木国法 郭正红
【摘 要】 目的 研究轮状病毒流行株NSP4基因变异特征。方法 对2015年7-11月从云南省昭通市获得的6株人轮状病毒流行株的NSP4基因用RT-PCR进行扩增,并进行测序，测序结果应用DNAassist和Clustal-mp以及MEG4.0软件进行序列分析,通过昭通毒株RV NSP4基因与来自GenBank Database的4株人RV (Wa、Hochi、 KUN、AU-1)和3株动物RV(OSU、SAll、 EW)及我国不同地区的45株A组轮状病毒NSP4基因进行比较。结果 昭通地区6株轮状病毒株的NSP4基因都为Wa型,与来自Genbank Database的4株人RV (Wa、Hochi、 KUN、AU-1)和3株动物RV(OSU、SAll、 EW)氨基酸同源性分别为95.7%、、94.2%、86.4%、84.8%和91.2%、82.3%、48.3%,与中国各地区流行株同源性均在86.4%以上, 据此可将51株RV NSP4分为2组,分别以Wa株和KUN株为代表,其中以Wa组为主,组内同源分别为92.6%-100%和96.5%-100%。氨基酸进化树提示在Wa组内包括3个亚组。结论 6个昭通地区轮状病毒株的NSP4基因都为Wa型。我国流行株NSP4基因主要可分为Wa组及KUN组,NSP4的变异与年份有关而与地域关系不密切。
【关键词】 轮状病毒； 非结构蛋白4； 腹泻； 患儿
Genetic characterization of the Zhaotong, Yunnan rotavirus NSP4 compared with other 45 epidemic strains from China. Guofa Mu Zhenghong Guo. Department of pediatrics, The first People’s Hospital of Zhaotong City, Yunnan ,China 657000
【Abstract】 Objective To clarify the features of NSP4 gene variation among epidemic strains of human rotavirus in China. Methods NSP4 genes from 6 epidemic strains of human rotavirus isolated in ZhaoTong City,Yunnan from July to November in 2015 were amplified with RT-PCR. Then NSP4 specimens’ cDNAs were sequenced and analyzed by DNAassist 、Clustal-mp and MEG4.0 software. The 6 specimens’ NSP4 cDNAs sequences were compared with other 45 RV NSP4 cDNAs sequences available from China in the Genebank Datebase to clarify the features of NSP4 gene variation among epidemic strains of human rotavirus in China. Results The NSP4 Genotype of the 6 ZhaoTong RV strains were Wa strains .The amino acid homologies to the 4 HRV standard strains ( Wa、Hochi、 KUN、AU-1) and 3 animal RV( OSU、SAll、 EW)were 95.7%、94.2%、86.4%、84.8% and 91.2%、82.3%、48.3% respectively. Compared with the epidemic strains of other different areas of China, the amino acid homology of the NSP4 gene were over 86.4%. Based on the variation of amino acid sequence the 52 virus strains can be divided into two groups represented by Wa and KUN with the homology of 92.6%-100% and 96.5%-100% within each group respectively. The Wa group could further be separated into three subgroups, according to the diversity between those strains and the characterization in the highly variable domain. Conclusion The NSP4 genotype of the 6 ZhaoTong RV strains were Wa strains. The NSP4 gene of human rotavirus epidemic strain in China can be divided into Wa and KUN two groups. Samples isolated in the same year but not in the same area shared higher homology.
【Key words】 Rotavirus NSP4 Diarrhea Infantile
A组轮状病毒是引起全世界婴幼儿严重腹泻的主要病原体[1]。世界卫生组织统计每年大约引起61.1万（45.4-70.5万）婴儿和儿童死亡，特别是在发展中国家[2]。RV是具有双层衣壳的完整毒粒，这种内外双层的衣壳颗粒是病毒感染型颗粒[3] ，直径约为65～75nm，为二十面体结构，由132个壳粒排列成轮状，病毒颗粒由外部衣壳、内部衣壳和核心三层组成。病毒体的核心是含11个节段的dsRNA基因组，这11个RNA片断分别编码六个结构蛋白﹙VP1～VP4，VP6，VP7﹚和五个非结构蛋白﹙NSP1～NSP5﹚[4]。
NSP4是由A组RV第10位基因编码的非结构蛋白，是细胞内双层颗粒缺少外壳蛋白VP4、VP7的受体，它有两个功能结构域，一个用于结合双层颗粒，另一个结合VP4，通过缺失突变和针对胞浆区域的单克隆抗体研究发现两者分别定位于161～175 位氨基酸和112～148 位氨基酸。NSP4在病毒形态发生学上作用主要是协助病毒颗粒以出芽方式穿过内质网膜[5]。NSP4可能与病毒的致病性有关，Ball等首次报道用重组的猴轮状病毒SAII株NSP4或其合成肽段NSP4114-135， 经腹膜或回肠内注射给6-10日龄小鼠能诱导剂量有关的依赖性腹泻，而其抗血清具有减轻或预防腹泻的作用，从而认为该区域的氨基酸序列可能与病毒毒力有关。1996年Ball 等研究结果提示NSP4 的作用类似内毒素，通过钙离子依赖性的信号转导途径激活氯离子分泌[[6]。有研究显示NSP4具有明显的抗原性，RV感染后NSP4能刺激免疫反应，并且NSP4变异小，相对较保守，有可能成为发展疫苗的候选基因[7-10]。因此阐明NSP4基因变异特点对于深入研究RV致病机制和疫苗研究均具有重要意义。本研究对昭通地区2015年7-11月婴幼儿腹泻A 组RV毒株NSP4基因进行测序及分型,并将昭通毒株的非结构蛋白NSP4基因与昆明2006-2008年及国内其他地区(上海、广州、北京、深圳、沈阳、台湾、新乡)97、98年的非结构蛋白NSP4基因特征进行比较，主要探讨NSP4基因变异特征，为研制适合本地区的安全有效的RV疫苗提供流行病学依据,并对轮状病毒的毒力进行初步研究。
材料和方法
1．标本来源 粪便标本来源于2015年7月—2015年11月昭通市符合临床诊断标准[11]的秋冬季腹泻患儿, 参比的NSP4序列来源于2006-2008年昆明医学院第一附属医院儿科秋冬季腹泻患儿RV NSP4测序结果及国际核酸蛋白数据库(GenBank Datebase) 。
2．轮状病毒RNA提取及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 将标本用pH值＝7.6的Tris液稀释为10％，将粪便悬夜置于1.5ml无菌离心管中，3000r/min离心30min,取上清液置于另一1.5ml无菌离心管中备用，用病毒∕液体样品的RNA∕DNA抽提试剂盒（购自上海华舜工程有限公司）抽提RNA，5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测11个节段dsRNA,阳性标本用于NSP4基因分析。
3．NSP4 cDNA扩增、克隆、及序列分析 采用RT-PCR方法扩增cDNA片段,上下游引物分别为NSP4Beg5’-TGTTCCGAGAGAGCGG-3’( 16~30)及NSP4End 5’-GACCATTCCTTCCATTAAC-3’(721-740), 将扩增出的NSP4的725bpcDNA采用纯化试剂盒按照说明操作纯化后送北京百泰克公司进行测序。
4．数据分析 NSP4的725bpcDNA采用DNAstar软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列，各序列的同源性比较采用Clustal-mp；种系进化树计算采用MEGA4.0软件。用于参比的NSP4序列来源于国际核酸蛋白数据库（Genebank Datebase)及2006-2008年昆明医学院第一附属医院儿科秋冬季腹泻患儿RV NSP4测序结果。
结 果
1．轮状病毒NSP4cDNA的克隆 收集的103份婴幼儿腹泻标本中,有6份经RT-PCR扩增得到了这些标本的全长NSP4 cDNA,并进行了核苷酸序列分析,所有毒株基因长度均为725bp,所有序列都只含有一个开放读码框架,编码一个175氨基酸的蛋白。对测序的碱基序列使用DNAstar软件进行翻译，6株昭通RV流行株NSP4的175个氨基酸位点全部相同,所有位点无变异,氨基酸序列结果显示如图示：
MDKLADLNYTLSVITLMNDTLHSIIQDPGMAYFPYIASVLTVLFTLHKASIPTMKIALKTSKCSYKVIKYCIVTIVNTLLKLAGYKEQVTTKDEIEQQMDRIVKEMRRQLEMIDKLTTREIEQVELLKRIHDNLITRPVDTIDMTKEFNQKNIKTLDEWENGKNPYEPIEVTASME
2．NSP4基因的变异分析
将收集的6株昭通标本RV NSP4基因与我国不同地区(昆明、上海、广州、北京、深圳、沈阳、台湾、新乡)不同年份的流行毒株及4株人轮状病毒(Wa、 Hochi、AU-1、KUN) 和3株动物RV(EW、OSU、SAll)的RV NSP4基因进行分析,并构建氨基酸进化树,可将我国各地的51株RV NSP4分为2组,各组分别以Wa株及KUN株为代表,分为Wa组及KUN组,进而根据氨基酸进化树特点,发现在Wa组内明显存在3个亚组,将其称为Wa-1、Wa-2、Wa-3组。
2006年、2015年毒株全部为Wa-1组; 98年毒株除98B48属KUN组外全部为Wa-1组;07年毒株除07KM1属KUN组外全部为Wa-1组; 08年毒株除08KM6属KUN组外全部为Wa-1组; Wa-1组组内同源性为98.7%-100%。6株昭通毒株与06KM3、06KM4、06KM7、06KM8、07KM2、07KM3、07KM4、07KM5、07KM6、07KM7、08KM1、08KM2、08KM3、08KM4、08KM5、98SH44、98G34、98SH49、98G4、98G7同源性为100%,所有氨基酸位点无变异;与06KM1、06KM2、06KM5、06KM6同源性为99.4%,氨基酸变异位点仅为147(T-I);与98B31、98GB35、98B39同源性为99.4%,氨基酸变异位点分别为118(M-T) 、149(D-N) 、58(P-S);与98B56同源性为98.7%,氨基酸变异位点为69(C-R) 、99(D-V) 。
97年毒株(97SZ37、97S36、97B55、97ch55) 为Wa-2组。氨基酸变异位点较多, 与昭通RV毒株NSP4氨基酸位点变异集中在82(V-I) 、141(I-V) 、147(T-V) 、151(T-S) 、167(N-S) 、147(T-V)等。
97年毒株(97H4、97H7、97H12、97B6、97B53、97B11、97B31、97ch32) 为Wa-3组。与昭通RV毒株NSP4同源性为92.8%-94.1%,与昭通RV毒株NSP4氨基酸变异位点集中在82(V-I) 、143(R-K) 、145(V-I) 、146(D-N) 、147(T-I) 、148(I-L)。
98B48、97SHRV、97SZ8、07KM1、08KM6为KUN组,组内同源性为96.5%-100%,与昭通RV毒株NSP4氨基酸位点变异较多,集中在8(D-E) 、10(L-F) 、11(A-T) 、29(I-T) 等。
通过分析可初步判断NSP4基因型的变异与年份有关而与地域分布无明显关系,不同地域但相同年份的毒株多属同一组。相同年份RV毒株NSP4基因推导的氨基酸序列同源性较高,并且NSP4变异小，相对较保守。
讨 论
将收集的6株昭通标本RV NSP4基因与我国不同地区(昆明、上海、广州、、北京、深圳、沈阳、台湾、新乡)不同年份的流行毒株及4株人轮状病毒(Wa、 Hochi、AU-1、KUN) 和3株动物RV(EW、OSU、SAll)的RV NSP4基因进行分析并构建氨基酸进化树,可将我国各地的51株RV NSP4分为Wa组及KUN组2组,在Wa组内存在Wa-1、Wa-2及Wa-3三个亚组,Horie[12]将人的RV NSP4基因分为3组,分别以Wa、AU-1、KU株为代表,本研究我们也与AU-1做了比较,但同源性均小于84.8%,没有与AU-1同源性较高的序列,我国HRV流行株NSP4基因仅存在Wa组及KUN组,相对较保守,有人对从美国分离的39株HRV的NSP4基因分析发现,同年份分离的HRV毒株有更高的同源性,而与地域无关[13],这与我们的研究相符。
Johansen[14]等研究证实了NSP4能刺激机体体液免疫和细胞免疫,尤其是促进了具有细胞毒性的T细胞亚群的增殖反应,且自然感染和接种RV疫苗的婴幼儿血清中的NSP4IgA抗体较少,而成人血清中的NSP4IgA抗体水平相对较高,这表明RV感染后有针对NSP4蛋白的免疫反应,提示NSP4同样具有抗原性。Ball[15]等研究发现给幼鼠口服特异性的NSP4抗体可以预防腹泻发生,并提出新生儿鼠自然感染RV或接种疫苗后所产生的NSP4抗体可以防治RV的再次感染。在黄永坤[16]等的动物模型研究中,给12日龄幼鼠注射等效剂量的完整RV或NSP486-175残基都能导致幼鼠腹泻,在腹泻过程中若使用抗NSP4抗体干预,则使用抗NSP4抗体干预组的预后明显好于对照组,干预组病程明显缩短,脱水程度减轻,死亡率明显下降。同样,若给两组幼鼠中的一组提前使用抗NSP4抗体干预,然后再给两组幼鼠同时注射等效量的完整RV或NSP486-175残基,则预先使用抗NSP4抗体组的腹泻发病率、死亡率、脱水程度均明显小于对照组,上述实验说明:(1)NSP4与RV致病性有关,能导致幼鼠腹泻。(2) 抗NSP4抗体能预防及治疗RV所致腹泻,可缩短病程、降低死亡率、减轻脱水程度。故NSP4可能会成为RV疫苗研制的一个候选基因。
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论文作者:木国法,郭正红
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期
论文发表时间:2016/7/18
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