【摘 要】 目的 试验研究土黄洗剂对临床分离真菌菌株的抑制和杀灭作用。验证自拟中药方土黄洗剂治疗皮肤浅部真菌病的药效。方法 采用药基混合法和琼脂扩散法对 3 种常见致病真菌进行土黄洗剂体外抗菌活性、最低抑菌浓度测定。结果 土黄洗剂对临床分离常见致病菌红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌均具有抑制作用，最低抑菌浓度分别为12.5mg/ml，25 mg/ml，25 mg/ml。结论 土黄洗剂对常见皮肤浅部真菌有抑制和杀灭作用。本研究为临床应用纯中药制剂治疗皮肤浅部真菌病提供了科学依据,证实了土黄洗剂科学性及可行性。
【关键词】 土黄洗剂； 真菌菌株； 抑菌试验； 中药推广
浅部真菌病［1］指是皮肤科最常见的感染性疾病之一，它主要是以皮肤癣菌、马拉色菌以及念珠菌等病原菌为主，侵袭人体局部皮肤的真菌感染，如甲板、毛发或粘膜等处。该病占所有皮肤病发病率的25%左右。目前临床上使用抗真菌药物治疗该病，但是无论是从药物的高效性、广谱性、低毒副作用以及耐药性等方面均无令人满意的疗效。因此，从抗真菌中草药中提取有效的抗真菌活性成分，以达到更安全、抗菌谱更广的临床疗效成为了学者重点研究的一个方向。土黄洗剂是笔者根据中医药理论及其抗真菌作用自拟组成的方剂,，并经过临床应用取得了较好疗效。在此基础上,进一步进行抑菌试验，观察土黄洗剂对临床常见红色毛癣菌、须癣毛癣菌及白色念珠菌的抑制和杀灭作用。现报道如下。
材料与方法
1．药物：土黄洗剂（由安丘人民医院药房提供）成分含土荆皮25g、黄柏25g、黄精25g、空心草25g、苦参20g、百部20g、蛇床子20g、蒺藜20g和冰片20g。上述药材均为市售饮片, 符合中国药典的标准。 将上述中药材用清水清洗干净并切碎，筛除杂质后加入清水1000ml并浸泡约90min，然后文火煎煮30分钟，将煎液保存在干净容器内，相同方法在煎煮依次，将两次的煎液合并，通过低温缓慢加热使煎液蒸发浓缩至每毫升含生药1g。将最终的药汤放置于4℃冰箱内冷藏保存。
2．菌株 ：红色毛癣菌1株、须癣毛癣菌1株、白色念珠菌1株。以上为潍坊医学院微生物教研室保存菌种。
3．仪器和试剂： 沙氏琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，将上述所有物品混合后加入氯霉素200mg，在121℃高压条件下灭菌 15min，室温下冷却后，4℃冰箱冷藏保存备用。主要设备：恒温箱、试管、高压消毒锅、冰箱、天平、超净工作台等。
4．方法与步骤：红色毛癣菌、须癣毛癣菌，2种4株接种于沙氏琼脂培养基，在26℃温度下培养2周，白念珠菌3株接种于 SDA培养基，在37℃温度下培养 48h，挑取单克隆菌落继续培养，依据菌落形态及产红特征、尿素酶试验和毛发穿孔试验，并依据培养的镜下结构特征进行鉴定［2］。根据倍比稀释法，将分别制得的药物浓度为200mg/ml、100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.13mg/ml、1.51mg/ml的药物培养基，注入试管，分别接种待测试菌种，标记为1～8号，9号试管为阳性对照（生长对照），10号试管为阴性对照（空白对照）。同一个菌种每种浓度接种3管，将已接种红色毛癣菌、须癣毛癣菌置于25℃恒温箱2周，将已经接种3株白念珠菌菌悬液的含药培养基放置于37℃温箱中，观察其孵育 24～ 48h后真菌的生长情况。在培养结束后，通过肉眼在自然光线下进行判断。对于实验结果的判定需要的前提是：生长对照管得菌落生长情况良好，空白对照管得培养基清晰。然后将每管菌落生长情况与对照组进行对比，以最低药物浓度无培养物生长的药基管为MIC终点［3］，该药物浓度即为该味药该提取成分对该种菌的MIC值。
5．杀菌试验（MBC的测定）:红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白念珠菌 3种7株受试菌的杀菌试验：将制备好的沙氏液基3ml于121℃、0.15MPa条件下进行15min灭菌，并在无菌条件下将沙氏液基分别倒入通过药剂琼脂稀释法抑菌实验且无培养物生长的含药物的培养基试管中，使用接种环轻轻刮取培养基表面，完全充分振荡再放入无菌试管。将冲洗接种红色毛癣菌、须癣毛癣菌2种4株皮肤癣菌药物培养基的沙氏液基放置于26℃温箱中孵育7天；将已冲洗接种3株白念珠菌药物培养基的沙氏液基放置于37℃温箱中孵育3天。
6．统计学方法由统计软件 SPSS 16.0 进行统计分析。计数资料采用 χ2检验，等级资料用秩和检验。
结 果
土黄洗剂抑菌作用抑菌实验发现9号管真菌生长良好为“＋＋＋＋”；10号管始终无真菌生长。实验过程中，无真菌生长为“－”；真菌生长迟缓，形成菌落较小为“＋”，菌落生长不旺盛为“＋＋”，菌落生长较旺盛，但比正常小为“＋＋＋”。实验测得土黄洗剂对临床分离足癣常见致病菌红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌均具有抑制作用，最低抑菌浓度分别为12.5mg/ml，25 mg/ml，25 mg/ml。见表1，表2。
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表1不同浓度土黄洗剂对临床分离致病菌的抑制作用
管号药物浓度mg/ml 菌株
红色毛癣菌须癣毛癣菌白色念珠菌
1 200 － － －
2 100 － － －
3 50 － － －
4 25 － － －
5 12.5 － + +
6 6.125 + ++ ++
7 3.13 ++ +++ +++
8 1.51 +++ ++++ ++++
9 0 ++++ ++++ ++++
10 0 － － －
表 2 土黄洗剂对手足癣临床分离菌种的体外抑菌浓度
菌种红色毛癣菌须癣毛癣菌白色念珠菌
MIC（mg/ml） 12.5 25 25
讨 论
真菌［4］广泛分布于自然界中，迄今为止能引起人类疾病的已知真菌有300种左右。皮肤癣菌、酵母菌以及霉菌是常见的三大类致病真菌 。临床上将真菌病分成两大类：一类是深部真菌病、又称系统性真菌病；一类是浅部真菌病。在我国有90%以上的真菌病属于浅部真菌病［6］。其中，红色毛癣菌是浅部真菌病的主要致病菌，包括是股癣、体癣、甲癣以及手足癣［5］。次为须癣毛癣菌［6］。白念珠菌在临床上也极为常见［7］。目前临床上治疗浅部真菌病的外用药物主要有唑类、多烯类和两烯胺类等［8］。近年来,由于唑类抗真菌药物不断出现耐药菌株以及交叉耐药菌株的现象，使得原本敏感的抗真菌药物敏感性逐渐下降，MIC值较高的种属感染越来越常见［9］。
中草药因价格低廉、很少出现耐药的特点使得其开发应用于临床有很好的前景。我国学者最近十年对近200味中草药进行研究，发现其中44味药物有较好的抗真菌效果，77味药物有明显杀灭真菌的效果。且来源广、副作用小，比较适合长期和预防性应用于临床［10］。陈洁［11］等对黄柏、苦参、知母、白鲜皮、地肤子、丁香、蛇床子、蒺藜子和土荆皮的体外抗真菌活性进行了测定。结果显示，黄柏、知母、丁香、土荆皮、蛇床子和蒺藜子对所测试的新型隐球菌和红色酵母菌都有抑菌活性，其中丁香、黄柏、土荆皮以及知母的MIC值偏低，对所测试真菌的抑制作用较强. 张平［12］等釆用二倍稀释法定量评价复方土槿皮霜剂（由君药土槿皮和臣药黄柏制成）对须癣毛癣菌和红色毛癣菌的抑制作用。结果显示：对须癣毛癣菌的抑制效果更为显著，其最小抑菌浓度达0.391mg/ml，最小杀菌浓度达1.5625mg/ml。对红色毛癣菌的抑制效果相对较弱，其最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为和1.641mg/ml 6.563mg/ml。土槿皮［12］的95%醇提物在1mg/ml对白色念珠菌都有抑制作用。根据以上研究，本课题组拟定土黄洗剂组方为土荆皮、黄柏、黄精、空心草、苦参、百部、蛇床子，蒺藜、冰片等。药方中不同药味都有其特殊的功效：土荆皮具有杀虫止痒功效[8]。黄柏具有较强的抑菌作用[13]。苦参清热燥湿，解毒杀虫;蛇床子杀虫驱虫。黄精的根茎含粘液质、糖类、脂类、蛋白质及苹果酸、赖氨酸等［14］有养血润肤之功。抑菌实验测得土黄洗剂对临床分离常见致病菌红色毛癣菌、须癣毛癣菌、白色念珠菌均具有抑制作用，最低抑菌浓度分别为12.5mg/ml，25 mg/ml，25 mg/ml。由此可见，土黄洗剂具有良好体外抗真菌活性。且该制剂无毒副作用、安全、价廉，可应用于临床，是治疗皮肤浅部真菌病的有效中药制剂。但其抑菌作用机理有待于进一步研究。
参考文献
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论文作者:郭效东
论文发表刊物:《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期
论文发表时间:2016/7/18
标签：土黄论文; 真菌论文; 洗剂论文; 黄柏论文; 浓度论文; 培养基论文; 药物论文; 《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期论文;