钱文斌[1]1999年在《急性白血病细胞B7分子表达调控及基因转染的初步研究》文中指出目的: B7分子(B7-1、B7-2)等共刺激分子和T细胞表面的CD28分子相互作用是诱导和调节T细胞免疫的中心环节。B7分子表达缺陷是肿瘤细胞逃避免疫监视的主要机理之一。因此,通过调节肿瘤细胞B7分子表达以增强机体抗肿瘤免疫应答是目前肿瘤免疫治疗的重要策略之一。体外研究表明,大多数急性白血病细胞缺乏B7-1和B7-2分子表达。在体外实验中,将B7-1基因转染到急性髓细胞性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞中,可使B7-1分子高表达。用基因转染的白血病细胞作瘤苗,在动物实验中可产生持久的抗白血病细胞的T细胞免疫反应。可见,B7分子基因转导是增强白血病细胞免疫原性的重要途径。在白血病B7分子瘤苗研究中,有关基因转染的效率、寻找新的转染载体等方面都是十分重要的课题,值得进一步研究。另一方面,细胞因子是调节B7分子的主要因素。许多研究表明,粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)等能上调白血病细胞B7-1和B7-2的表达,进而诱导特异性细胞毒T细胞(CTL)活性。也有研究者报道,GM-CSF、IL-4和IFNγ不能使AML细胞的B7-1表达增加。我们注意到1998年Varas等报道IL-7能诱导胸腺细胞产生树突状细胞。由于IL-7能使淋巴细胞和造血细胞增殖。因此我们推测IL-7可能会影响白血病细胞B7分子的表达。为了进一步探讨新的、有效的细胞因子,使白血病细胞B7分子上调;以及探讨基因转染在白血病中的应用,为急性白血病的免疫治疗新方法提供理论和实验依据,我们应用重组人IL-7(rhIL-7)诱导白血病细胞的B7-1和B7-2分子表达,并研究了其对白血病细胞免疫原性的影响及其机制。应用
吴鸿雅[2]2007年在《鼠抗人B7-H4单克隆抗体的研制及B7-H4分子在肿瘤细胞中表达特性的分析》文中研究指明B7-H4分子是新近发现的B7家族又一负性协同刺激分子。尽管其mRNA在淋巴和非淋巴组织中呈广泛性表达,但由于受到转录后水平的严格调控,B7-H4蛋白仅在正常组织中呈现微弱的表达。越来越多的研究发现,在肿瘤组织如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肾癌和腺样囊性癌等的肿瘤细胞以及肿瘤相关巨噬细胞中异常高表达B7-H4分子。在B7-H4信号的作用下,肿瘤周围的CD3+T细胞数量显著减少,活化CTL的增殖受到明显抑制,机体抵抗肿瘤的免疫应答大为削弱。与此同时,B7-H4分子还能抑制肿瘤自身的凋亡,促进上皮细胞恶性转化,为肿瘤免疫逃逸提供了必要的条件。临床研究发现,肿瘤细胞B7-H4的表达与临床和病理学特征息息相关。高表达B7-H4的患者往往肿瘤恶性程度高,预后结果差。此外,在肿瘤患者血清中高水平可溶性B7-H4分子的存在,还为肿瘤患者的临床诊断,尤其是卵巢癌的早期发现,提供了新的检测指标和依据。为此,继负性协同刺激分子B7-H1,B7-H4成为研究肿瘤免疫逃逸和临床诊断治疗的新热点。本研究旨在以高表达B7-H4的基因转染细胞为抗原,应用细胞融合技术,研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为进一步探求B7-H4分子在肿瘤免疫逃逸中的生物学特性和意义提供有效的研究手段,进而为临床诊断、预后和治疗开拓新的道路。一.鼠抗人B7-H4分子功能性单克隆抗体的研制及生物学特性的鉴定【目的】研制鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为探讨人B7-H4分子在免疫细胞上的表达特性及其介导的负性信号对人T淋巴细胞抑制作用的效应提供必备的研究手段。【方法】以高表达人B7-H4分子的基因转染细胞株293T/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以该基因转染细胞293T/B7-H4作为阳性筛选细胞,以转空质粒的对照细胞293T/Mock作为阴性对照细胞。经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,获得能特异分泌鼠抗人B7-H4分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制以及Western blot等实验对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法初步分析单抗对正常人外周血淋巴细胞表面B7-H4蛋白的识别作用以及单核-树突状细胞诱导过程中B7-H4分子表达的变化。向293T/B7-H4与T细胞的混合反应体系中加入单抗3C8,用3H-TdR掺入法检测单抗对B7-H4信号抑制活化T细胞增殖的阻断效应。【结果】成功获得了1株持续、稳定分泌鼠抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C8,细胞核型分析显示,杂交瘤细胞株的染色体数目在100条以上,超过小鼠B细胞和SP2/0细胞的染色体数,为两者融合体细胞;快速定性试纸分析显示,这株单抗轻链为κ链,重链为IgG1亚类; Western blot分析结果显示单抗3C8能与B7-H4分子特异性结合,形成阳性条带;单抗识别的抗原表位分析结果表明,单抗3C8与商品化抗体H74识别的抗原表位较为接近,而与科室已有的一株鼠抗人B7-H4单抗1G7的抗原识别表位完全不同。流式细胞仪检测结果表明,单抗3C8能检测到健康人外周血CD14+单核细胞上B7-H4的表达,而在CD4+、CD8+、CD19+和CD56+淋巴细胞上则均未检测到B7-H4分子。此外,在单核-树突状细胞的诱导过程中,IL-4能下调B7-H4的表达,而LPS刺激imDC后则能上调表达B7-H4,GM-CSF对B7-H4表达的影响不明显。3H-TdR结果显示,单抗3C8能有效地阻断B7-H4信号对活化T细胞增殖的抑制效应。【结论】成功获得了1株持续、稳定分泌鼠抗人B7-H4阻断型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其不同的抗原表位为进一步研制可溶性B7-H4分子ELISA试剂盒奠定了良好的基础。同时,健康人外周血CD14+单核细胞上B7-H4表达的变化以及单抗3C8对B7-H4信号地阻断作用,为进一步研究机体免疫自稳和免疫调节开拓了道路。二.B7-H4分子在肿瘤细胞中表达特性的初步研究【目的】探寻肿瘤细胞和肿瘤微环境中B7-H4分子的表达特性,为进一步研究B7-H4与肿瘤免疫逃逸及其相互关系开拓新的途径。【方法】采用间接免疫荧光标记法和流式细胞术分析不同来源人肿瘤细胞株以及肿瘤患者胸、腹水中CD14+单核细胞膜表面B7-H4分子的表达;采用细胞免疫组化分析B7-H4分子在肿瘤(肺癌)细胞株中的分布;Western blot鉴定肿瘤和肿瘤微环境中B7-H4蛋白的表达形式和糖基化修饰水平;同时运用RT-PCR技术检测B7-H4分子在mRNA水平上的不同剪接形式,探求不同表达形式的B7-H4分子与肿瘤逃逸的相关关系。【结果】在多株肿瘤细胞,尤其是上皮性肿瘤细胞株(如:肺癌、胃癌)表面存在B7-H4分子的表达。肿瘤患者胸、腹水中的单核细胞不同于健康人外周血单一的B7-H4+单核细胞,存在B7-H4+和B7-H4-两个群体。细胞免疫组化实验显示,肿瘤细胞株胞浆中也存在大量的B7-H4分子。Western blot结果表明,肿瘤细胞株、肿瘤浸润性单核细胞以及健康人外周血单核细胞中B7-H4分子量大小均在34KD左右,分子量较小,而RT-PCR结果则显示,在这些肿瘤和肿瘤相关的细胞中没有检测到B7-H4分子剪接体的存在。【结论】多株肿瘤细胞以及肿瘤患者胸、腹水中CD14+单核细胞虽然都以正常大小的B7-H4cDNA转录本为主,但其表达的B7-H4蛋白分子量较小,糖基化水平不高。低糖基化水平B7-H4分子在肿瘤和肿瘤微环境中所发挥的调控作用及机制值得关注和进一步深入探讨。此外,肿瘤患者胸、腹水中CD14+B7-H4+和CD14+B7-H4-是否分别代表着具有不同免疫调节功能的单核巨噬细胞亚群仍有待进一步探明。三.抗人B7-H4单克隆抗体3C8可变区基因的克隆及嵌合轻、重链基因的拼接【目的】在已获得的功能型单抗3C8的基础上,克隆和拼接嵌合轻、重链基因,为抗体人源化构建和改造铺平道路。【方法】根据抗体保守的框架区和前导序列设计简并引物,采用RT-PCR技术克隆出单抗3C8的轻重链可变区;应用生物信息学方法对所扩增的序列进行CDR区的分析和二级结构定位、天然信号肽预测、抗体可变区二级拓扑结构分析以及三维模拟。采用TP-PCR法将分析正确的鼠源性抗体可变区基因分别与人IgG1和κ链恒定区进行拼接,形成嵌合轻、重链基因。【结果】成功克隆到了含有信号肽序列的鼠抗人B7-H4单克隆抗体轻、重链可变区基因;经生物信息学分析,抗体轻链可变区由V1-117*01和J1*01两个亚群基因重排后形成,而重链可变区则由V1-14*01和J4*01以及D2-2*01三个亚群基因重排后形成。其轻、重链信号肽切割位点分别位于SSS-DS和VHS-EV,在第19-20个氨基酸之间。二级拓扑结构和三维模拟显示,所获序列除信号肽区为α-螺旋外,其他部分主要由β-折叠构成,抗体CDR区位于反向平行的β-折叠之间,暴露在整个蛋白的表面,可与抗原相互结合。经PCR拼接获得的嵌合轻、重链基因大小分别约为750bp和1500bp,与理论值相一致。【结论】抗体可变区基因的成功克隆及拼接,可变区CDR区域、二级拓扑结构分析以及三维结构的模拟,为进一步展开抗体3C8的人源化以及基于DNA点突变技术的抗体亲和力改变实验打下了坚实的基础。综上所述,本项研究成功获得了1株能稳定分泌特异性鼠抗人B7-H4分子的新型功能型单抗,它能有效阻断B7-H4信号;其抗体可变区基因的克隆及嵌合轻、重链的拼接为继续开展抗体人源化和靶向B7-H4分子的肿瘤免疫治疗提供了必要的物质基础。此外,多株肿瘤细胞以及肿瘤患者胸、腹水中CD14+单核细胞虽然都以正常大小的B7-H4cDNA转录本为主,但其表达的B7-H4蛋白分子量较小,糖基化水平不高。低糖基化B7-H4分子在健康人外周血和肿瘤患者胸、腹水中CD14+单核细胞上表达强度的差异,也将为我们探索机体免疫自稳和肿瘤免疫逃逸提供新的线索。
佚名[3]2010年在《基础免疫》文中指出脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
佚名[4]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中认为14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显著差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
佚名[5]2005年在《国家自然科学基金委员会生命科学部2005年度资助自由申请科学基金项目一览表》文中研究表明项目名称申请者姓名依托单位1微生物学学科(99项)我国云南热带、亚热带地区含羞草、羊蹄甲和决明根瘤菌的刘晓云西南林学院遗传多样性、系统发育研究我国酸性土壤分离的诺卡氏菌型放线菌的DNA指纹图谱鉴定张建丽北京理工大学和分类研究中国外瓶霉分子系统学分析李东明
徐芝立[6]2018年在《协同刺激分子B7-H3在人膀胱尿路上皮癌表达的临床意义及作用机制研究》文中研究说明目前,膀胱癌在我国是泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤,尿路上皮癌是其最常见的病理类型。寻找特异性膀胱肿瘤标志物以提高膀胱癌诊断及预后判断的准确性是亟待解决的问题。B7-H3是协同刺激分子B7家族重要成员,是典型的Ⅰ型跨膜蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族。自从B7-H3展现出肿瘤免疫共调节功能后,众多学者开始关注人体肿瘤组织中B7-H3的表达与临床意义。既有研究显示,B7-H3分子可能作为肿瘤相关抗原在肿瘤的诊断和预后判断中具有重要价值。第一部分B7-H3分子在人膀胱尿路上皮癌组织中的表达及临床意义目的:研究B7-H3分子表达水平与膀胱尿路上皮癌临床病理参数的相关性,探讨其在尿路上皮癌患者肿瘤手术预后的指导意义。方法:1.免疫组织化学法检测膀胱尿路上皮癌患者行部分切除或根治性切除的肿瘤标本中B7-H3分子表达水平。2.卡方检验分析B7-H3表达与膀胱尿路上皮癌临床病理参数关系。3.生存分析Kaplan-Meier法检测患者术后生存情况。结果:1.在134例膀胱尿路上皮癌患者中,肿瘤组织B7-H3阳性高表达93/134例(69.4%),低表达41/134例(30.6%),阳性高表达率明显高于癌旁和正常膀胱组织(15/60例,25.0%;11/60例,18.3%;P<0.05)。膀胱癌组织中,B7-H3表达水平与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤分期、复发、淋巴结转移无明显相关(P>0.05),但B7-H3高表达患者的脉管侵犯和肿瘤远器官转移比例明显高于B7-H3低表达患者(69.9%vs.46.3%;49.5%vs.26.8%),差别有统计学意义(P=0.009;P=0.015)。2.生存分析显示,与B7-H3低表达患者相比,B7-H3高表达患者在膀胱部分切除或根治性切除术后的总体生存率及无进展生存率明显降低(P=0.002;P=0.020)。小结:1.膀胱癌细胞高表达B7-H3分子的患者出现脉管侵犯、远处器官转移的比例更高,术后生存率明显低于B7-H3低表达组患者。2.B7-H3分子的表达水平可以作为膀胱癌术后肿瘤进展及患者生存状况的有效预测指标。第二部分人膀胱尿路上皮癌组织中B7-H3分子与CD163~+肿瘤相关巨噬细胞的关系及在预后中的意义目的:检测人膀胱尿路上皮癌组织中B7-H3分子表达水平与CD163~+肿瘤相关巨噬细胞浸润程度(TAMs)的相关性,并探讨两者单独或联合预测膀胱部分切除或根治性切除手术后患者肿瘤进展与死亡风险预后意义。方法:1.免疫组织化学法检测膀胱尿路上皮癌患者行部分切除或根治性切除的肿瘤组织中CD163~+TAMs浸润程度。2.卡方检验分析CD163~+TAMs浸润程度与临床病理参数相关性。3.Spearman检验分析CD163~+TAMs浸润程度与B7-H3分子表达水平相关性。4.Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型进行生存分析,并探讨B7-H3分子与CD163~+TAMs对肿瘤进展与死亡风险的协同影响。结果:1.膀胱尿路上皮癌组织中,CD163~+TAMs浸润程度与患者性别、年龄、病理分级、肿瘤分期、复发、淋巴结转移等无明显相关(P>0.05),CD163~+TAMs高度浸润患者的脉管侵犯和肿瘤远转移比例明显高于CD163~+TAMs低度浸润患者(74.6%vs.53.3%;52.5%vs.34.7%),差别有统计学意义(P=0.012;P=0.038)。2.Spearman相关检验显示,膀胱尿路上皮癌组织中B7-H3表达水平与CD163~+TAMs浸润程度呈正相关,有统计学意义(r=0.230,P<0.01)。在134例膀胱尿路上皮癌患者中,生存分析显示CD163~+TAMs浸润程度与患者总体生存时间(OS)、无进展生存时间(PFS)无明显相关性(P=0.074;P=0.090);而且CD163~+TAMs浸润程度与患者总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险亦无明显相关性(P=0.290;P=0.525;P=0.355)。而在CD163~+TAMs高浸润层组中,B7-H3高表达的患者比B7-H3低表达患者的总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险均明显升高(P=0.002;P=0.004;P=0.018)。在134例患者队列中,B7-H3高表达组患者的总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险均明显高于B7-H3低表达组患者(P=0.001;P<0.001;P<0.001);在55例局限性膀胱癌患者中,B7-H3表达水平与总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险则无相关性(P=0.138;P=0.269;P=0.147)。小结:1.膀胱尿路上皮癌组织中,CD163~+TAMs高浸润患者出现脉管侵犯、远处器官转移的比例更高。2.CD163~+TAMs的浸润程度与B7-H3表达水平有明显的正相关性。在CD163~+TAMs高浸润层组中,B7-H3高表达患者的总体死亡风险、肿瘤特异性死亡风险及肿瘤进展风险均明显高于B7-H3低表达患者。3.CD163~+TAMs浸润程度可以联合B7-H3分子的表达水平作为膀胱癌部分或全切除术后患者死亡风险的预测指标。第三部分RNA干扰B7-H3基因表达对膀胱尿路上皮癌T24细胞恶性行为影响的研究目的:通过shRNA靶向干扰膀胱尿路上皮癌T24细胞B7-H3基因表达,观察B7-H3mRNA、蛋白表达以及细胞增殖、侵袭能力的变化,探讨其影响机制。方法:1.将携带B7-H3 shRNA的重组慢病毒载体LV-B7-H3-RNAi稳定转染T24细胞,建立沉默B7-H3基因表达的T24细胞(T24/B7-H3-siRN)。2.Western blot、RT-PCR实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的B7-H3mRNA和蛋白的表达情况。3.Western blot、RT-PCR实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的基质金属蛋白酶MMP-2 mRNA和蛋白的表达情况。4.MTS增殖实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的增殖能力变化。5.Transwell实验检测T24/B7-H3-siRNA细胞的侵袭能力的变化。结果:1.成功利用重组慢病毒载体建立了外源基因稳定转染的膀胱尿路上皮癌T24细胞系(T24/B7-H3-siRNA)。2.T24/B7-H3-siRNA细胞的B7-H3 mRNA表达水平(0.0952±0.0012)明显低于T24/control siRNA对照组(0.4638±0.0010)以及T24无基因转染细胞组(0.4650±0.0008),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。3.T24/B7-H3-siRNA细胞的B7-H3蛋白表达水平(0.1364±0.0015)明显低于T24/control siRNA对照组(0.1772±0.0008)以及T24无基因转染细胞组(0.1783±0.0019),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。4.T24/B7-H3-siRNA细胞的MMP-2 mRNA表达水平(0.0654±0.0031)明显低于T24/control siRNA对照组(0.4340±0.0028)以及T24无基因转染细胞组(0.4360±0.0005),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。5.T24/B7-H3-siRNA细胞的MMP-2蛋白表达水平(6.0190±0.1339)明显低于T24/control siRNA对照组(16.0327±0.0952)以及T24无基因转染细胞组(16.1658±0.2902),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。6.MTS增殖实验显示,T24/B7-H3-siRNA细胞的增殖速度明显低于T24/control siRNA对照组和T24无基因干扰对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。7.Transwell侵袭小室实验显示,T24/B7-H3-siRNA细胞通过人工基底膜(Matrigel基质)的细胞数(58.4±2.0)明显少于T24/control siRNA对照组(110.2±6.4)和无基因转染T24细胞组(113.6±7.8),差异有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。小结:1.该部分实验利用重组慢病毒载体携带小干扰RNA(siRNA)稳定转染膀胱尿路上皮癌细胞T24,靶向干扰B7-H3基因表达,成功建立B7-H3低表达的T24细胞系。2.T24/B7-H3-siRNA组的细胞增殖、侵袭能力明显受到抑制,提示B7-H3参与了膀胱癌的进展、转移过程。结论:1.膀胱尿路上皮癌细胞B7-H3分子的表达阳性率明显高于癌旁及正常膀胱组织。B7-H3高表达患者更容易出现脉管侵犯、远处器官转移。B7-H3分子的表达水平有可能作为膀胱癌部分切除或根治性切除术后肿瘤恶性进展及患者生存时间的预测指标。2.膀胱尿路上皮癌组织中CD163~+TAMs高浸润患者更容易出现脉管侵犯、远处器官转移。CD163~+TAMs的浸润程度与B7-H3表达水平有统计学意义的正相关性。B7-H3分子的表达水平可以单独或联合CD163~+TAMs浸润水平作为膀胱癌部分切除或根治术后死亡风险的预测指标。CD163~+TAMs浸润水平不能单独作为患者术后生存时间和死亡风险的独立预测指标。3.通过shRNA干扰T24细胞B7-H3基因表达,T24细胞B7-H3mRNA、蛋白表达以及细胞增殖、侵袭能力均显著降低。B7-H3可能参与T24细胞的增殖、侵袭等肿瘤恶性行为,可以作为膀胱癌基因治疗的潜在靶点。
赵月莹[7]2012年在《白血病NASCT患者CTL克隆细胞的初步研究》文中进行了进一步梳理目的恶性肿瘤所致的死亡率中,白血病在男性中居第六位,女性中居第八位,儿童及35岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷获得缓解；移植和免疫治疗。CTL (Cytotoxic T cell, CTL)细胞目前在血液临床方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。根据移植物的来源不同移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植(Auto-HSCT)无GVHD,移植后生活质量较高,但因无GVLE (graft-versus gost effect,GVLE),易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞,复发问题可能会在一定程度上得以解决。或自体移植的基础上输入一定量的供者来源的白血病细胞特异性的CTL细胞,增加GVLE,在某种程度上可能会改变自体移植的效果。异基因造血干细胞移植(Allogeneic stern cell transplantion, Allo-SCT),由于存在GVLE,使得一些患者能够得以长期生存,然而伴随而来的移植物抗宿主病(Graft versus host disease,GVHD)-.严重感染,植入失败,造血重建延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL细胞是GVHD及GVLE的效应细胞,也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。供者淋巴细胞输注(Donor lymphocyte transfusions, DLT)能诱导出GVLE消除白血病复发,CTL细胞是它的主要效应细胞。DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症,如何得到最佳疗效,使DLI得到更好的应用,是现在临床面临的一大课题。ALL细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原(LFA-1),ALL对NK的治疗效果差,CTL细胞似乎成了除了药物唯一能针对ALL肿瘤的效应细胞了。CTL细胞在免疫治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。临床上发现,植入是否成功以及GVHD的严重程度与移植后供、受体T细胞比例显著相关。异基因干细胞移植即便是完全供者型,也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞,找出针对自身肿瘤细胞的受者的CTL克隆,发挥RVLE (Recepient-versus leukemi effect, RVTE),在排斥及RVLE之间找到最佳平衡点,不仅能发挥自身识别肿瘤的免疫清除功能,而且协同供者成分发挥杀瘤效应,同时有助于了解代替免疫与过继免疫的理念,分析临床上见到的一些患者移植失败后并无疾病复发获得长时间生存,而一些患者在完全供者嵌合(FDC)状态下出现原疾病复发的原因。Wilms tumor antigen-1(WT1)过度表达在70%-90%的ALL病人中,而这样的病人有着高的复发率。体外及小鼠研究中的证实,WT1是一个有意义且广泛表达的白血病抗原靶标。髓性白血病和健康供者中有WTl特异性的T细胞,说明WTl的表达很容易诱导出T细胞反应。WT1特异性的CD8+的T细胞和白血病肿瘤负荷减轻密切相关。高度纯化CD8+T细胞混合骨髓移植会产生高GVL效应低的致死性GVHD已得到证实。如果能够培养分离出具备高度选择性杀伤白血病细胞的CTL克隆,对正常细胞无明显作用,无GVHD,无排斥,宿主完全耐受,扩增率高并能在体内增殖,具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力,那么分离GVHD与GVL即将成为可能,改善自体移植效果成为可能,增进过继免疫治疗成为可能。那么如何在体外得到高度纯化的抗原特异性CTL细胞?这就是本实验的主要研究目标：拟在体外分离培养CD8+WT1特异性的CTL细胞克隆,并从多方位鉴定其功能特性及其来源,为进一步的研究及应用打下坚实的基础。方法一、体外DC培养树突状细胞(dendritic cell, DC)主要的功能就是特异性抗原提呈。成熟DC加工处理抗原肽-MHC-1复合物,并提呈给T细胞。DC传统培养方法大致需要4-10天,前几天为诱导分化期,最后一天为诱导成熟期。DC成熟所需时间太长,与体外CTL培养不能同步。我们改进了DC培养为2天诱导成熟法。与传统培养法及7天培养法方法比较：(1)利用四色流式细胞技术进行表型分析。(2)利用倒置显微镜及瑞-吉染色行形态观察。(3)通过HLA-A*0201同型的Tc细胞对WT1/HLA-A*0201阳性肿瘤细胞NB4的杀伤率来评价DC的提呈功能。二、健康供者CTL细胞单个克隆培养(1)免疫磁珠分选CD56-CD8+细胞：HLA-A*0201健康供者外周血单个核细胞(PBMNC)行免疫磁珠去CD56+的细胞(NK)细胞,再行CD8阳选,PHA/WTI肽间段性刺激下行体外扩增。(2)流式细胞分选：以CD19-细胞群中设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞为目的CTL细胞,收集。(3)饲养细胞的制备：三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者PBMNC进行γ-射线50Gy照射,制备成饲养细胞。(4)CTL细胞克隆制备：所分选的目的细胞行有限稀释法制备单个克隆,按比例与抗原负载的DC及饲养细胞混合后体外扩增培养。(5)CTL克隆细胞表型鉴定：流式检测CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a分子的表达率。(6)CTL克隆胞内分子检测：流式检测胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率。(7)分泌功能检测：CBA法检测IL-2、IL-4、1L-6、IL-10、TNF-α、IFN-y、IL-17在CTL细胞培养上清的浓度。(8)细胞毒性的检测：克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率来鉴定其细胞毒功能。三、白血病NASCT患者外周血来源的CTL单个克隆培养(1)体外刺激扩增：加用刺激因子与WT1肽进行体外特异性Tc细胞诱导扩增。(2)扩增后的Tc细胞流式分选：CD3+CD19-细胞群设门,WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞分选后收集(CTL细胞)。(3)三人份非HLA-A*0201阳性的健康供者外周血单个核细胞进行Y-射线50Gy照射,制备成饲养细胞。(4)有限稀释法制备克隆细胞,按比例混合抗原负载的DC及饲养细胞体外扩增培养。(5)流式检测克隆表型分子CD45RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a的表达率。(6)CTL克隆细胞胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率检测。(7)CBA法检测克隆细胞分泌的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17的浓度。(8)克隆细胞对标准瘤株及白血病原始瘤苗杀伤率的检测来鉴定其功能(CFSE/PI双标法)。四、白血病NASCT患者与健康供者体外培养CTL克隆的比较研究利用上述方法体外平行培养两类不同来源的CTL克隆,进行表型、毒性颗粒、分泌及杀伤功能鉴定。五、CTL克隆细胞来源与功能的镜下研究(一)性别染色体荧光原位杂交(FISH)区别CTL克隆的来源选用5例供受者性别差异的白血病移植后患者体外CTL克隆细胞进行性别探针杂交,荧光显微镜下观察杂交信号,根据x,Y染色体的不同信号来鉴定克隆来源。(二)激光共聚焦扫描镜下观察CTL克隆的形态与功能选取受者为HLA-A*0201阳性、供者非HLA-A*0201阳性的白血病HLA半相合NASCT后患者体外培养WTl特异性CTL克隆细胞,WT1/HLA-A*0201/Pentamer-PE标记CTL细胞,PKH26标记DC, CFSE标记靶细胞NB4(WT1及HLA-A*0201双阳性的人急性早幼粒细胞白血病瘤株),共同孵育2h,镜下观察形态与功能。(三)扫描电镜观察克隆细胞细微结构与功能白血病移植后患者WT1阳性的CTL克隆细胞体外培养4-6周后,收集细胞并依次与DC及NB4细胞以一定比例混合培养2h后,收集处理细胞,镜下观察克隆细胞的功能。六、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆蛋白表达差异分别选取三份健康人及白血病患者移植后体外扩增培养6周后的CTL克隆细胞,收集细胞裂解、提取蛋白、测浓度、双项电泳、染色、扫锚、图像分析。建立蛋白差异谱,确定差异蛋白,酶切,质谱分析。健康人外周淋巴细胞及白血病移植后外周血未培养的淋巴细胞做为基础蛋白差异谱对照,生物信息检索分析找出反应蛋白。结果一、体外树突状细胞培养1、3种方法培养的未成熟及成熟DC在形态上无差别；2、3种培养法未成熟DC表型存生明显差异：传统培养法CD1a,CD86(P<0.01),CD83,HLA-DR(P<0.05)的表达均明显高于2天法；传统培养法CD1a(P<0.01)的阳性表达率明显高于7天法；7天培养法CD83,HLA-DR(P<0.05)的表达明显高于2天法；7d法的CD83(P<0.05)明显高于传统法；成熟DC表型差异：2天培养法与7天培养法无差异；2天培养法CDla,CDllc,CD80,HLA-DR的表达明显高于传统培养法(P<0.05)；7天培养法CD80,CD83的表达明显高于传统培养法(P<0.05)；3、3种培养法成熟DC的抗原活性：2天及7天培养法DC辅助Tc对靶细胞的杀伤率(75.8±7.1)%,(74.6±3.2)%明显高于传统法(65.2±1.3)%(P<0.01)。二、健康供者CTL克隆细胞培养与鉴定1、表型：CD3+CD8+的细胞占(98.7±0.2)%,CD27占(62.3±10.0)%,CD28占(71.9±7.9)%；CD107a占(49.0±11.0)%,CD45RA占(65.1±8.4)%,CD45RO占(34.3±±4.2)%,CCR7占(18.1±5.2)%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：(43.9±7.4)%,穿孔素：(32.7±6.8)%。3、CTL克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+细胞群占(9.0±2.0)%；CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+的细胞群占(13.0±2.4)%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-细胞群占(26.1±±5.9)%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(61.3±7.9)%。4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(76±3.9)%。5、分泌功能(pg/ml)：IL-2浓度为(2129.5±±414.7)、IL-4(17.5±9.1)、IL-6(21.6±9.7)、IL-10(24.8±8.6)、TNF-α(40.8±21.5)、IFN-γ(102.3±61.0)、IL-17(18.5±8.6)。6、对NB4的杀伤率(89.7±7.6)%明显高于对U937和K562杀伤率(19.0±4.3)%,(19.7±5.2)%,P<0.05。对白血病原始瘤苗AML和ALL的杀伤率(54.0±16.6)%,(56.5±12.4)%,无差别P>0.05。三、白血病NASCT患者CTL克隆细胞的培养与鉴定1、表型：CD3+CD8+的细胞占(98.6±0.5)%,CD27占(66.3±8.1)%,CD28占(70.1±7.8)%；CD107a占(51.4±7.7)%,CD45RA占(65.7±6.3)%,CD45RO占(33.9.1±4.5)%,CCR7(17.1±2.7)%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：(40.6±9)%,穿孔素(30.9±6.2)%。3、克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+占(12.6±3.2)%CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+占(17±4.6)%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占(19.5±3.6)%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(62.1±7.4)%。4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(70.2±8.5)%。5、分泌功能：IL-2(2365.0±246.1)%、IL-4(40.5±8.3)%、IL-6(1705.3.6±416.2)%、IL-10(63.2±22.2)、TNF-α(121.3±35.3)%、IFN-γ(219.5.3±65.1)%、IL-17(14.5±5.0)%。6、对NB4的杀伤率(84.5±5.1)%明显高于对U937和K562杀伤率(21.5±5.5)%,(22.3±6.5)%,P<0.05。对白血病原始瘤苗AML和的杀伤率(66.4±7.6)%明显高于对ALL的杀伤率(58.6±5.6)%,P<0.05。四、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆比较两者表型无差异：毒性颗粒表达率无差异；患者分泌的细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ明显高于健康供者(P<0.01),IL-17无差别(P>0.05)；细胞毒功能未发现明显差别。五、白血病NASCT患者CTL克隆来源与功能研究1、FISH发现了白血病NASCT患者体外培养CTL克隆中有受体的CTL细胞；2、LMST发现白血病NASCT后受者的CTL细胞并直接观察到其细胞毒性。2、高分辨扫锚电镜下观察,发现培养的CTL克隆细胞呈典型T细胞形态,与DC细胞间有丝状物交通联络,并杀伤溶解靶细胞的功能。六、两类单克隆CTL细胞蛋白表达差异1、NASCT患者与健康供者外周血未培养的淋巴细胞蛋白差异点有30个,鉴定出13个功能明确的蛋白。2、白血病NASCT患者与健康供者CTL克隆细胞差异蛋白点44个,鉴定出25个功能蛋白,明显上调的18个,下调的12个,4个为未命名蛋白。3、白血病及移植相关的共同反应蛋白有4个,分别为Coactosin-like protein、Septin-1]、 Purine nucleoside phosphorylase, GATA3。结论(1)2天诱导成熟的DC形态功能都达到功能DC的标准,这种培养方法是成功的。(2)健康人与白血病患者体外CTL单个克隆培养方法是成功的、在体外能有效扩增(单个细胞扩增到1-5×107个细胞),扩增成功率为78%。经一系列鉴定,培养的克隆细胞表型、功能均为功能性CTL细胞。(3)培养的CTL克隆细胞亚群包括一定比例的记忆细胞表型,说明克隆细胞是由一个细胞分化增殖形成不同阶段的细胞亚群组成。(4)白血病NASCT患者来源的CTL克隆分泌功能明显比健康供者的CTL克隆旺盛。(5)免疫磁珠分选结合五聚体流式分选可以得到高纯度的CD8+的CTL细胞,可以做为单个克隆培养的备用细胞。(6)HLA限制性肽特异性的五聚体与FISH相互补充,可以鉴定一部分NASCT患者CTL克隆的来源。(7)健康供者与白血病NASCT患者之间的PBMNC及CTL克隆在蛋白表达上存生着明显差异。
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