张华 吴水生 于虹敏
（福建中医药大学 福建 福州 350122）
【摘要】 目的：研究马钱科胡蔓藤属植物钩吻种钩吻素子在人源肠Caco-2 细胞单层模型中的吸收特性。方法：利用人源结肠腺癌细胞Caco-2 细胞单层模型测试钩吻素子从AP端到BL端以及BL端AP端2个方向的转运过程研究，采用HPLC法对钩吻素子进行定量分析，计算累积吸收量和表观渗透系数(Papp)，并与对照药普萘洛尔和阿替洛尔进行比较。结果：不同浓度钩吻素子由AP端到BL端 (A-B面)的Papp、吸收量与浓度成线性关系，而由BL端到AP 端(B-A面) 的Papp约为A-B面的2倍，提示存在外排现象。结论：钩吻素子可能以被动扩散为主要转运方式被小肠上皮细胞摄取和转运，可以通过小肠上皮细胞被动吸收进入体内。
【关键词】 钩吻素子；Caco-2细胞模型；吸收；转运
【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）14-0056-03
Koumine element under anthropogenic optimization intestinal Caco - 2 the absorption of cell monolayer model transfer research
Zhang Hua, Wu shuisheng *, Yu Hongmin. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian Province, Fuzhou 350122, China
【Abstract】 Objective Study plants of the genus loganiaceae hu vines clasps to kiss a kiss element optimization in anthropogenic bowel Caco - 2 cells the absorption characteristics of single layer model. Methods Using optimization anthropogenic colonic cancer cells Caco - 2 cell monolayer model, test Koumine from the AP to the BL, and BL end AP end, the direction of the two transfer process. Of the hook kiss element child by HPLC method, quantitative analysis, calculating the cumulative absorption and permeability coefficient (Papp), and with propranolol and atenolol. Results Koumine different concentrations by AP end to BL end (A - B side) of Papp, absorbed dose and A linear relationship with concentration, and by the BL end to AP end (B - A side) of Papp is about 2 times A - B below, prompt outside phenomenon exists. Conclusions; Koumine by passive diffusion as the main transportation way, by small intestinal epithelial cells to absorb and transport, can passive absorption into the body through the intestinal epithelial cells.
【Key words】 Koumine; Caco - 2 cell model; Absorption; Transshipment
钩吻（Gelsemium elegans Benth.）为马钱科胡蔓藤属植物，又名胡蔓藤、断肠草、毒根、大茶药、野葛等,是世界著名的剧毒植物。药用其根、茎、叶。性温味辛、苦，有大毒[1]。通常只作外用,具有祛风散瘀、消肿止痛、攻毒杀虫的功能,主治疥癞、湿疹、瘰疬、痈肿、疔疮、体癣、跌打损伤、风湿痹痛、神经痛等[2]。目前对钩吻的研究主要是化学成分的研究，集中在生物碱上[1]。已从该植物分离得到环烯醚萜、生物碱[2]、三萜[3]及苯丙素类[4]、酚酸类与黄酮类[5-6]等化合物。大多文献报道主要集中在对其化学成分、药理毒理作用方面，对解读机制研究报道较少，且药理与毒理的研究往往局限于大鼠，小鼠等动物，对人体中毒机制的研究却甚少见相关基础研究报道。因此，有必要针对人体对钩吻素子的吸收转运进行深入研究，为安全有效利用钩吻素子的高药理活性于人类疾病的治疗奠定基础。
1.材料
1.1 实验仪器
LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)，岛津LCsolution工作站；二氧化碳培养箱(BINDER，德国) ；SW-CJ-2FD 洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；倒置显微镜(NIKON，日本)；Millicell -ERS 跨膜电阻仪，Millicell 小室(Millipore，美国)；Transwell 24 孔培养板( Corning，美国)；高速冷冻离心机（eppendorf，德国）。
1.2 试剂
Caco-2细胞购于中国科学院上海生科院（原代来源于ATCC: American type culture collection），本次实验过程中所用的Caco-2细胞在25～30代之间。钩吻素子对照品(自制，氢谱、碳谱、核磁共振和质谱数据与文献比较确认，纯度大于99.9％)；胎牛血清（Hyclone，美国）；DMEM高糖培养基，胰蛋白酶，非必需氨基酸，青霉素-链霉素双抗液（GIBCO，美国）；阿替洛尔、普萘洛尔（Sigma，美国）；Hank’s平衡盐溶液（HBSS）(美国Sigma-Aldrich)；甲醇、乙腈均为色谱纯（德国MERCK公司），其他试剂是分析纯。
2.方法
2.1 Caco-2细胞单层模型的建立
于DMEM高糖培养基中培养Caco-2细胞（培养基里含1%非必需氨基酸，10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素双抗液），并于37℃的5% CO2恒温培养箱中培养，隔天进行换液，于6～7天用胰蛋白酶进行消化传代，按比例1：3进行。将Caco-2细胞种植于培养板（Transwell）上的 Millicell 聚碳酸酯膜小室上（Pore sizes 0.4μm）。Caco-2细胞种植在24孔培养板上，在单层细胞培养21～23d后，用跨膜电阻仪检测跨膜电阻，各孔跨膜电阻值均大于空白对照值 100hm/5.0cm2 [7-8]，即符合实验要求，可进行细胞转运实验。
2.2 溶液的配制
精密称取钩吻素子适量，以DMSO为溶剂，制备浓度为1.0mg/mL的钩吻素子储备液。吸取钩吻素子对照品溶液适量，用HBSS 缓冲液配制成质量浓度为 50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的钩吻素子溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
2.3 吸收转运和外流实验
分别收集顶端和底端的HBSS缓冲液，作为空白对照液；向底端注入1.5mL HBSS 缓冲液，向顶端注入0.5mL已制备的钩吻素子样品溶液，置于恒温水浴摇床（37℃，50r/min）温育。钩吻素子给药后于30、60、90、120、180min分别收集两端的溶液，单孔取点，每点平行3个孔。底端取样、顶 端 给 药测定分析即为吸收转运(AP→BL)试验；顶端取样、底端给药测定分析即为外流转运(BL→AP)试验。当AP端给药时，AP端取样400μL，BL端取样1300μL；当BL端给药时，BL端取样500μL，AP端取样450μL。取出的样品迅速冷冻，-20℃冻存。
2.4 样品处理
取样品10000r/min 离心10min，完全转移上清液，用甲醇稀释后进样 2OμL用于HPLC分析。
2.5 色谱条件
色谱柱为依利特C18色谱柱（150mmX4.6mm，5μm）；检测波长为 254nm；乙腈：0.1％三乙胺(20：80)为流动相；流速1.0 m L/min；柱温 30℃；进样量20μL。
2.6 数据分析方法
表观渗透系数Papp值的计算:Papp=(dQ/dt)/(A×C0)，其中Papp的单位cm/s，dQ/dt为单位时间内药物转运量(μg/s),A是转运膜的表面积(0.6cm2)，C0为供给池(donor)的初始质量浓度(μg/mL)。吸收率(%)为:A%=100×Q/(C0×V)，Q为累计转运量(μg)，C0为供给池中药物的初始质量浓度(μg/mL)，V为供给池的体积(mL)。在每次实验中取样后都要进行补液过程，药物浓度产生了稀释作用，因此，必须对药物累积吸收质量浓度 TRcum(μg/mL)进行校正：
其中 Cn(μg/mL)为第n个样品浓度的测定值；Vn(mL)为第n个样品的取样体积；VR(mL)为接收池的体积。每数据点为平行三孔的均值，以x-±s表示。
3.实验结果
3.1 Caco－2细胞单层模型实验
按标准操作规程[9],将阿替洛尔在Caco－2细胞单层模型中吸收转运的(2.34±0.09) /107cm／s与标准操作规定值～1.0／107cm／s对照比较，认为二者数量级一致，故将阿替洛尔作为阴性对照药；同理将普萘洛尔的 Papp值Papp(2.46±0.28)／105cm／s与标准操作规定值2.75／105cm／s对照比较，将普萘洛尔作为阳性对照药。
3.2 钩吻素子的吸收转运速率
顶端(AP端)或底端（BL端）给药，钩吻素子的给药浓度为50、100、200μg/mL。恒温水浴摇床（37℃，50r/min）温育90min 后，分别取给药端和接收端培养液，按“2.4项”方法处理，“2.5项”条件分析和“2.6项”方法计算，钩吻素子从AP端到BL端的吸收转运Papp和从BL端到AP端的外流转运 Papp，见表1.在小檗碱钩吻素子不同质量浓度的情况下，其BL-AP的Papp大于AP-BL的Papp，且比值大于1.5，钩吻素子可能是P-gP糖蛋白的底物。
4.讨论
4.1 Caco-2细胞模型作为研究药物吸收的筛选的工具，在细胞水平上提供药物分子透过小肠黏膜的分布、吸收、转运、代谢以及毒性的综合信息，现已成为探索药物相互作用和药物吸收机制研究等的重要工具[10]。其具有操作相对简单，重复性较好,应用范围较广的特点。本实验条件下，在 Caco-2细胞单层模型呈良好转运的阳性对照药普萘洛尔的吸收率(%)大于60%，呈难转运的阳性对照药阿替洛尔的吸收率小于10%，说明本实验所用 Caco-2细胞单层具有良好的紧密性、完整性和转运能力。
4.2 关于钩吻素子的吸收机制研究国内尚未见文献报道。本研究采用Caco-2单细胞层模型研究钩吻素子透过单细胞层的双向转运特征，结果显示，在浓度与吸收关系的实验中，随着钩吻素子浓度的不断增加，AP→BL及B→APL的吸收转运速率呈线性趋势增加，无饱和现象，这一现象说明钩吻素子在Caco-2细胞单层模型的转运方式可能为被动扩散，提示钩吻素子在50-200μg/mL浓度范围内的吸收是以浓度差为动力的被动扩散方式透过细胞的，无需转运载体。可结合钩吻素子的体内药动学研究进行验证。PBL- AP/PAP-BL为1.5～2.4，外排大于吸收，提示钩吻素子的转运可能存在外排转运蛋白的参与，但哪种转运蛋白参与钩吻素子的外排，有待继续深入研究。
【参考文献】
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基金项目：福建中医药大学校管课题X2012025
通讯作者：吴水生，（1965-），男，教授
论文作者:张华,吴水生,于虹敏
论文发表刊物:《医药前沿》2016年5月第14期
论文发表时间:2016/6/21
标签：细胞论文; 浓度论文; 单层论文; 模型论文; 洛尔论文; 药物论文; 溶液论文; 《医药前沿》2016年5月第14期论文;