程巧梅[1]1998年在《绿脓杆菌外膜蛋白与耐药性关系及其基因的克隆与应用研究》文中研究表明建立了简易可行的测定绿脓杆菌对药物外膜通透性的方法，在此基础上，对临床分离的耐β—内酰胺抗生素(至少耐一种β—内酰胺抗生素)的绿脓杆菌测定了对头孢唑啉及泰能的外膜通透性。通过对绿脓杆菌临床分离株的诱变，采用泰能浓度梯度平皿筛选与液体筛选相结合得到泰能耐药菌株715／R_1、715／R_2，对其测定了对泰能的外膜通透性，并对其膜蛋白进行了SDS-PAGE分析，表明其耐药性与外膜蛋白缺失引起的外膜通透率降低有一定相关性。进一步利用PCR技术克隆了该外膜蛋白基因，并在大肠杆菌中成功地得到表达；该基因可使泰能耐药菌株恢复敏感性。利用原株与诱变株为指示菌，建立了以绿脓杆菌外膜通透性为靶点的微生物来源的抗菌物质筛选方法。 根据单位菌体在一定时间内吸收抗生素的量，测定耐药菌株的外膜通透性。抗生素的定量测定采用杯碟法。首先制作所测抗生素的生物检定标准曲线，由抑菌圈直经可从标准曲线上计算出相应抗生素的量，以细菌细胞对抗生素的吸收率代表通透率。根据所建立方法我们对临床分离的101株绿脓杆菌测定了对头孢唑啉的外膜通透性；对其中32株测定了对泰能的外膜通透性；并利用对药物较为敏感的10株大肠杆菌和标准菌株检验了该方法的准确性。与此同时还测定了这些菌株对以上药物的最低抑菌浓度及产β—内酰胺酶的情况。 为进一步探讨绿脓杆菌耐药性与外膜通透性关系，通过对绿脓杆菌临床分离株715号采用紫外线与NTG固体平板诱变复合处理，采用泰能浓度梯度平皿筛选与液体筛选相结合得到泰能耐药株715／R_1、715／R_2、715／R_3(对泰能MIC分别为64、64、16μg／ml)连续传代多次其耐药性保持稳定；对715／R_1、715／R_2测定了对泰能的外膜通透性，由原泰能敏感菌株715号的100％分别降为36.54％与30.13％。膜蛋白SDS-PAGE分析结果表明：715／R_1、715／R_2与715号原株相比，明显缺少MW约45～49kD的一条带，该条带在715／R_3中仍存在，不过其含量要远远低于原株。经内、外膜蛋白分别进行SDS-PAGE检测，结果表明：715号原株经诱变后所得耐药菌株中缺失或减少的膜蛋白确实存在于外膜中，且该外膜蛋白在37℃保温10min后在该位置消失，表明该蛋白与泰能的渗入有关，提示该外膜蛋白为OprD_2。 以绿脓杆菌标准菌株PAO1总DNA为模板，通过PCR技术扩增了大
陈春琳, 刘祥, 俱雄[2]2015年在《重组绿脓杆菌外膜蛋白OprF的表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定》文中指出绿脓杆菌外膜蛋白Opr F可有效激活机体的免疫机制对抗细菌的感染,在疫苗上有很好的应用前景。采用分子克隆方法获得绿脓杆菌外膜蛋白Opr F表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得Opr F蛋白,免疫小鼠制备Opr F蛋白多克隆抗体。ELISA法表明,Opr F抗血清滴度达1∶12 800倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。通过DNAMAN软件对Opr F序列同源性分析发现其C端在不同细菌间存在较高同源性;采用MEGA软件对Opr F的系统发生分析发现假单胞菌属细菌的亲缘关系高于其它属细菌。
李雅林[3]2002年在《羊绿脓杆菌及其主要致病因子研究》文中研究指明随着我国养羊业集约化的不断扩大，羊群疾病发生的种类在不断增加，近年来羊的一种慢性肺炎就是由规模化饲养以后出现的一种新疾病。该病主要表现为咳嗽，呼吸困难，慢性消瘦，后期发生死亡，给规模化养羊场造成了巨大损失，对养羊业造成了严重威胁。通过流行病学调查和病原检测，探明了导致该病的病原体为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)。 本研究在确定绿脓杆菌是羊慢性肺炎致病菌的基础上，重点对该菌最主要致病因子外毒素A进行系统研究，从而为研究该病的发病机制和控制措施提供理论依据。本课题分四部分进行研究。 第一部分：羊绿脓杆菌的分离、鉴定 采用微生物学方法，对山东省某集约化羊场发生的一种慢性肺炎进行了系统的病原学研究。通过分离培养、显微镜检查，发现引起该病的病原体为一种革兰氏阴性小杆菌，此菌无芽胞、无荚膜，有鞭毛，可产生水溶性的蓝绿色色素，再结合生化试验等指标最终鉴定该菌为铜绿假单胞菌。用24h细菌培养物分别腹腔接种3日龄雏鸡(0.1ml／只)、10日龄鸡胚(0.1ml／只)、小白鼠(0.1ml／只)和成年家兔(0.3ml／只)，均于24h内死亡。用该菌接种健康羊，复制出了与自然发病羊相同的病状，并从死亡试验动物和人工发病死亡的羊体内回收到了接种的病原体。 第二部分：平板凝集抗原的制备及羊慢性肺炎的血清学调查 用分离纯化病原菌制成平板凝集诊断原，经稳定性试验、无菌试验、自凝和交叉凝集试验结果证明，自制的平板凝集诊断原性质稳定结果可靠。利用该诊断抗原，自2001年11月至2002年5月，从山东省泰安、菏泽、济宁、聊城、潍坊、济南、日照、莱芜等地(市)的养羊场/户共抽检羊246只，用平板凝集试验检测羊血清中抗PA抗体。结果发现，阳性率为94.7％。临床健康羊群抗体平均滴度为2.23log2，其中具有临床症状羊只体内抗体平均滴度为3.001og2。统计分析表明，除泰安羊的抗体滴度显著高于菏泽、潍坊、日照、济南的羊抗体滴度之外，泰安与其他地区及其他地区之间的羊抗体平均滴度差异不显著。在调查的全部羊群中，均存在该病的感染。 第三部分：绿脓杆菌外毒素A研究 以TSB(Tryptic Soy Broth)透析液作为基础，加入0.05M谷氨酸钠和1％甘油，于32℃震荡培养22h为产毒条件。4℃10000r／min离心30min，收集培养上清液。培养上清液分别用30％饱和硫酸铵去除杂蛋白、60％饱和硫酸铵粗提外毒素。然后用流水透析除盐，过DEAE柱和Sephedex G-200纯化。用分光光度法测浓度为0.857mg／ml。用环状沉淀试验初步检测为阳性，用SDS-PAGE进一步检测，结果显示出了分子量为66KD的一条蛋白带，与报道的标准毒株外毒素A大小相一致。将提出的外毒素A接种BALB／C小鼠(接种0.8ml／只)无致病性，但用PA4倍浓缩的上清液(0.2ml／只)则可致死小白鼠，这可能与提取过程中毒性丧失等因素有关，但用纯化的毒素免疫家兔，结果获得了滴度为10log2的高水平抗体。说明外毒素A具有良好的免疫原性。分别以外毒素A作为抗原和自制兔抗PEA阳性血清为抗体，建立了ELISA(夹心法)检测羊血清中抗PEA抗体的方法。该法灵敏度高，特异性强，适于大规模羊场的检疫。 第四部分：外毒素AⅢ区基因的克隆及序列分析 利用PCR技术，以绿脓杆菌 李雅林：羊绿脓杆菌及其主要致病因子研究 （暂命名为叩－SD－l株）的染色体DNA为模板，成功扩增出了该菌主要致病基因（绿脓杆菌外毒素 A）111区基因。将该 PCR扩增片段与 yGE旷－T Eass载体连接，获得了插入目的片段的重组质粒（命名为 PA－SD－ETA）。序列测定结果表明，该菌株与已报道的其他绿脓杆菌菌株有较高的同源性（同源性大于 96．8％）o 与标准株 PA103有97．7％的同源性，并出现单个碱基的点突变。
邢进[4]2012年在《北京地区实验动物中绿脓杆菌耐药分析及PFGE和MLVA分型方法比较》文中认为目的：了解北京地区实验动物中绿脓杆菌分离株的耐药情况、基因型分布和菌株间的同源性，对绿脓杆菌感染进行溯源和流行病学分析，为绿脓杆菌耐药机制的研究提供依据和菌种资源。比较脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）两种分型方法的优劣。为绿脓杆菌的研究提供北京地区的分型数据。进而为绿脓杆菌感染控制提供依据，同时保障实验动物质量和相关动物实验的顺利进行。方法：（1）收集2007年~2011年北京地区17家实验动物生产和使用单位的绿脓杆菌分离株，使用法国梅里埃API20E细菌鉴定试纸条生化试验及16SrRNA序列扩增和测序进行绿脓杆菌菌株的鉴定；（2）根据美国临床与实验标准化委员会（CLSI）标准和推荐方法，选择青霉素类哌拉西林（Piperacillin, PIP）、β-内酰胺酶抑制剂复合物哌拉西林/他巴唑坦（Piperacillin-tazobactam, PIP-TAZ）、头孢菌素类头孢他啶（Ceftazidime, CAZ）和头孢噻肟（Cefotaxime, CTX）、氨基糖苷类庆大霉素（Gentamicin, GEN）、喹诺酮类环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）、碳青霉素烯类亚胺培南（Imipenem, IMP）、多肽类多粘菌素E（Colistin, Coli）7类8种抗生素，采用琼脂稀释法收集的134株绿脓杆菌分离株进行药敏试验；通过IMP-EDTA协同实验和外膜蛋白OprD编码基因的扩增测序，对耐亚胺培南菌株进行耐药机制分析；（3）采用美国疾病预防控制中心推荐的脉冲场电泳方法（PFGE），经Spe I限制性内切酶酶切后的PFGE指纹图谱用Bionumerics软件进行处理和聚类分析；（4）采用串联重复可变序列分析（MLVA）方法对134株绿脓杆菌进行基因分型，经13个VNTR位点的扩增，利用Bioculator计算出各菌株的每个位点的重复序列数目，用Bionumerics软件对重复序列的多态性特征数据进行处理和聚类分析，并与PFGE分型结果相比较；结果：（1）经过API20E生化鉴定结果软件分析，从2988只实验动物和55份饮水样品中分离的135株疑似绿脓杆菌分离株，除PA73被鉴定为木糖氧化无色杆菌外，其余所有受试菌株的生化结果共产生了21种生化谱，第一鉴定结果均为绿脓杆菌，CMCC10110的API20E生化谱为220200463。其中PA001、PA002、PA060和PA075的鉴定ID%分别为25.2%、25.2%、57.7%和36.9%，其他菌株ID%在98.9~99.9之间，T指数在0.5~1之间。鉴定确认了134株为绿脓杆菌。（2）134株实验动物绿脓杆菌分离株经琼脂稀释法药敏试验，结果存在对CTX，IMP，Coli，GEN，CIP五种抗生素不同程度的耐药，其中对CTX的耐药率为11.9%；对IMP的耐药率为1.5%；对Coli的耐药率为2.2%；对GEN的耐药率为41%；对CIP的耐药率为1.5%；对PIP、PIP-TAZ和CAZ均敏感。存在CTX-Coli-GEN-CIP（n=1）和CTX-Coli-CIP（n=1）多重耐药株和CTX-GEN（n=11）双重耐药。所有耐药菌株均分离自北京市丰台区。对2株亚胺培南耐药株的耐药机制分析表明外膜蛋白OprD编码基因的变异是导致对亚胺培南耐药的主要原因。（3）134株绿脓杆菌分离株经Spe I限制性内切酶酶切后的PFGE指纹图谱用Bionumerics软件进行处理和聚类分析，所有菌株被切出15~20条DNA片段，大小在20Kb~1200Kb之间。共被分为了22个基因簇（A~V），108个基因型，分辨力指数D=0.955。优势簇为J、M、N和U，分别占39/134（29.1%）、15/134（11.2%）、22/134（16.4%）和13/134（9.7%）。各分离地之间的绿脓杆菌大部分为散发感染，个别不同来源菌株具有较高的基因相似度。（4）MLVA所有菌株共被分为32个基因簇，51个基因型，分辨力指数D=0.763，低于PFGE方法。其中12簇的菌数最多，占到了56.7%，其次是21簇，占14.2%。基因分型结果与MLVA数据库比对，各有1株菌与利比亚的和西班牙的分离株有较高同源性。（5）实验动物中绿脓杆菌感染呈现散在分布，来源和时间不同，基因型也随之不同。PFGE与MLVA两方法对IMP、Coli、CIP和GEN耐药株的分型能力相同，PFGE对CTX耐药菌株的分型能力略优于MLVA。结论：北京地区实验动物绿脓杆菌存在亚胺培南、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星和多粘菌素E的耐药菌株，对庆大霉素和头孢噻肟的耐药率较高。亚胺培南耐药株的耐药机制是由于外膜蛋白OprD编码基因的变异所引起。药敏结果表明大部分菌株对抗生素仍然较敏感，是研究绿脓杆菌耐药机制的良好资源。PFGE与MLVA方法对受试菌株均能有效分型，显示北京地区实验动物中绿脓杆菌的基因型比较丰富，感染源较多，且不同分离地存在基因高相似度的分离株。同一分离地的PA分离株随时间不同表现出不同的基因型，表明存在不同的感染源或变异。实验动物中绿脓杆菌的产生耐药的原因主要为自身变异。两种分型方法对耐药菌株的分型效果基本相同。PFGE的分型能力优于MLVA，而MLVA方法操作简便快速，在检测基因间的相关度方面优于PFGE。
段程[5]2016年在《磷酸盐耗竭反应系统对绿脓杆菌群体感应的影响及相应转录调控因子研究》文中认为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),属假单胞菌属(Pseudomonas),广泛存在于水、空气、土壤及动物和人的皮肤、消化道、呼吸道、尿道和肠道中,是一种条件致病菌,在特定的合适条件下能引起人和动物的感染发病。绿脓杆菌目前已成为危害人类健康及养殖业发展的重要疫病,其生物毒性主要是通过级联式的群体感应系统Quorum sensing system,QS)介导的。群体感应系统是一个依赖于细菌细胞数量的基因调控系统,在绿脓杆菌中分别表现为las、rhl以及pqs系统,其中las系统位于级联反应的顶端。低磷酸盐离子浓度条件下的绿脓杆菌,利用IQS系统,在低磷响应的转录激活因子Pho B的调控下,越过las系统,激活rhl以及pqs系统,表现生物毒性。在临床上,磷酸耗竭(phosphate depletion)是外科手术病人常见状况,此逆境条件常常导致包括绿脓杆菌引起的多种细菌病害的加重加剧,甚至导致死亡。我们通过HPLC和LC-MS的方法,分析高磷和低磷培养条件下的生物发酵液中信号变化趋势,进一步确定了环境中无机磷酸盐离子对绿脓杆菌群体感应系统的影响。为进一步阐明IQS调控机理及信号通路,我们利用转录组高通量测序的手段,确定了两个转录调控基因PA3045和PA2665。PA3045在HP-Las R和HP-PAO1比对,表达量显著的下调,下调倍数2.02,是双组分系统中的效应器,对应的感受器是PA3044;PA2665在LP-Pho B与HP-PhoB比对,表达量显著的上调,上调倍数2.07,是一种厌氧一氧化氮还原酶的转录调控因子。PA2665位于黄素血红蛋白基因上游,能调控其启动子中感受NO变化区域,从而调控黄素血红蛋白基因表达。对双组分系统PA3044、PA3045以及PA2665进行基因敲除和互补试验,发现PA3044对群体感应基因调控无显著影响。PA3045、PA2665敲除,对比野生型,生物膜产量增强,弹性蛋白酶产量增加,AHL信号产量增强,绿脓菌素产量也有一定程度增加,在运动性方面,swimming无影响,swarming相较于野生型增强,半径增大。这表明PA3045、PA2665均为负调控因子,能够影响绿脓杆菌诸多毒力因子表达,如生物膜、弹性蛋白酶、运动性等。由于日渐增多的抗菌药物的使用,病菌多重耐药、菌群失调等多种负面应用不断产生,细菌对抗菌药物耐药性的迅速增加已严重威胁到人类健康,多重耐药菌株的出现显著增加了患者的病死率和医疗费用,影响医疗质量。绿脓杆菌中的多种毒力因子表达及生物膜的形成都受到群体感应系统调控,研究绿脓杆菌群体感应系统,探明调控机理。通过干扰群体感应信号通路,使病原菌无法对抗宿主免疫防御系统,易于被宿主机体自身清除。这为研制新的治疗绿脓杆菌感染药物带来新的思路。本文从DNA水平验证PA3045、PA2665调控作用,为进一步找寻其信号通路,完善绿脓杆菌群体感应通讯系统打下基础。
左联[6]1997年在《绿脓杆菌外膜通透性与耐药性关系及其在新药筛选中初步应用的研究》文中研究说明绿脓杆菌是一系列严重的化脓性感染的重要致病菌，具有天然的和后天获得的耐药性，临床治疗很棘手。本论文了解了绿脓杆菌外膜微孔蛋白的性质，研究了绿脓杆菌外膜通透性与耐药性之间的关系，探讨了临床分离的多重耐药绿脓杆菌的耐药机制，并在此基础上首次建立了作用于外膜的抗绿脓杆菌药物的定向初筛方法，具有较重要的理论与实际意义。 在研究绿脓杆菌外膜微孔蛋白性质时，选用了绿脓杆菌标准菌株PAO1，以EDTA-溶菌酶法与超速离心法提取其外膜蛋白，SDS-PAGE分析外膜蛋白图谱，并利用DEAE离子交换高压液相色谱柱加以纯化，通过重建蛋白脂质体测定了不同药物对外膜的通透作用。该部分实验结果证实了绿脓杆菌外膜微孔蛋白OprC(分子量70KD)、OprD_2(46KD)和OprE(43KD)能够形成小孔道，具有通透功能。但小分子亚胺培能(碳青霉烯类)为选择性通过OprD_2通道进入胞内，头孢菌素类和氨基糖苷类药物进入细菌体内的途径仍不十分清楚。 在探讨临床分离的多重耐药绿脓杆菌的耐药机制过程中，以绿脓杆菌标准菌株PAO1为对照，应用SDS-PAGE外膜蛋白图谱和β-内酰胺酶测定方法，研究了临床分离的四株多重耐药绿脓杆菌对碳青霉烯类等β-内酰胺类抗生素的耐药机制。结果表明，四株绿脓杆菌分离株均缺失了外膜蛋白OprD_2，其中有两株菌产生了较高水平的β-内酰胺酶，提示其多重耐药机制可能是OprD_2的缺失和大量β-内酰胺酶的共同作用结果，其中对亚胺培能耐药的主要原因可能是OprD_2丢失。 碳青霉烯类为β-内酰胺类化合物，对β-内酰胺酶稳定，对绝大多数致病菌尤其是引起医院内感染的多重耐药菌株包括绿脓杆菌具有较强的抗菌活性。本初筛方法的建立有助于寻找到作用于绿脓杆菌外膜的碳青霉烯类抗生素，并且可用于抗菌药物的作用机制研究及药物应用前景的评价。 在建立初筛方法的过程中，首先选择了绿脓杆菌外膜OprD_2专一缺陷菌株7208，利用耐药菌株绿脓杆菌7208、绿脓杆菌标准菌株PAO1和PAO1(含50ug／ml氨苄青霉素)为检定菌，通过不同类型抗生素的验证，证明了该方法对碳青霉烯类化合物有较高的特异性，可用于初筛。另外，利用本初筛模型也可筛选到与β-内酰胺类抗生素有协同作用的活性物质或造成外膜缺损的化合物。 应用所建立的初筛方法，从1255株放线菌中筛选到11株阳性菌株，但要说明其作用机制是否对外膜有作用，需要作进一步研究。
左联[7]1997年在《绿脓杆菌外膜通透性与耐药性的关系》文中指出绿脓杆菌是一系列严重的化脓性感染的重要致病菌 ,具有天然的和后天获得的耐药性。对于绿脓杆菌耐药机制的研究 ,一直是国内外研究的主要内容。本文阐述了绿脓杆菌的外膜通透性、微孔蛋白的性质及其与抗生素之间的关系 ,说明绿脓杆菌对许多种抗生素的耐药性是多重外排转运体和有效通透屏障相结合的结果。
左联, 周建忠, 姚天爵[8]1999年在《高效离子交换液相色谱法分离绿脓杆菌外膜蛋白》文中研究指明利用高效ＤＥＡＥ离子交换液相色谱法分离纯化了绿脓杆菌标准菌株ＰＡＯ１外膜蛋白。流动相为ｐＨ８．０Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液，色谱柱为ＴＳＫｇｅｌ－ＤＥＡＥ－５ＰＷ（０．７５ｃｍ×７．５ｃｍｉ．ｄ．）。通过纯化外膜蛋白，可以为研究绿脓杆菌外膜通透性与抗生素耐药性之间的关系及缩短研究周期提供有效的方法。
周劲松[9]2004年在《绿脓杆菌蛋白质组和gyrA基因突变在其对环丙沙星耐药进化过程中变化的研究》文中研究表明喹诺酮类药物主要通过抑制细菌的DNA解旋酶和拓扑异构酶IV, 使细菌的DNA复制受阻,导致细菌死亡.目前第三代喹诺酮类药物是仅次于头孢菌素的抗菌药,环丙沙星属于第三代喹诺酮类药物,其增强了药物与细菌的结合能力以及对细菌细胞膜的通透性,扩大了抗菌谱、增强了抗菌活性，成为全球第一个口服广谱抗菌药。 近年来国内外医院应用抗生素品种繁多，数量大，导致抗药菌株不断地增加。由于不合理使用抗生素而导致病人抵抗力降低耐药菌株增加，使医院内感染逐渐增多。绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa， PA） 属假单胞菌属， 是临床上较常见的条件致病菌及院内感染的主要病原体之一， 由于可产生多重抗药性， 从而可导致高死亡率肺炎和败血病 ，因此对绿脓杆菌耐药机制的研究十分重要。 目前， 对绿脓杆菌喹诺酮耐药机制的研究主要集中在 （1）抗生素作用的靶位的改变而使抗菌药物无法发挥作用或亲和力下<WP=146>降 ；（2） 由于细菌细胞膜渗透性的改变使抗菌药物无法进人胞内； （3） 细菌依赖于能量的主动转运系统使已经进入胞内的药物泵至胞外。 几乎所有研究的实验对象是对抗生素完全敏感或已经获得耐药性的菌株， 所以， 其研究结果只是体现了在绿脓杆菌对喹诺酮类药物耐药机制的起始和最终状态 ，而对其耐药机制的启动-执行的信号传递系统无法了解， 这导致目前对细菌耐药性治疗中存在的两个主要问题：（1） 检测手段上只是应用经验指标 （如常规的细菌耐药性检测） 来评估细菌的耐药性 ，而缺乏一种客观的、 严格的指标：（2） 对细菌耐药性治疗的药物几乎没有被开发出来。 因此 ，本研究的目的在于了解绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程中基因组、 蛋白组所发生的变化 。我们采用连续琼脂糖扩散法和连续试管稀释法在体外模拟绿脓杆菌对环丙沙星耐药的进化过程， 检测在耐药进化过程中与耐药相关的基因的突变情况以确定基因突变发生的时间 ，同时观察在耐药进化过程中蛋白组的变化。 这样， 可以了解绿脓杆菌对环丙沙星耐药过程中细菌耐药机制是如何得以启动、 实现的。 这将为建立一种检测细菌耐药性的严格的、 客观的指标提供了依据 ，并为研制新的抗细菌耐药性药物提供新的药物靶点。 在本研究中 ，我们体外模拟了绿脓杆菌对环丙沙星耐药进化过程 ，这个过程与其在人体内发生的耐药过程极为相似，Adler-Mosca, H 等发现在人体内同一菌株在治疗的过程中从敏感转变为耐药。 绿脓杆菌在人体器官如肺、 伤口、 尿道等表面的生长可用琼脂平板培养进行模拟， 在人血液中的生长可用MH肉汤培养进行模拟 在连续药物扩散法体外模拟细菌耐药的进化过程 ，使用两株绿脓杆菌PA1（ATCC27853） 和 PA0102205 这两株细菌在实验开始时对所有的抗生素均是敏感的 ，经过连续的药物 （环丙沙星）刺激， 这两株绿脓杆菌均成为稳定的耐环丙沙星的菌株 ，在整个耐药进化过程中 ，环丙沙星对PA1（ATCC27853）和 PA0102205<WP=147>的耐药进化行为十分类似 ：在最初的几轮药物刺激中 ，PA1 （ ATCC27853 ）和 PA0102205 均保持对环丙沙星敏感的特性（抑菌环直径》21mm）； 随着药物刺激的持续，细菌对环丙沙星的耐受力加大， 耐药别性进入中介区（ 16mm《抑菌环直径《20mm）， 这种耐药特征均保持了三轮的筛选： 随后， PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205呈现耐环丙沙星的特征（抑菌环直径《15mm），并且随着药物刺激的延续，对环丙沙星的耐受力不断加大， 直至完全耐药（抑菌环直径≈6mm）。 为确定PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205 对环丙沙星的耐药的稳定性 ，将每一轮药物扩散法实验中的到的菌体均进行无药的连续培养， 即将菌体在MH琼脂培养基中涂布培养， 无药连续培养共进行16轮，每一轮均用药物扩散法测定菌体抑菌环的大小结果表明 ：每一轮药物扩散法实验中的到的菌体在其独自的无药连续培养中所表现的对环丙沙星的耐药性是相似的， 而且一旦药物扩散法实验中的到的菌体的耐药级别进入中介区 ，其每一轮无药连续培养的菌体的耐药性几乎不变（ 抑菌环的直径几乎不变）。 在连续试管稀释法体外模拟细菌耐药的进化过程， 两株绿脓杆菌 PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205 的耐药进化行为也十分类似： 在最初的几轮药物刺激中PA1（ ATCC27853） 和 PA0102205均保持对环丙沙星敏感的特性 （MIC≤1 ug/ml);随着药物刺激的持续,细菌对环丙沙星的耐受力加大,耐药别性进入中介区( 1ug/ml < MIC < 4 ug/ml 这种耐药特征均保持了三轮的筛选;随后, PA1( ATCC27853) 和 PA0102205 呈现耐环丙沙星的特征( MIC≥ 4 ug/ml), 并且随着药物刺激的延续, 对环丙沙星的耐受力不断加大, 直至完全耐药 (MIC≈8 ug/ml). 研究表明，无论是“ 连续药物扩散法 ”还是 “连续试管稀释法 ”在体外均可成功地模拟绿脓杆菌对环丙沙星耐药的全部过程。在整个耐药进程中所获得的菌株为进一步研究细菌的耐药进化机制提供了良好的实验材料。 通过 PCR-SSCP、 基因测序等方法?
田睿, 余利岩, 肖春玲, 左联, 姚天爵[10]2004年在《以绿脓杆菌外排泵外膜蛋白OprM为靶点的药物筛选模型》文中提出目的 以绿脓杆菌主动外排系统中MexAB-OprM型外排泵的外膜蛋白OprM为靶点,建立外排泵抑制剂筛选模型。方法 利用PCR法从标准绿脓杆菌PA01菌株中得到外排泵外膜蛋白基因oprM,利用T-easy载体作为克隆载体,pMMB67EH为表达载体在大肠杆菌HS151中进行OprM蛋白的诱导表达。为检测OprM蛋白的功能,采用液闪计数法测定胞内四环素浓度,纸片法进行抑菌圈测定实验,并以此为基础建立筛选模型。结果 可见OprM蛋白的高表达,以其为主要检定菌,建立了一个作用于外排泵外膜OprM蛋白的药物筛选模型。累计应用此模型筛选放线菌和真菌发酵液样品1 600个,其中获得阳性菌株56个,阳性率约为3.5％。结论 本研究验证了OprM蛋白对外排作用的重要性,通过筛选实验表明该模型有较好的特异性和可操作性。
参考文献：
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