夏兰芹, 郭三堆[1]2001年在《Bt杀虫基因在转基因双价抗虫棉中的整合与遗传稳定性》文中进行了进一步梳理Bt抗虫棉中Bt杀虫基因的表达与遗传稳定性对抗虫棉的品种培育和商品化生产是至关重要的. 利用转基因双价抗虫棉R3, R4及R5材料基因组DNA, 然后采用GFMCryIA基因的PstⅠ酶切片段做探针, 进行Southern杂交分析, 研究Bt杀虫基因在双价抗虫棉中棉所19材料基因组中的整合、拷贝数及遗传稳定性. 结果表明, 转基因抗虫棉和阳性对照经HindⅢ酶切, Southern blot均出现了约4.7 kb的杀虫基因阳性带, 从而在分子水平上证实了杀虫基因在棉花基因组中的整合, 并且存在比较完整. 利用在杀虫基因中只有一个酶切位点的XhoⅠ酶切后, 阳性对照出现了预期大小的17.7 kb的阳性带, 而双价转基因抗虫棉R3, R4及R5材料均出现了分别为约17.7, 8.0, 5.5和4.7 kb的4条阳性带. 初步结论是:外源Bt杀虫基因在双价抗虫棉中棉所19材料基因组中至少有4个拷贝, 这4个拷贝中很有可能有一个以上能够稳定遗传和表达. 该研究结果为以后的双价抗虫棉品种培育及商品化生产提供了依据.
夏兰芹[2]2000年在《Bt杀虫基因在转基因抗虫棉中的表达与遗传稳定性的研究》文中研究说明Bt抗虫棉的应用和推广，为棉花生产带来了巨大的经济效益，并有效地缓解了因喷洒化学农药而造成的严重的环境污染。在Bt抗虫棉中，Bt杀虫基因能否稳定表达和遗传是影响转基因抗虫棉应用前景和商品化生产的重要因素，但是，国内外Bt抗虫棉在生产中普遍存在两个问题：①抗虫棉生长前期抗虫性强，后期抗虫性减弱。②外界环境因子（温度、光照、水分等）影响其抗虫性能，从而影响了抗虫棉的稳产性。针对这些问题，开展了一系列研究，研究内容与结果如下： 利用载体pGBI121S4ABC中杀虫基因两端的HindIII酶切位点，对Bt抗虫棉GK139-20的R3、R4代材料进行Southern杂交分析，结果证明了利用花粉管通道法导入的Bt杀虫基因整合在抗虫棉GK139-20 R3、R4代材料基因组中。 Xhol在杀虫基因和载体pGBI121S4ABC中具有单一酶切位点。利用Xhol酶切Bt抗虫棉GK139-20的R3、R4代材料，然后进行Southern杂交，观察Bt杀虫基因在抗虫棉R3、R4代材料基因组中整合的拷贝数和遗传稳定性。结果表明，Bt杀虫基因在GK139-20棉花基因组中以多拷贝形式存在，其中有四个拷贝即大小约为17.7、8、5.5和4.7kb的阳性带为所有供试R3、R4代材料共有，说明这四个拷贝能够稳定遗传。为了进一步证实这一结论，随机取9株R5代材料进行拷贝数分析，结果表明，所有供试材料同样出现了R3、R4代材料所具有的四个拷贝，从而在分子水平上证明了Bt杀虫基因能够在抗虫棉GK139-20的后代中稳定遗传。 Bt抗虫棉不同生长发育期的杀虫实验表明，Bt抗虫棉139-20同样存在“前期抗虫性强，后期抗虫性减弱”的现象。ELISA检测结果表明，Bt杀虫蛋白在抗虫棉中的表达具有时空特异性。同一组织中，Bt杀虫蛋白含量在整个生长发育期呈动态下降趋势。不同组织中，自7月中旬起，花中的Bt杀虫蛋白含量最低。 RNA斑点杂交分析证明，Bt杀虫基因mRNA在抗虫棉不同组织器官、在不同的生长发育期表达量不同。发育后期Bt杀虫基因mRNA的量和Bt杀虫蛋白的量不成比例，表明发育后期抗虫棉中Bt杀虫蛋白含量下降主要是发生在转录后水平或翻译水平。 对6、7、8月份抗虫棉总RNA进一步进行Northern杂交分析，结果表明：发育后期BtjAsllfffi中Bt杀虫蛋白含量阳氏是由于全长Bt杀虫基因转录本逐渐减少引起的，减少的原因可能是由于前期Bt杀虫基因表达量过高5！起的井扣喘峭减的。这是一种转录后水平的基因调控，是一种发育调控的转基因沉默现象。这就从理论上解释了国内外Bt抗虫棉在生产中伶遍存在”前期抗虫性强，后朋抗虫性弱”的现象。此结果口前在国内外尚未见相 道。 通过分析不同发育期Bt lftrtlfM中Bt杀虫基因编码区和启动于区的甲基化状态变化，结果发现在抗虫棉生长发育后琐Bt杀虫基因的表达变化与355启动子的甲基化程渡提高有关。 针对环境因于对Bt M棉抗虫性的影响，对抗虫棉RS代材 了不同温度处理，然后分析Bt杀虫基因在mRNA ％l＄白质水平上的表达变化。结果表明，温度变化影响抗虫棉早期的生长发育和 Bt杀虫基因的表达，从而影响 Bt杀虫基因沉默的发生时间，前期高温处理可使Bt杀虫基因在生长发育拙中的沉默时间提前。 以上研究结果不仅证明了Bt杀虫基冈能在抗虫棉GK 39－20中稳定遗传和表达，同时也为解决国内外Bt iii：！flfs在生产中存在的问题提供了理论依据。
参考文献：
[1]. Bt杀虫基因在转基因双价抗虫棉中的整合与遗传稳定性[J]. 夏兰芹, 郭三堆. 科学通报. 2001
[2]. Bt杀虫基因在转基因抗虫棉中的表达与遗传稳定性的研究[D]. 夏兰芹. 中国农业科学院. 2000