戴凯凡[1]2004年在《表达HIV-Ⅰ多价野生基因和合成基因重组痘苗病毒疫苗株的构建及与DNA疫苗联合免疫效果的研究》文中认为人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrom, AIDS)的病原。目前，艾滋病的流行已经严重威胁到人类的健康和发展，从历史经验和长远考虑，发展安全、有效的疫苗是预防和控制艾滋病的根本途径和有效措施之一。 考虑到安全性，用于临床试验的疫苗株都要求不带筛选标记。活载体疫苗能够以天然的方式加工和合成抗原并呈递给免疫系统，从而诱导较强的细胞免疫和体液免疫应答。密码子优化可以明显提高抗原的表达量及DNA疫苗免疫反应的强度。以痘苗病毒为载体的活载体疫苗已经进入临床试验并取得一定效果。本研究的目的是基于我国HIV-1主要流行株B’／C重组株CN54，构建两株不带筛选标记的多价重组痘苗病毒疫苗株，并与相应的DNA疫苗联合免疫BALB／c小鼠，从而探讨其诱发的HIV特异性免疫应答。同时设立平行实验组，比较HIV密码子优化的合成基因野生型基因诱导的细胞免疫和体液免疫应答之间是否存在差异，为我国艾滋病疫苗的临床试验提供参考。 本实验首先构建了含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的转移质粒pV175将HIV-I中国主要流行株B’／C重组株CN54gagpol基因置于pV175的启动子pE／L下，构建重组质粒pV175-gagpol；将HIV合成抗原基因syngpnef和syngp120分别克隆到pV175的启动子pE／L下游，构建了重组转移质粒pV175-syngpnef-syngp120。重组质粒在鸡胚细胞内与痘苗病毒发生同源重组，使HIV目的基因与含neo基因和lacZ基因的双重筛选标记一同重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中。前叁轮在G418加压筛选后，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，这样就可以挑取既含有目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒：接着在无G418压力选择下，蓝色重组痘苗病毒自身会因为转移质粒中HIV目的基因上游一小段约200bp的lacZ’片段与完整的lacZ基因发生分子内的同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因而得到只含目的基因的重组痘苗病毒。用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，能挑取只含有目的基因的白色重组病毒。挑取的白色重组病毒纯化叁代，就能得到单一克隆的重组病毒疫苗株。结果显示，成功筛选到了两株重组痘苗病毒，分别命名为rVV-gagpol和rVV-syngpnef-syngp120。经PCR和Dot blot检测，确认这两株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因均己丢失；PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒的基因组中；抗体染色和Western blot结果证实这两株重组痘苗病毒都能很好的表达HIV目的蛋白。 免疫策略是影响免疫效果的重要因素之一。本实验采用DNA疫苗初免，重组痘苗病毒加强的Prime-boost免疫策略。先用相应的DNA疫苗免疫3次，再用所构建的重组痘苗病毒加强免疫1次，比较各实验组小鼠诱导的可能免疫应答情况，同时进一步分析比较免疫含HIV野生型抗原基因和合成抗原基因的疫苗后，在小鼠中诱导的免疫应答是否存在差异。间接ELISA法测定Gag和Env特异性结合抗体；间 华中农业大学生命科学技术学院硕士学位论文接ELISA法检测Gag特异性IgGZa/IgGI，以确定诱导的免疫应答类型;流式细胞仪检测细胞内分泌IFN一Y的HIV-1特异性CDS+T淋巴细胞，以评价细胞免疫反应水平。结果显示，各实验组小鼠均诱导了较强的HIV特异性体液和细胞免疫应答，并且倾向Thl型的细胞免疫应答。带有野生型抗原基因的gagPul组诱导出了较高的体液免疫应答，带有合成抗原基因的syngPnef-syngP12o组诱导出了较高的细胞免疫应‘答。统计学分析表明，各组之间都不存在显着性差异。 综上所述，本研究成功构建了转移质粒载体pVI75。通过该质粒载体所建立的重组痘苗病毒疫苗株筛选平台具有工作量小、周期短等优点，大大提高了我国HW活载体候选疫苗的研制效率。通过该平台，本研究成功构建了两株不带筛选标记的多价重组痘苗病毒疫苗株rVV*gagpol和rVV-syngpnef-syngp12o，分别表达HIV-I中国主要流行株B’/c重组株CN54的野生型抗原基因和合成抗原基因，为我国艾滋病疫苗的临床试验提供重要候选疫苗。动物免疫结果说明，rvV-gagPol和rvV-syngPnef-syngP120与相应的DNA疫苗联合免疫小鼠，能够诱导较强的体液和细胞免疫应答，为下一步的非人灵长类动物实验提供参考。
李珣[2]2003年在《以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1免疫应答》文中进行了进一步梳理疟疾仍然是危害人类健康的严重传染病，有效的疫苗将为防止疟原虫感染、减少疟疾发病和阻断蚊媒传播提供重要的手段。DNA疫苗是一种全新的疫苗形式，具有简单、稳定和灵活多样的突出特点，可诱导包括细胞和抗体在内的多种免疫应答。细胞因子在免疫应答过程中具有重要的作用，编码细胞因子的质粒DNA可有效促进和调节DNA疫苗所诱导的免疫应答。用DNA进行初始免疫，用重组蛋白或重组减毒痘病毒进行追加免疫的初始／强化免疫方案可选择性地增强由DNA免疫所诱导的免疫应答，提高DNA疫苗的保护效能。AMA1是红内期疟疾疫苗的重要候选抗原，抗体在针对AMA1的保护性免疫中发挥着关键作用。本研究选择AMA1的胞外域片段作为疫苗靶向，制备了包括重组蛋白、质粒DNA和重组MVA在内的叁种不同形式的原型疫苗，在分析各种疫苗免疫特性的基础上，采用DNA加细胞因子编码质粒进行初始免疫，用重组蛋白和重组MVA按不同的顺序进行追加强化，探讨了不同免疫方案在增强小鼠抗AMA1抗体应答中的作用。 首先，自P.f基因组DNA中扩增出编码AMA1胞外域的基因片段，经测序确证后，克隆入原核表达载体。构建了可分别表达AMA1完整胞外域蛋白和不同亚结构域蛋白的系列重组表达载体，包括：pET-16b／E、pET-16b／Ⅰ+Ⅱ、pET-16b／Ⅰ、pET-30a(+)/Ⅱ和pET-30a(+)/Ⅲ。转化E.coli BL21DE3菌，经诱导后表达出各个重组蛋白。用变性剂溶解包涵体蛋白，经Ni-NTA琼脂糖纯化后在适宜的条件下进行重折迭复性。用重组蛋白加福氏佐剂经腹腔接种免疫BALB／c小鼠，制备抗血清，采用免疫荧光和免疫印迹的方法鉴定抗血清的识别特性，用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验，分析重组蛋白与保护性抗体应答之间的关系。结果表明，AMA1胞外域蛋白结构的完整性对于保护性抗体的诱导至关重要。 在蛋白免疫实验的基础上，本文选择编码AMA1完整胞外域的基因片段，构建了DNA免疫质粒VR1020／E。用100μg的剂量经肌肉接种BALB／c小鼠，两次免疫后，诱导出明显的AMA1特异的抗体和脾细胞增殖。构建小鼠细胞因子表达质粒pcDNA3／GM-CSF和pcDNA3.1(-)／IL-4，以及双表达质粒pGM-CSF／pTPA-E,用细胞因子表达质粒分别与VR1020／E共同免疫小鼠，分析细胞因子质粒对AMA1 DNA免疫的调节作用。结果表明，各种细胞因子质粒均显着促进了小鼠针对AMA1的抗体和细胞应答，第四军医大学博士学位论文 摘要GM（SF质粒和IL人 质粒分别显着促进了ThZ型和hl型的免疫应答。 MVA是高度减毒的痘苗病毒株，利用重组MVA可诱导针对多种病原体和肿瘤细胞的免疫应答。本文构建了基因转移载体 pllldHR．SSpffi，经同源重组后筛选获得可稳定表达AMAI蛋白的重组病毒dAVVE。用＊～108TCID”剂量的rMVMi经腹腔接种BALB／c ’J’鼠，叁次免疫后诱导出明显的抗体和脾细胞应答，其抗体应答以IgGZa为主，表明tMWIN诱导了hl型的免疫应答。 在对叁种AMAI原型疫苗的免疫特性进行逐一分析的基础上，本文首先采用h4VA／E对不同质粒DNA免疫组的小鼠进行了追加强化，结果显示，dAVAi可显着增强DNA免疫所诱导的AMA抗体应答，在提高IgG水平的同时，更加显着地促进了小鼠的lgGZa应答。同时发现，DNA初始免疫的应答水平、应答类型以及免疫间隔时间对病毒强化免疫的效果具有一定的影响。初始应答的抗体水平与强化免疫后的抗体水平呈正相关。由GM（SF表达质粒诱导的ThZ型应答在病毒强化后依然占据主导，而由IL－12表达质粒诱导的hl型应答在病毒强化后则得到了进一步的加强和巩固。较长的免疫间隔有利于产生更高水平的回忆性抗体，同时也更加倾向于病毒所诱导的免疫应答即hl型应答。 在进一步的实验中，本文采用 VR1020N加 GM．CSF表达质粒对小鼠进行了初始免疫，而后用重组蛋白和重组MVA按不同的先后顺序进行了组合强化免疫，对比分析不同免疫强化方案在增强小鼠抗体应答中的作用。结果表明，重组蛋白E加福氏完全佐剂和rMVA／E可同样显着地强化DNA诱导的抗体应答，蛋白强化更加显着地促进了IgGI类抗体，病毒强化则更加显着地促进了IgGZa类抗体。重组蛋白E加福氏完全佐剂在fAVAjE强化的基础上进一步提高了小鼠的IgG水平，并显着地增强了IgGZa应答。 以上研究结果为探索以AMAI为应用抗原的红内期疟疾疫苗的最佳免疫方案提供了实验基础。
参考文献：
[1]. 表达HIV-Ⅰ多价野生基因和合成基因重组痘苗病毒疫苗株的构建及与DNA疫苗联合免疫效果的研究[D]. 戴凯凡. 华中农业大学. 2004
[2]. 以DNA为基础的复合免疫接种诱导小鼠抗AMA1免疫应答[D]. 李珣. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
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