接种于6孔Transwell共培养小室底层，待细胞贴壁后逐渐换成含10%FBS的RPMI1640基础培养液，培养至细胞生长达50%融合后，用无血清的RPMI1640基础培养液同步化处理24小时，分为以下6组：正常对照组、高糖损伤对照组、无TSPG干预的共培养组、50mg/L TSPG 干预的共培养组、100mg/L TSPG 干预的共培养组、200mg/L TSPG 干预的共培养组。共培养96小时。
1.2.4统计学处理
用SPSS 19统计软件处理，所有数据均以均数±标准差表示（x?±s），多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD法。p<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1. 培养的正常大鼠胰岛素分泌细胞INS-1细胞及大鼠骨髓间充质干细胞形态
与对照组相比，20、30及40mmol/L浓度的葡萄糖浓度干预后，细胞OD值下降（P﹤0.05），参考国内外相关研究，选取当干预时间固定在72小时，对INS-1细胞功能亦有明显损伤作用的30mmol/L的葡萄糖浓度作为干预浓度，建立INS-1细胞的高糖损伤模型。（见表1）
2.2 不同浓度TSPG对INS-1细胞活力的影响
表2不同浓度TSPG对INS-1细胞活性的影响（x?±s，n=4）
组别 OD值
空白组 0.286±0.005
对照组 0.557±0.065
50mg/L TSPG组 0.563±0.092
100mg/L TSPG组 0.522±0.062
200mg/L TSPG组 0.600±0.074
400mg/L TSPG组 0.339±0.007﹡＃☆△
800mg/L TSPG组 0.322±0.017﹡＃☆△
与对照组比较，400及800mg/L TSPG组细胞OD值明显下降，P﹤0.05，差异有统计学意义，提示这一浓度范围内的TSPG能抑制INS-1细胞的活力及增殖。50、100及200mg/L TSPG组的组间比较及其与对照组OD值比较，差异无统计学意义。
2.3ELISA检测INS-1细胞基础胰岛素分泌及葡萄糖刺激的胰岛素分泌
结果显示：与正常对照组相比，高糖损伤的各模型组INS-1细胞基础胰岛素和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。与损伤对照组比较，共培养各组细胞基础胰岛素和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。与无TSPG共培养组比较，不同浓度的TSPG干预共培养组基础胰岛素的分泌量无明显差异，100和200 mg/L TSPG干预共培养组葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加。（见表3）
表3 各组INS-1细胞基础胰岛素分泌及葡萄糖刺激的胰岛素分泌（x?±s, n =3）
讨 论：
本实验结果显示，高糖损伤模型组INS-1细胞无论是基础胰岛素分泌还是葡萄糖刺激后的胰岛素分泌较正常组而言都明显减少，间接证实了建模成功。因此，通过本实验我们发现：与BM-MSCs共培养，能增加高糖损伤INS-1细胞的基础胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌；而一定浓度的TSPG干预下，BM-MSCs增强高糖损伤INS-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌。BM-MSCs及TSPG促进胰岛细胞功能修复的机制我们也在同步的试验中通过测定细胞因子及胰岛功能的关键转录因子进行进一步的研究，以期为干细胞及中药成分应用于糖尿病的治疗提供理论依据。
参考文献：
1.王建伟,李荣,王亚平等.人参总皂甙体外诱导CD34+造血干／祖细胞增殖的作用[J]. 解剖学杂志,2006, 29(4):430-432.
2.王莎莉,李英博,王亚平等.人参总皂苷对人胚胎神经干细胞增殖及定向诱导为多巴胺能神经元的影响[J]. 中国中药杂志, 2007, 32(13):1310-1313.
3.凌婉彬. 人参总皂苷联合大鼠骨髓间充质干细胞对高糖损伤INS-1细胞的作用[D]. 泸州医学院, 2013.
论文作者:1凌婉彬 陈杨2, 陈秋3（通讯作者）
论文发表刊物:《医师在线》2018年2月上第3期
论文发表时间:2018/5/7
标签：胰岛素论文; 细胞论文; 葡萄糖论文; 损伤论文; 基础论文; 浓度论文; 对照组论文; 《医师在线》2018年2月上第3期论文;