田海生[1]2001年在《用SSH结合cDNA芯片分离、鉴定淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关基因*》文中认为杀虫剂一直是人类杀灭害虫的重要武器，尤其是40年代有机合成杀虫剂问世以后，在病媒防制等方面发挥了巨大作用。然而时至今日，虫媒病无论在分布范围还是感染人数上，都呈明显的增长势头。究其主要原因，是连续、大量地使用杀虫剂导致媒介昆虫产生了抗药性（以下简称抗性）。 目前已知，昆虫抗性是可遗传的生物进化现象，是由基因决定的，在绝大多数情况下，抗性为多基因遗传。 对媒介抗性基因的研究，早期通常首先寻找杀虫剂的作用靶标（受体）或杀虫剂代谢相关酶类，然后再根据发现的特异蛋白质（酶）来克隆相应基因。如与有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂抗性相关的酯酶基因，与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的钠通道基因与细胞色素P450基因等。以上经典研究途径仅能分离单一基因，难以从总体上认识抗性、阐明抗性机理。这也是抗性研究长期进展缓慢的主要原因。当前分子生物学技术的快速发展使得大通量筛选抗性相关基因成为可能。 淡色库蚊（Culex pipiens pallens）是我国重要的家栖性病媒蚊种，近年来各地主要采用拟除虫菊酯类的溴氰菊酯进行防治，已陆续有敏感性显着下降的报告。 本研究采用正向和反向抑制性差减杂交法（suppressionD 南京医科大学博士学位论文D subtractive hybridization，SSH）分离淡色库 氰菊酯 ll 抗除和敏感品系高表这或 固，并呆用 cDNA芯片、l 叹 Northern和 Northern blot g 同时，构建了淡 DD 色库诌d亢性品系cDNA支J享，从中筛 出目 困的cDNA DDde＆｝＋列。D11．用SSH分离淡色库蚊涣氰菊酯抗，队R兢因lD 糊化3天内来吸血的淡色库狮隆成蚊，以对跟菊DD 酯坑姓品系为鹏d组k ter）、对鳅菊＠郭劲感品系为g孵 DD 组Uriver），进行正向 SSH，以 性品系高表达或特异 DD 表腿因；以咖品系为tester、抗怯品系为driver，断l 反向SSH，以获取敏感品系高表达或特异表达基固。分别忖影粑lD 2品系蚊虫的总RNA、InRNA，碾一cDNA第嘴，置换 D19：vsa．第二链，然后经Rsa酶切、接头连接、24kL减杂交 lD 和2轮叽R，获得正、反向差减杂交严物。朵交严物纯化后将D 立9。降入质陇一PinPoint“Xa－IT－－Vector，转化入大D 肠杆菌Wil 09。以趴片段两侧徽体序列PiflPoint和SP6为DD51物PCR扩增，琼脂糖凝胶电帷…X段大小。DD 结果：N、反向昭H分一瓣523和286个差献隆，Dl 构建了 2个el］含 5乃和 286个重组子的正、反向差减M。lD 枫片段大小约3m6。初步提示淡色犀刎没氰菊酯的DD 抗性可能涉及的并非个别基因，而是多基因或基因群；抗性DD 不贩抗贻因控制，而且可5腑…基因。DD．二．D 南京医科大学搏士学位论文D 2．用cDNA芯片鉴定淡色库蚊抗性和敏感品系差减支隆l 用PCR扩增棚一一的8 09个差献隆，PCR产l 物经贱、变性处理，用自动点 左制于尼龙膜戴体上，7 制成cDNA芯片。性品系和敏感品系IllRNA，反转轭经D 同赈‘？ 己为抗注探针和敏感探针。将两 与2 D 剃目同的芯片杂交，通过跟、压片、栅自显影扫和唁号扫D 描鞭弧的杂妮号。D 结果：CDNA芯片共获得差异表达克隆 2 21个，其中抗性 D 品系高表铂隆197个，卜3顾3倍以上高雄克降分另fi有D 155个和42个；髓性品系高表贩隆24个，2刁顾3倍1 以上高表达克o有15个和9个：郴卜脯2个差减氛D 怯品系中特异表达。拥究结果进一命支持本文第一ID 部分的撕，即淡色库附涣氰菊酯的抉注可能涉及的并非DDc知个别基因，6是多基因或基因群；抗性不仅受抗赈因DD 控制，而且可s腑眺基因，抗性可能航踉困8裘达D 和特异表达、敏感基因低表达综合作用的结果。 3．用叹 Northern和 Northern blot j｝L－步跟淡色犀颜D 性牙一铣感品系差减。寺。隆l 逆 Northern：＄先 PCR扩增 cDNA芯片中抗性品系 3倍］以上高一克隆16、43、30、6、38和敏感品系3倍以上l 高表达的兑隆 33、27、5L 45、4的插入基因片段，琼脂糖I 凝胶《膝梆至尼溅。然后分别 恰品B一品D 系
贺骥[2]2009年在《淡色库蚊核糖体蛋白L22基因(RPL22)克隆及其与溴氰菊酯抗性关系的研究》文中指出蚊媒病是当今严重危害人类健康的一类常见病,蚊媒的化学防制是控制蚊媒病的一个重要手段。然而随着杀虫剂的大量使用,蚊媒的杀虫剂抗性也随之产生和发展。杀虫剂抗性已成为蚊媒病防治工作中的一大障碍。发现和研究新的抗药性相关基因将有助于阐明抗药性的分子基础和寻找新的治理抗药性的靶标。本实验室前期采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)结合cDNA芯片及Northern blotting发现,核糖体蛋白L22基因(ribosomal protein L22, RPL22)在淡色库蚊(Culex pipiens pallens)溴氰菊酯抗性品系中高表达。在此基础上,本研究采用5’-RACE和3’-RACE法扩增淡色库蚊RPL22的全长序列,并通过实时定量PCR法研究RPL22在淡色库蚊的溴氰菊酯敏感和抗性品系及蚊敏感和抗性细胞中的差异表达;随后在细胞水平,先后通过转染后高表达、干涉后低表达和诱导后适度高表达等方法,研究RPL22对蚊细胞溴氰菊酯敏感性的影响;同时,通过实时定量PCR法检测了相应细胞色素P450 6A1基因(cytochrome P450 6A1, CYP6A1)的表达水平;此外,采用实时定量PCR法检测了淡色库蚊不同发育阶段RPL22的发育表达谱。结果显示,本研究获得的淡色库蚊RPL22全长序列为673 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸(GenBank登录号: EF990190)。用BlastX软件将该基因推导编码的氨基酸序列与蛋白质公共数据库Swissprot进行分析,用ClustalW软件作序列比对,以MEGA 3.1软件进行聚类分析。推导的氨基酸序列与致倦库蚊(Cx. quinquefasciatus),埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的RPL22分别具有100%,90%和80%同源性。通过MEGA 3.1软件进行聚类分析构建进化树及序列归一化距离分析后发现,淡色库蚊的RPL22同致倦库蚊的距离最接近(0.003),其次为埃及伊蚊(0.273)和冈比亚按蚊(0.472)。实时定量PCR结果显示,RPL22在淡色库蚊抗性品系的4龄幼虫和抗药性蚊细胞中的表达水平,分别是淡色库蚊敏感品系4龄幼虫和敏感蚊细胞的2.57倍和1.71倍(p均<0.001)。将RPL22转染蚊C6/36细胞,使其在蚊细胞中高表达(23.39倍),结果发现,在溴氰菊酯浓度为100.5μg/mL,101.0μg/mL,101.5μg/mL,102.0μg/mL和102.5μg/mL时,RPL22转染组细胞的存活率分别比对照组下降8.2%,17.1%,12.1%,11.4%和6.4%(p<0.05)。实时定量PCR结果显示在高表达RPL22时,CYP6A1的表达水平降低为对照组的41.8%(p<0.001)。采用siRNA技术干涉蚊抗药性细胞的RPL22,通过实时定量PCR实验验证,干涉RPL22的效率为61.9%。结果发现,在溴氰菊酯浓度为400μg/mL和600μg/mL时,干涉组细胞的存活率分别比对照组下降7.6%和9.5%(p均<0.05)。实时定量PCR结果显示,在低表达RPL22时, CYP6A1的表达水平降低为对照组的82.5%(p<0.05)。构建RPL22诱导型表达载体,以终浓度为0.5nM CuSO4作为诱导剂,诱导48小时后RPL22的表达量为对照组的7.9倍,为接近生理水平的高表达。结果发现,在溴氰菊酯浓度为100.5μg/mL,101.0μg/mL,101.5μg/mL和102.0μg/mL时,RPL22转染组细胞的存活率分别比对照组提高8.6%,12.7%,9.6%和7.9%(p<均0.05)。实时定量PCR结果显示,淡色库蚊RPL22在不同发育阶段中,蛹期表达水平最低,比4龄第2天幼虫降低34.9%(p<0.05),而羽化后第1天的表达水平最高,比蛹期升高95.2%(p<0.001),且在羽化后的第2天RPL22的表达水平降低,接近其他各期表达水平(p>0.05)。以上结果表明,RPL22与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关;RPL22在适度高表达的情况下对细胞产生抗溴氰菊酯的保护作用,而过表达RPL22可能引起转录抑制或对细胞产生毒副作用,导致细胞存活率降低;RPL22在淡色库蚊的不同发育阶段存在表达差异。本研究首次报告了淡色库蚊RPL22全长序列,并发现RPL22为1个新的昆虫抗药性相关基因,为进一步阐明杀虫剂抗性的分子机制和建立抗药性检测方法提供了新的科学依据,具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。
宋云鹏[3]2009年在《淡色库蚊氯菊酯抗性相关视蛋白基因PR-OP全长cDNA克隆与生物信息学分析》文中进行了进一步梳理蚊子是世界性分布的卫生害虫,传播多种疾病,严重威胁着人们的生命健康。目前控制蚊子危害的主要手段是化学防治,在各类杀虫剂中,拟除虫菊酯类因高效低毒成为最常用的一种,但有报导显示,蚊虫已经对拟除虫菊酯类产生了很强的抗药性,使得蚊虫的防治工作变得更加困难,迅速发展的媒介抗药性已成为日趋严重的公共问题。【目的】在抑制性差减杂交和基因芯片技术分离得到的库蚊对氯菊酯抗性与敏感性8条差异表达EST片段的基础上,克隆出淡色库蚊氯菊酯抗性相关全长视蛋白基因并进行生物信息学分析,为阐明视蛋白基因编码蛋白产生的抗药性机理奠定基础。【方法】本实验利用一条差异表达EST片段(NCBI登录号为EC093819)设计基因克隆特异性引物,采用RACE技术克隆全长基因。将测序结果拼接得到cDNA序列,利用NCBI中ORF finder找出基因的开放阅读框,利用ProtParam软件对编码蛋白进行氨基酸残基数目、组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点等参数进行预测,利用ProtScale软件分析编码蛋白疏水性,利用NetPhos2.0 Server程序做磷酸化位点分析,应用SOSUI软件对跨膜区进行预测,利用http://sable.cchmc.org/提供的多种预测方法对蛋白的二级结构进行预测,SignalP3.0软件进行信号肽分析,PSORTⅡ软件进行细胞定位分析,SMART(Simple Modular Architecture Research Tool)软件进行蛋白质结构域分析,应用Swiss Model和PredictProtein对编码蛋白进行叁维结构预测。把序列与核酸数据库(NR)和蛋白数据库(Swissport)进行同源性比对;用ClustalW软件作聚类分析,MEGA做分子进化树。【结果】RACE克隆得到与库蚊抗药性相关的新基因,命名为PR-OP(Genbank登陆号为FJ917744),序列全长为1402bp,开放阅读框长度为1152bp,编码383个氨基酸。生物信息学分析显示基因编码蛋白是G蛋白偶联受体中的视蛋白基因,主要分布于质膜上,具有7个跨膜螺旋并有视蛋白的保守基序,结构符合G蛋白偶联受体的一般特征,与库蚊抗溴氰菊酯视蛋白基因相似性很高,同属于Gq偶联/黑视蛋白亚家族,进化关系与传统分类地位相符合。
参考文献：
[1]. 用SSH结合cDNA芯片分离、鉴定淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关基因*[D]. 田海生. 南京医科大学. 2001
[2]. 淡色库蚊核糖体蛋白L22基因(RPL22)克隆及其与溴氰菊酯抗性关系的研究[D]. 贺骥. 南京医科大学. 2009
[3]. 淡色库蚊氯菊酯抗性相关视蛋白基因PR-OP全长cDNA克隆与生物信息学分析[D]. 宋云鹏. 西北农林科技大学. 2009