陈义 陈敏 福建省莆田学院附属医院眼科 福建 莆田 ３５１１００
【摘要】 目的 在传统组织块贴壁法培养的基础上,寻找一种改良的脐带间充质干细胞培养方法.方法 将脐带组织制作成约０．３X０．７cm２大小组织片, 称之为:脐带组织片,进行悬浮培养(改良法:组织片悬浮法);观察其形态结构、生长特性;并进行成骨细胞诱导培养,测定多向分化潜能.结果 采用改良法成功培养出脐带间充质干细胞;其生物学特性与传统的组织块贴壁法培养的细胞一致.并证实了其干细胞特性.结论 改良法较传统组织块贴壁法简便,可靠, 成功率高. 【关键词】 脐带间充质干细胞; 培养; 组织片悬浮法【中图分类号】R７１４．５【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０２３７－０２
近年来组织工程角膜研究的不断兴起,脐带间充质干细胞作为组织工程种子细胞有着广阔的应用前景.本实验旨在寻找一种改良的脐带间充质干细胞培养法.
１ 材料与方法
１．１ 试剂 DMEM/F１２培养基,胎牛血清,EDTA,地塞米松,维生素C,β－甘油磷酸钠. １．２ 脐带 脐带取自产科手术健康足月胎儿,在超净台内,去除残留的血液、脐带外膜组织、动静脉后待用.
１．３ 组织片悬浮法(改良法) 将上述脐带组织剪成约０．３X０．７cm２片状,我们称之:脐带组织片.将组织片放入培养皿中,每个培养皿４片,加人适量含胎牛血清的培养基中,此时组织片处于悬浮状态,培养皿放置恒温培养箱,温度３７℃,含５％CO２.间断对培养皿换液.定期观察. １．４ 组织块贴壁培养法(传统方法) 将脐带组织剪碎成细小组织块,接种培养皿中,干燥贴壁后加人适量改良培养同样培养基,培养皿放置于培养箱中. 间断对培养皿换液.定期观察. １．５ 向骨细胞定向诱导分化 将胎牛血清、地塞米松、DMEM/F１２培养液、β －甘油磷酸钠、维生素C 以不同浓度制成成骨诱导培养基.取传代３~５代细胞,按５×１０５个/片密度接种在２５cm２培养皿中.培养１d后,加入上述培养基进行诱导,时间２１d,观察其变化.２１d后用ALP 钙钴法染色.
２ 结果
２．１ 组织片悬浮法(改良法) 组织片悬浮于培养皿中(图a),应用改良法培养１０d左右,在培养皿底部,见细胞比较均匀贴附,单层分布(图b).部分细胞短杆状,考虑为刚贴壁不久的细胞,大部分呈典型成纤维状,培养皿中无造血细胞或内皮细胞形态样细胞混合,细胞成分单纯.５d后,细胞生长融合(图c), 为形态一致长梭形成纤维细胞.此时将组织片移除.用０．２５％胰蛋白酶对融合后的细胞进行消化传代,接种于培养皿中,传代后细胞生长旺盛,３d后传代细胞即生长至９０％融合.
２．２ 传统组织块贴壁法传统贴壁法培养约１０d,组织块边缘有细胞爬出,贴附培养皿底部(图d),形态为长梭形成纤维细胞,同改良法培养一致.所培养细胞由组织块向周围扩散生长,５d后达到融合.此时将组织块移除.用胰蛋白酶对融合后的细胞进行消化传代,接种于培养皿中,传代后细胞生长旺盛,３d 后亦达到９０％左右融合.
２．３ 成骨细胞诱导结果鉴定在成骨细胞诱导２１d后,细胞形态转化为多角形,部分为不规则形态;碱性磷酸酶(ALP)钙钴法染色显示细胞呈阳性反应, 细胞胞质内钙质沉积经染色呈黑色.
３ 讨论
脐带间充质干细胞具有取材方便、来源广泛、且具多项分化潜能等优点受到了研究者的青睐[１－５].已有学者将其应用于组织工程角膜方面的研究[６]. 作者之前的应用改良方法培养兔角膜基质细胞的研究[７],为本实验改良法的研究打下基石. 目前有众多学者自脐带的华通氏胶组织中培养出脐带间充质干细胞[８．９], 比较传统的有组织块贴壁培养法和胰蛋白酶消化培养法,作者在实验初期,参考众多文献,反复多次尝试应用以上传统方法进行培养,发现实验条件很难掌握,成功率极低,如胰蛋白酶消化法,酶的浓度,血清浓度,消化时间,离心转速等,摸索很长时间,才偶然培养出原代干细胞,且成功率低,实验可重复率低; 组织块贴壁法则存在组织块贴壁不牢,易漂浮脱离培养皿等问题,即使组织块贴壁牢固,经过重复多次实验,成功率仍然极低.本文作者在前期应用改良方法培养兔角膜基质细胞—基质片悬浮法取得成功,可重复率极高,故尝试应用该改良方法—脐带组织片悬浮法培养脐带间充质干细胞,发现此方法成功率亦高,实验极具可重复性.该方法应注意将脐带华通氏胶分离干净,去除脐带上积血、脐带外膜及血管组织,并将脐带剪成适当大小,过大容易沉至培养皿底部,过小则如传统组织块贴壁后漂浮一样,导致实验失败.本实验对培养基要求较高,尽量采用良好的培养基及胎牛血清.加至培养皿中的培养基量亦应注意,保持组织片下方距离培养皿底部约０．８cm 左右.原代细胞培养至生长融合后,可移除组织片可再次使用,进一步培养下一批细胞进行其它步骤的研究,将组织片重复利用,减少脐带取材次数,节约实验时间. 本实验应用改良方法及传统组织块贴壁方法成功培养出脐带间充质干细胞,将细胞向骨细胞定向诱导分化,证实其具备多向分化潜能,具有干细胞特性.改良方法较传统方法实验条件简单,易于掌握,可重复率高. 参考文献[１] CapelliC,GottiE,Morigi M,etal．Minimally manipulated wholehumanumbilicalcordisarichsourceofclinical－gradehumanmesenＧchymalstromalcellsexpandedinhumanplateletlysate[J]．Cytotherapy．[ ２０１１;１３(７):７８６－８０１． ２]SarugaserR,LickorishD,BakshD,etal．HumanumbilicalcordperivascuＧlar(HUCPV)cells:asourceofmesenchymalprogenitors[J]．Stem[ Cells．２００５;２３(２):２２０－２２９． ３]KitaK,GauglitzGG,PhanTT,etal．Isolationandcharacterizationofmesenchymalstemcellsfromthesub－amniotichumanumbilicalcord[ liningmembrane[J]．StemCellsDev．２０１０;１９(４):４９１－５０２． ４]FanCG,ZhangQJ,ZhouJR．Therapeuticpotentialsofmesenchymalstemcellsderivedfromhumanumbilicalcord[J]．StemCellRev．２０１１;７(１):[ １９５－２０７． ５]TsaiPC,FuTW,ChenYM,etal．ThetherapeuticpotentialofhumanumＧbilicalmesenchymalstemcellsfrom Wharton＇sjellyinthetreatmentof[ ratliverfibrosis[J]．LiverTranspl．２００９;１５(５):４８４－４９５． ６]祁冰．人脐带间充质干细胞向角膜内皮样细胞分化的初步实验研究[D]．暨南大学２０１４ [７]陈义,侯光辉,吴静,徐锦堂．培养兔角膜基质细胞的一种新方法—悬浮基质片法[J]．眼科新进展YankeXinjinzhan２０１０;３０(２):３０－３３． [８]TroyerDL,Weiss ML．Wharton’sjelly－derivedcellsareaprimitive[ stromalcellpopulation[J]．StemCells,２００８,２６(３):５９１－５９９． ９]KestendjievaS,KyurkchievD,TsvetkovaG,etal．CharacterizationofmesＧenchymalstemcellsisolatedfromthehumanumbilicalcord [J]．CellBiolInt,２００８,３２(７):７２４－７３２．
论文作者:陈义 陈敏
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/3
标签：脐带论文; 培养皿论文; 组织论文; 细胞论文; 干细胞论文; 培养基论文; 方法论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;