（中国人民解放军第二O八医院中医科 吉林 长春 130062）
【摘 要】目的：疏筋壮骨汤对去卵巢大鼠骨质疏松的治疗作用，并探讨其作用机制。方法：50只雌性Wistar大鼠随机分成假手术组、模型组、尼尔雌醇组、疏筋壮骨汤组和疏筋壮骨汤+尼尔雌醇组。各组连续灌胃12周，实验过程称体重，测定血钙（Ca）、血磷（Pi）和N-端骨钙素(N-OT)含量；采用ELISA检测血清中骨保护素（OPG）和核因子κ B受体活化因子配体（RANKL）蛋白表达水平。结果：疏筋壮骨汤能明显提高动物股骨中心及远心端骨密度(P<0.05)；明显升高血清Ca、Pi和N-OT含量(P<0.05)；显著增加血清OPG含量，同时降低RANKL含量(P<0.05)。结论：疏筋壮骨汤能够改善大鼠的骨质疏松，作用机制可能通过上调OPG和下调RANKL蛋白表达实现的。
【关键词】疏筋壮骨汤；骨质疏松；骨保护素；核因子κ B受体活化因子配体
【中图分类号】R711.75 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0425-02
Mechanism of Shujinzhuanggu soup on osteoporosis in ovariectomized rats
Wang Haiyan，Sun Yan, Mo Dan, Chen Lizhong
Department of traditional Chinese medicine, 208 hospital of China people's Liberation Army, Changchun, Jilin 130062
【Abstract】Abjective To investigate the mechanism of Shujinzhuanggu soup on osteoporosis in ovariectomized rats．Methods 50 female Wister rats were divided randomly into five groups：sham operation group，model group，nilestriol group, shujinzhuanggu soup group and shujinzhuanggu soup combined with nilestriol group. Animals in each group were given test substance for 12 weeks. Serum calcium (Ca) , phosphorus(Pi) and Osteocalcin(N-OT) content were detected. Serum osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) protein expression level were detected using ELISA method. Results The experiment suggested that the shujinzhuanggu soup could increase the bone mineral density of bone mineral in the central part and end part of the femur significantly(P<O.05), elevate the level of serum Ca、Pi和N-OT content(P<0.05), increase the serum OPG content and reduce the level of serum RANKL (P<0.05). Conclusion Shujinzhuanggu soup can improve the symptoms of osteoporosis and the mechanism may be expressed by up-regulating OPG levels and down-regulating the RANKL protein expression.
【Key words】Shujinzhuanggu soup；osteoporosis；OPG；RANKL
骨质疏松症是老年人最常见的骨代谢疾病之一，它主要表现为骨密度降低和组织结构破坏，因其易导致骨脆性增加和骨折，已成为目前亟待解决的难题之一[1]。目前西医治疗绝经后骨质疏松症主要以雌激素为主，对身体具有一定的影响及不利因素，而且价格昂贵，治疗有一定的局限性[2]。中医治疗多以补肾壮骨、健脾益气活血为主[3,4]，本研究认为绝经后女性发病机制主要以肝肾阴虚为本、气滞血瘀为实，属本虚标实。疏筋壮骨汤治则以滋阴养血、活血通络为主，在治法上有一定的突破性，更加突出了中医针对病因病机辨证施治、标本兼治的特色。本课题组前期通过对60例患者进行临床观察，证明疏筋壮骨汤对治疗绝经后骨质疏松症有确切的疗效。然而，疏筋壮骨汤对骨质疏松的作用机制如何，尚不清楚。本研究通过建立大鼠的骨质疏松模型，观察疏筋壮骨汤治疗骨质疏松的疗效，并阐明其其作用机制。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1试剂
疏筋壮骨汤（由葛根、熟地、当归、白芍等组成经水煎服，100ml，每日两次）；尼尔雌醇片，购自沈阳国大药房；大鼠（OPG）和核因子κ B受体活化因子配体（RANKL）定量测定试剂、ELISA试剂盒，沈阳汇佰生物科技有限公司；成骨细胞BMP?2表达测定试剂，武汉博士德生物工程有限公司。
1.1.2 设备
DEXA双能x线（线骨密度仪），购自美国Hologic公司；全自动生化分析仪 购自美国贝克曼。
1.1.3 大鼠
48只雌性SPF级Wister大鼠，体重200±20g，由沈阳军区总医院实验动物科提供，生产许可证SCXK（沪）X2012-0024。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
将50只大鼠随机分为假手术组、模型组、疏筋壮骨汤组、尼尔雌醇组和疏筋壮骨汤+尼尔雌醇组，每组10只。
1.2.2 模型构建
大鼠采用戊巴比妥钠进行腹腔麻醉，在麻醉情况下，经背部完整切除双侧卵巢，止血后分层缝合。假手术组做相同的手术操作，但不切除卵巢，只切除卵巢周围少量的脂肪组织。卵巢切除后7天内，腹腔注射庆大霉素抗感染，动物可自由饮水及摄食。
1.2.3给药方法及指标测定
术后一周待动物伤口愈合后开始经灌胃给药，假手术组和模型组灌胃给予生理盐水；尼尔雌醇组灌胃予尼尔雌醇0.1mg/kg ,1次/周；疏筋壮骨汤组给予配制浓度为1.67mg/ml混悬液，按照1ml/（1kg?d）剂量灌胃给药；疏筋壮骨汤+尼尔雌醇组给予配制浓度为1.67g/ml混悬液，按照1ml/（1kg ?d）剂量灌胃给药；各组均连续灌胃12周。实验结束后，经水合氯醛麻醉后，腹主动脉采血后，处死大鼠，仔细剔除左侧股骨周围的软组织，采用骨密度仪测量大鼠股骨中心点及远心端骨密度；血液离心后取血清，送检验科检测血钙（Ca）、血磷（Pi）和N-端骨钙素（N-OT）的含量。按ELISA试剂盒使用说明定量测定血清骨保护素（OPG）和核因子κ B受体活化因子配体（RANKL）蛋白含量。
1.3 统计学分析
采用SPSSl8.0软件包分析，计量资料用 ±s来表示,各个组的实验数据采用两个独立样本t检验，以P<0.05为存在明显的差异，具有统计学意义。
2 结果
2.1 骨密度测量结果
与假手术组相比，模型组动物股骨中心及远心端骨密度明显降低，差异有统计学意义(P<O.05)；与模型组相比，尼尔雌醇组、疏筋壮骨汤和疏筋壮骨汤+尼尔雌醇组动物股骨中心骨密度和远心端骨密度明显增高(P<0.05)；与疏筋壮骨汤组相比，疏筋壮骨汤和疏筋壮骨汤+尼尔雌醇动物股骨中心及远心端骨密度增加明显(P<0.05)。 见表1。
注：与假手术组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与疏筋壮骨汤组相比，&P<0.05。
4 讨论
我国已进入老龄化国家，据2000年普查数据，我国约有骨质疏松症患者8800万，其中绝经后女性骨质疏松症发病率占61.8-90%左右。且发病率仍明显上升，现已成为继心血管疾病之后，第二大致死的健康照顾问题。目前治法有多种，但各有优缺点，疗效不是十分满意。故急需探索疗效确切、副作用小、经济适用的治法。
本研究通过手术去除大鼠的双侧卵巢，建立骨质疏松的动物模型，采用疏筋壮骨汤进行治疗。结果发现，与假手术组相比，模型组动物股骨中心骨密度和远心端骨密度明显降低，且血清Ca、Pi和N-OT含量明显降低，结果提示通过去除大鼠卵巢成功建立了骨质疏松的动物模型。疏筋壮骨汤治疗后能显著增加大鼠股骨中心及远心端骨密度，显著提高血清Ca、Pi和N-OT含量，结果证实疏筋壮骨汤明显改善大鼠的骨质疏松症状。据报道葛根异黄酮（疏筋壮骨汤成分之一）可以增加去卵巢大鼠股骨的骨密度，改善大鼠骨质疏松症状，葛根总黄酮有效改善去势手术诱导的雌鼠骨质疏松,其作用机制可能与调节下丘脑- 垂体-性腺轴有关[5,6]。黄芪配伍熟地能够增加骨矿含量、改变相关血液学和骨生物力学指标,减少骨转换,从而减缓去势大鼠的骨质疏松形成[7,8]。此外，文献报道，当归或白芍与其他药物配伍可明显改善患者骨质疏松症状[9]。本研究使用的疏筋壮骨汤是由葛根、熟地、当归、白芍等成分组成经过合理配方而成，前期临床已经证明疏筋壮骨汤对治疗绝经后骨质疏松症有确切的疗效。本研究结果证实疏筋壮骨汤能明显改善大鼠的骨质疏松症状，对骨质疏松的治疗效果显著。
骨保护素（OPG）在肝、心及肺等机体多种组织中均呈现较高水平的表达。作为重要的骨转换的标志物之一，OPG蛋白在不同种属中的表达存在差异。研究发现绝经后妇女血清OPG水平与年龄有关，可能与绝经后雌激素缺乏导致破骨细胞功能活跃，骨丢失加快，刺激机体代偿性骨形成增加，血清OPG相应增加[10]。而动物实验发现OPG降低时表示骨形成减少，去卵巢后骨质疏松中OPG蛋白降低，间接反映骨转换增加，骨吸收大于骨形成[11]。研究发现给予大鼠适量补充OPG蛋白，可以预防去卵巢大鼠骨质疏松的发生[12]。ＯＰＧ/ＲＡＮＫＲＡＮＫＬ系统是当前骨质疏松机制研究的热点之一，ＲＡＮＫ位于破骨细胞表面是目前已知的ＲＡＮＫＬ的唯一的受体，而可溶性ＯＰＧ分子作为一种诱饵受体竞争配体通过与ＲＡＮＫＬ结合抑制ＲＡＮＫＬ与ＲＡＮＫ的结合从而抑制破骨细胞 的形成和成熟过程抑制骨吸收[13]。国内外研究表明，ＯＰＧ与ＲＡＮＫＬ相结合后可以抑制破骨细胞生长发育，抑制骨基质吸收[14]。有研究发现骨质疏松组的血清ＯＰＧ水平显著低于正常对照组，提示由于绝经后妇女体内ＯＰＧ的明显减低，对ＲＡＮＫＬ与ＲＡＮＫ结合的竞争性抑制减少了骨形成和骨吸收的动态平衡，被打破骨质疏松症患者体内出现骨吸收大于骨形成，最终导致骨破坏和骨丢失而ＲＡＮＫＬ则相反骨量减低组及骨质疏松组均高于正常对照组[15]。
本研究发现，与假手术组相比，模型组动物血清OPG降低，而RANKL含量明显升高，差异有统计学意义(P<O.05)；与模型组相比，疏筋壮骨汤组动物血清OPG含量明显增高，RANKL含量明显降低(P<0.05)。有研究发现去卵巢后2周骨组织OPG的下降和RANKL的升高可能是雌激素急剧降低的直接后果，这也进一步加速了去卵巢早期的骨吸收。6-12周OPG升高和RANKL下降则可能正是机体对骨重建亢进的反馈调节，通过增加OPG和降低RANKL的表达，抑制破骨细胞分化和功能，从而纠正过度的骨吸收[16]。同时发现补充雌激素能够纠正术后RANKL的剧烈变化，但未能使OPG达到假手术对照组水平。本研究发现疏筋壮骨汤联合尼尔雌醇可明显改善大鼠的骨质疏松症状，且明显逆转OPG和RANKL蛋白的表达含量，结果表明疏筋壮骨汤和雌激素联用治疗骨质疏松可有较好的协同作用，并可减少单用雌激素的副作用。
总之，本研究结果表明疏筋壮骨汤能够改善大鼠的骨质疏松，作用机制可能通过上调OPG和下调RANKL蛋白表达实现的。同时，本研究为临床医师治疗骨质疏松患者提供新的治疗手段。
参考文献：
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基金项目：
吉林省科技厅发展计划项目（20130206064YY）
作者简介：
王海燕，女，汉族，吉林长春人，副主任医师
通讯作者：
陈立忠，女，主任，副主任医师。
论文作者:王海燕1,孙艳1,莫丹1,陈立忠1（通讯作者）
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月供稿
论文发表时间:2015/10/22
标签：骨质疏松论文; 大鼠论文; 卵巢论文; 血清论文; 股骨论文; 含量论文; 尼尔论文; 《河南中医》2015年8月供稿论文;