范海涛[1]2003年在《兔骨髓间充质干细胞的生物学特性及用于大段骨缺损修复的实验研究》文中认为创伤、感染、肿瘤切除和发育异常等疾病导致的骨缺损发病率很高，严重影响患者的生活质量，是临床治疗的难题。目前，人们多采用新鲜自体骨移植治疗，但由于骨来源的限制及治疗相关并发症等问题，限制了该方法的广泛应用。因此，研究新的治疗策略已十分必要。最近，组织工程技术的发展为治疗大段骨缺损提出了新的思路，即将活细胞体外培养扩增后接种于某些特殊支架材料上，以构建生物人工组织，植入受体后在局部微环境的作用下发挥细胞的成骨效应。支架材料为细胞提供机械支持、迁徙通路、血管植入环境和黏附表面，而细胞固有的生物学信号促使其增殖分化成熟。然而，种子细胞的来源及其生物学特性、支架材料的组成、材料与细胞的复合方法以及植入细胞的体内功能变化等，都是悬而未决的问题。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的叁维空间复合体。理想的骨种子细胞应具有以下几个特点：取材容易，在体内外具有较强的传代能力，同时保持其成骨分化能力；在体外培养中易定向分化为成骨细胞，植入机体后能适应受区生理、病理、应力等生物学环境改变并保持成骨活性。骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)符合上述标准，它不仅具有良好的成骨细胞分化潜能，还易于外源基因的导入和表达，因此，有可能作为种子细胞在组织工程领域中得到广泛的应用。本研究采用兔大段骨缺损动物模型，探讨骨髓MSCs作为种子细胞在骨组织工程领域中的应用。参考人骨髓MSCs分离培养方法，我们将兔骨髓细胞经过密度为1． 073g／ml的Percoll分离液分离骨髓单个核细胞，用含10％筛选血清的低糖DMEM进行培养。随后的实验结果证明，用这种方法分离的MSCs的形态与人骨髓MSCs相似，呈纺锤型贴壁生长；体外培养细胞倍增时间为20小时左右，说明其增殖较快；组织化学染色结果显示，所分离的兔MSCs细胞化学特征为糖原强阳性(PAS)，部分细胞碱性磷酸酶(ALP)阳性(阳性率约5％)，苏丹黑阴性(SB)，酸性醋酸酯酶(ANAE)弱阳性，非特异性脂酶(NSE)阴性；细胞周期分析表明，G0／G1、 S和G2M所占比摘要，3-例分别为84.56%，3.26%和12.18%。结果提示体外培养的MSCS具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的增殖期，大部分的细胞处于静息期。对所获MSCS的功能研究结果显示，兔骨髓MSC具有多向分化能力，即体外可以诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。MSCS成骨细胞诱导分化过程中，6~8天以后细胞形态开始变化，碱性磷酸酶活性开始上调。随着诱导时间的增长，细胞形态逐渐变为多角样，碱性磷酸酶活性逐渐增强。异位成骨实验表明，MSCS植入体内后12周可在肌肉组织内形成类骨组织，显示细胞具有体内成骨能力。上述实验证实，本研究分离到的兔骨髓MSCs具有干细胞的特性，在体外能够较方便地大量扩增，同时该细胞体内外均具有成骨细胞分化潜能，为下一步的体内研究打下基础。 我们通过合适的方法，制成聚DL一乳酸/磷酸叁钙/J型胶原复合物，其性能上互相取长补短，将TCP引入聚DL--乳酸可改善聚 DL--乳酸机械性能差，降解速度快，骨结合力弱等缺点。将I型胶原引入基质材料可显着提高材料与组织细胞的相互作用，利于细胞豁附。本研究所分离的兔BMSCS接种于PDLL刀TCP后的扫描电镜结果显示，MSCS不仅勃附于材料表面，而且能够移行入叁维支架材料内部，说明我们所设计材料的孔径及孔隙率较为合适，在移植于动物体内后这种结构可提供宽大的表面积和空间，利于细胞粘附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入，代谢物产出，也有利于血管和神经长入。 在动物体内骨缺损修复研究部分，本研究采用了大段骨缺损模型(1 .scm)，同时设计了叁个实验组。A组为材料复合细胞组;B组只用材料而不加细胞;C组为空白对照组，即无细胞无材料组。 术后2周X线片显示C组(无材料、无细胞)只有沿尺侧骨膜部分成骨，中间仍缺损。A组(细胞+材料)有较明显的成骨反应，B组(材料)材料与骨折部位空隙明显，无明显成骨反应。由此可见材料中的MSCS已经发挥其种子细胞的作用，从而启动其成骨发生过程。此结果与体外成骨细胞诱导分化结果较为一致。术后X线片显示，A、B组材料自4周开始出现局部降解，8周后随着骨量的明显增加X线透射率减低，12周时兔大段骨缺损已基本修复，但A组修复明显较B组好，而C组沿尺侧部分成骨，挠侧仍有缺损。 为进一步研究MSCs在体内的成骨过程，我们对MSCS体内骨组织修复过程进广摘要一4-行了连续的组织学观察。发现2周时细胞复合材料组即有成骨细胞形成及胞外基质分泌，8周时可见新生血管形成，12周时出现部分类骨结构。电镜切片观察也获得了相近的结果。提示MSCS复合生物材料后可在损伤局部自发启动体内成骨过程，和骨折等病理状态下的骨修复相似，但成骨速度远较生理过程缓慢，而且在观察的时间段内未出现完整的骨缺损修复。 总之，本实验建立了一种简便可行的兔MSCs培养方法，细胞增殖能力强，并可定向分化为成骨及脂肪细胞。利用大段骨缺损模型的研究发现，体外培养的MSCS接种PDL
王晶[2]2007年在《骨髓间充质干细胞成骨分化影响因素分析及体内成骨研究》文中研究说明目的：探讨影响人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外成骨分化的某些相关因素。观察人MSCs构建组织工程骨体内异位成骨能力。检测兔骨髓MSCs构建组织工程骨修复骨缺损的效果。方法：体外培养、鉴定人骨髓MSCs。检测地塞米松(dexamethasone，Dex)、雌激素及冻存等对人MSCs成骨分化相关基因及蛋白表达的影响。利用MTT法及电镜观察人MSCs在壳聚糖一磷酸钙骨水泥支架上生长情况，并将工程化骨植入兔肌袋模型中，用组织学及免疫组化等方法检测其体内异位成骨能力。分离、培养、诱导兔骨髓MSCs并构建组织工程骨，原位植入兔桡骨骨缺损，通过影像学、组织学及生物力学等手段检测其骨修复效果。结果：人骨髓MSCs表达CD29及CD44抗原，在体外可分化为成骨、软骨和脂肪细胞。10~()-8mol／L Dex可促进人MSCs的ALP mRNA表达而抑制PPARγ2 mRNA转录，当Dex浓度为10~(-7)mol／L时则作用相反。雌激素可上调人MSCs的BMP-2mRNA表达。细胞冻存对人MSCs成骨诱导后ALP及Ⅰ型胶原表达没有影响。壳聚糖-磷酸钙支架具有速固化、多孔结构及较好的力学强度，对人MSCs增殖和活力无明显影响。人MSCs构建的组织工程骨在兔体内可异位成骨。兔MSCs构建的组织工程骨可修复大段骨缺损，其力学强度接近正常骨。结论：Dex及雌激素可对人MSCs成骨分化产生影响，冻存不会损害MSCs的成骨分化能力。壳聚糖-磷酸钙骨水泥理想的理化性能和细胞相容性，人MSCs与之构建组织工程骨在体内可异位成骨。兔MSCs构建组织工程骨可原位成骨修复骨缺损。干细胞组织工程技术可用于骨缺损修复。
夏琰[3]2013年在《组织工程化纳米—羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架的制备及其相关性能的研究》文中研究说明研究背景由于创伤、畸形、肿瘤等疾病导致的骨缺损是骨科医生所面临的十分棘手的难题。传统骨移植手段包括自体骨和异体骨移植。自体骨移植虽是骨修复策略中的金标准，但由于其来源有限，术后并发症多，临床应用有限；异体骨移植虽来源充足，但其外源性易引发机体剧烈的排斥反应，移植成功率低。因此，开发能够弥补上述不足的骨移植材料是当前研究的热点与难点。近些年来，飞速发展的组织工程技术也许有望担当此重任。研究目的本研究以无机的羟基磷灰石与有机的聚己内酯作为原材料，使用快递成型技术中的一种——选择性激光烧结技术构建人工骨支架，并将其与能够持续分泌人骨形态发生蛋白-7的种子细胞相复合，制备出组织工程化纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架，通过对该组织工程化人工骨支架的表征、体外生物相容性、生物活性以及骨缺损修复能力进行检测与分析，证明了组织工程化纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架的临床应用潜力，为其今后在骨缺损治疗中的应用奠定了一定的实验基础。研究方法1.制备纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架：本部分研究以纳米级羟基磷灰石与微米级的聚己内酯为原材料。根据反应方程式（10Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8NH3H2O→Ca10(PO4)6(OH)2+20NH4NO3+6H2O）制备得到纳米-羟基磷灰石粉末；通过深温冷冻粉碎技术，制得微米级别的聚己内酯粉末。通过扫描电镜和X线衍射等表征检测，证明所制备的两种粉末材料正是本研究所需的两种物质，同时符合了本研究对原材料粒径大小的需求。使用V型混合机将两种材料的混合粉末混合5min、15min、30min、45min、1h、2h，混合完成后，扫描电镜观察混合的均匀度以确定最佳混合时间。根据最佳混合时间，制备出不同的质量比的纳米-羟基磷灰石与聚己内酯混合粉末。通过对选择性激光烧结机器参数的不断摸索及优化，确定出制备纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架的最优参数。对制备完成的各组支架，经宏观观察、扫描电镜、孔隙率、抗压强度、MTT、ALP染色及茜素红染色等检测，考察各组支架的形态结构、力学强度、生物相容性与生物活性，比较并筛选出综合性能最佳的纳米-羟基磷灰石/聚己内酯支架，以作为后续体内实验的样品。2.制备转基因种子细胞：本部分研究首先从新西兰兔股骨骨髓中分离、提取出骨髓间充质干细胞，并进行培养、传代，传至第3代时即可用作实验。根据GenBank中人骨形态发生蛋白-7（hBMP-7）的基因序列（基因序列号：NM001719），利用基因工程技术，制备出重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP，对该重组腺病毒载体进行酶切与测序验证。将验证正确的重组腺病毒载体进行包装、扩增与纯化，293细胞感染剂量法测定重组腺病毒的滴度。通过体外基因转染的方法将hBMP-7转染到先前制得的兔骨髓间充质干细胞上，得到本研究所需的转基因种子细胞，经RT-PCR、Western blot与钙结节染色，以观察转基因种子细胞在体外环境中目的基因hBMP-7的表达情况及其对骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导作用。3.纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架与转基因种子细胞的复合本部分研究通过建立新西兰兔股骨局部骨缺损及桡骨大段骨缺损模型，将单纯聚己内酯支架、纳米-羟基磷灰石/聚己内酯支架以及纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞支架分别植入骨缺损部位，通过植入后不同时间点的影像学与组织学检查，以观察并评定各组支架对新西兰兔骨缺损的修复情况，并由此探索纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架与携带有hBMP-7目的基因的种子细胞结合后是否具有协同促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。研究结果1.羟基磷灰石与聚己内酯粉末的扫描电镜与X线衍射结果显示，所制备的两种材料粉末分别达到了纳米级别与微米级别，同时其与标准样品的符合率均达到了99%以上，表明这两种材料粉末达到了本研究对原材料的要求。V型混合机将两种材料的混合粉末混合5min、15min、30min、45min、1h、2h后的扫描电镜结果表明，1h的混合均匀度与2h相似，但较5min、15min、30min、45min均为高，因此确定，1h为最佳混合时间。将两种材料粉末按照纳米-羟基磷灰石：聚己内酯=0:100、5:95、10:90、15:85、20:80的比例混合，根据摸索与优化出的选择性激光烧结机器参数，以烧结纳米-羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架，烧结完成后，人工骨支架的扫描电镜、孔隙率、抗压强度、MTT、ALP染色及茜素红染色等试验结果显示，选择性激光烧结技术所制备出的支架具有相互连通的叁维孔隙结构，随着纳米-羟基磷灰石比例的增高，人工骨支架的孔隙率略微随之下降，但力学强度却有着显着提高，达到了7Mp；MTT的结果显示各组人工骨支架均具表现出良好的生物相容性；同时，ALP染色及茜素红染色的染色结果表明含有纳米-羟基磷灰石的组的人工骨支架的生物活性明显优于纯聚己内酯组，且随着纳米-羟基磷灰石含量愈高其生物活性愈强。2.从新西兰兔骨髓中分离、提取出骨髓间充质干细胞，并进行培养、传代，传至第3代时用作实验。利用基因工程技术，成功构建出重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP，酶切测序并验证。结果显示此核酸序列与PUBMED中公布的hBMP7序列(NM-001719)的编码序列100%吻合，证明且插入片段方向正确。梯度稀释重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染293细胞，48h后荧光计数法进行病毒感染滴度测算，得到重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染滴度约为1.1×1011v.p./ml。使用该重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP转染3代兔骨髓间充质干细胞后第1-3d荧光计数情况。以出现较高的细胞转染效率、较轻微的细胞毒性反应以及较经济的病毒用量为判定标准，确定该重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP转染兔骨髓间充质干细胞的最佳感染复数（MOI）为50:1。选用最佳感染复数（MOI=50:1）感染兔骨髓间充质干细胞。以重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP感染兔骨髓间充质干细胞为实验组，以Ad-CMV-ires-eGFP感染兔骨髓间充质干细胞为对照组，以兔骨髓间充质干细胞不进行处理为空白对照组，连续诱导培养3周。诱导培养期间于第4、7、14、21、28d，hBMP7的PCR实时定量测定与Western blot结果表明：重组腺病毒载体Ad-CMV-hBMP7-ires-eGFP转染兔骨髓间充质干细胞后能够有效介导外源目的基因的表达，且被转染细胞的hBMP7表达在14d时到达高峰，在21d时开始下降。培养期间倒置显微镜下观察到，实验组细胞随着培养时间的延长，逐步出现成骨诱导样形态改变，细胞由纺锤形转变为立方形、多角形，同时有点状钙化斑出现。同时，诱导培养第4、7、14、21、28d的ALP染色、I型胶原PCR实时定量测定、茜素红染色的实验结果显示：实验组的ALP染色阳性强度最高；I型胶原的表达最多；钙结节数量多，形态明显，这亦表明实验组中被转染的兔骨髓间充质干细胞被成功的诱导并开始向成骨细胞方向分化。3.分别建立新西兰兔股骨外上髁处直径6mm，深度10mm的局部骨缺损以及新西兰兔桡骨中段长度为20mm的大段骨缺损模型，并植入相应材料，植入后逐层缝合切口。术后常规肌肉注射抗生素7天。术后1-14天观察显示，各组植入材料区域均无感染现象，各实验动物伤口愈合良好，所有切口Ⅰ级愈合。以上结果表明，植入的材料对实验动物无明显不良影响。术后3w、6w、9w及12w的Micro-CT结果显示，纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞支架植入组，其骨缺损修复情况较其余3组明显为优，9w时其局部骨缺损包括皮质骨几乎已修复完毕，12w时骨缺损区域生成的新骨结构完整、连续，骨髓腔大部分已通，缺损几乎完全修复。同时植入区域病理切片示，各植入组未见有明显的不良炎症反应和免疫反应，且纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞支架植入组的新骨生成量明显多于其余各组，且在9w和12w时，植入的材料已经出现较为明显的降解，降解部分多被纤维组织或新生骨所替代。研究结论选择性激光烧结技术作为快速成型技术的一种，能够根据计算机叁维模型，进行快速、批量的加工生产，表明其在组织工程，乃至骨科临床领域具有巨大的应用潜力。以纳米-羟基磷灰石与聚己内酯粉末为原材料，通过选择性激光烧结技术所制备出的人工骨支架，经实验证明，具有高度联通的叁维孔隙结构，较高的孔隙率，较为优秀的力学强度，同时亦具有出色的生物相容性及生物活性。以腺病毒为载体，将人骨形态发生蛋白-7基因转染进兔骨髓间充质干细胞后，可以明显促进兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向的诱导分化。将纳米-羟基磷灰石/聚己内酯+转基因种子细胞相复合所构建出的组织工程化人工骨支架，较单纯的人工骨支架，具有更为显着的骨缺损修复能力，展现了其在临床骨缺损治疗上广阔的应用前景。
向慧[4]2010年在《BMP-9基因转染羊骨髓间充质干细胞的实验研究及其修复同种异体羊大段骨缺损的初步研究》文中研究表明目的通过体外培养羊骨髓间充质干细胞(BMSCs),并利用骨形态发生蛋白-9(BMP-9)基因转染BMSCs,接种于可吸收明胶海绵在体外构建组织工程骨;并将该组织工程骨复合物移植到羊胫骨大段骨缺损处,了解转染及未转染BMP-9的BMSCs的生物学特性,探讨其在大动物体内的成骨效果及其临床应用价值。方法体外全骨髓贴壁法培养羊BMSCs,应用腺病毒介导BMP-9基因转染BMSCs:倒置显微镜下观察转染前后细胞形态变化;MTT法测定转染前后细胞生长曲线;荧光显微镜观察转染效率;BMSCs碱性磷酸酶(ALP)活性半定量测定及Von Kossa’s钙结节染色观察转染前后细胞功能变化;将转染及未转染BMP-9基因的羊BMSCs与可吸收明胶海绵共培养;短暂体外培养后手术将复合物分组移植到4只羊胫骨大段骨缺损处;于不同时间点(4周、12周)行X线摄片和组织切片行HE染色观察骨基质的生成情况。结果腺病毒介导的BMP-9转染羊BMSCs与未转染的BMSCs形态稍不同;生长周期基本一致,接种后2~3天为生长迟滞期,3天后进入对数生长期,6~7天为生长平台期,其后生长速度减缓;细胞转染率为80%;转染组BMSCs的ALP活性较未转染组明显增高(p<0.05),Von Kossa’s钙结节染色比较转染细胞形成的钙结节明显大于未转染组;荧光显微镜观察见BMSCs在可吸收明胶海绵内生长良好。4周X线摄片见骨缺损处转染组有新生骨组织成像显影,12周后显影增大;未转染组4周时未见明显新生骨组织成像显影,12周时模糊显影; HE染色见:未转染组内有部分新生骨形成,而转染组形成的新生骨组织较多。结论羊等大型动物BMSCs培养较小型动物更困难。采用贴壁法成功培养出羊BMSCs具有较强的遗传稳定性和增殖能力。BMP-9基因转染羊BMSCs,可促进BMSCs向成骨细胞增殖分化。转染了BMP-9的BMSCs在可吸收明胶海绵上生长良好,成功构建了BMP-9基因修饰的组织工程骨。BMP-9基因修饰的BMSCs可作为骨组织工程的种子细胞。
谭洪波[5]2010年在《骨软骨脱细胞基质材料研制及修复功能动物实验研究》文中研究表明研究背景:关节骨软骨由软骨,软骨下骨及之间的连接结构构成。人体关节活动使用量巨大,极容易在创伤、肿瘤及急慢性炎症中导致关节软骨或骨软骨损伤。软骨损伤也常会发展致滑膜、关节囊及软骨下骨,导致骨软骨损伤,骨软骨损伤通常伴随关节机械应力改变,如不治疗会进一步导致退行性关节炎发生,患者功能障碍及生活质量下降。关节软骨无血液、淋巴及神经,仅包含单一软骨细胞,细胞外基质细胞比高并且缺少局部祖细胞,关节软骨自身修复能力很差。关节软骨下骨主要对关节软骨起支撑作用,软骨下骨损伤通常采用替代物植入治疗,替代物的血管化不足将不能及时修复,大块骨缺损将明显影响其支撑作用。骨软骨之间的连接结构包含深层透明软骨、潮线、钙化软骨、粘合线及上层软骨下骨,其结构微细并复杂,骨软骨连接区损伤可能会影响其重要的生理功能。关节软骨及骨软骨损伤自身修复困难,关节骨软骨损伤治疗成为目前骨关节外科难题之一。对软骨及骨软骨缺损修复方法较多,较有效的方法包括采用具备软骨、软骨下骨及其间的连接结构的自体及异体骨软骨移植;而仅对软骨的修复较具潜力的方法主要是组织工程技术,其中MACI(基质介导自体软骨细胞移植)技术能达到部分透明软骨修复效果,显示较好的前景。MACI对骨软骨损伤修复欠佳,而骨软骨移植物来源有限,但MACI及骨软骨技术提示带软骨、软骨下骨及其间的连接结构的骨软骨单元移植并结合种子细胞可能是骨软骨修复的潜在方案。理想的体外构建的组织工程替代结构应该模拟关节组织的自然成分及结构进而恢复其正常功能,国内外对组织工程骨软骨复合组织的构建研究,从“分层构建”的可行性初探到“一体构建”的动物实验研究取得了阶段性成果,然而目前尚存在缺损区修复组织质量缺陷、与宿主界面整合欠佳及缺乏相应力学功能等主要问题。由于骨及软骨脱细胞在技术上取得一定进展,通过粉碎软骨并采用脱细胞试剂处理的方法可以将细胞成分去除,而保留软骨细胞外基质成分。本课题拟在此基础上,分别将含骨软骨之间连接结构的组织及软骨进行脱细胞,利用脱细胞基质材料制备含生物来源骨软骨连接结构的骨软骨支架材料。该支架包含深层透明软骨、潮线、钙化软骨层、粘合线、软骨下骨板等生理骨软骨连接结构,软骨侧构建软骨脱细胞基质支架,保留脱细胞软骨下骨,尽量模拟了骨软骨结构。通过体外接种骨髓来源间充质干细胞构建细胞-材料复合体,植入体内修复动物骨软骨缺损模型并观察软骨生成效果;并且采用骨髓来源分离扩增的内皮祖细胞接种脱细胞骨基质材料修复动物大段骨缺损,通过血管化来促进大段骨缺损的修复,为研究软骨下骨缺损修复提供新的方法。本研究将为仿生制备骨软骨复合支架材料提供依据,同时为构建更为复杂的组织工程关节创造条件。在研究内容上主要包括:(1)分别将软骨粉、软骨片及骨软骨复合组织脱细胞处理并鉴定;(2)构建含骨软骨连接结构的脱细胞骨软骨复合组织工程支架;(3)利用骨髓间充质干细胞复合含骨软骨连接结构的骨软骨支架修复羊膝关节负重区骨软骨缺损模型;(4)采用脱细胞骨基质接种骨髓来源内皮祖细胞修复兔尺骨大段骨缺损。方法:1.将天然人软骨在蛋白酶抑制剂保护下粉碎,采用离心分选软骨微粒,经过软骨脱细胞处理后制备软骨脱细胞微粒悬液,行组织学及生化定量分析检测。2.制备直径为8mm含骨软骨连接结构的骨软骨组织块,其软骨侧仅保留约100μm透明软骨,经脱细胞处理后予组织学,生化定量分析检测。采用冻干法及化学交联法制备含骨软骨连接结构的脱细胞骨软骨支架,培养羊骨髓间充质干细胞,将羊骨髓间充质干细胞接种于骨软骨支架两侧,体外培养7天行组织学,组织相容性和细胞毒性检测。3.制备羊负重区骨软骨缺损模型,分空白、植入空白支架及植入细胞支架复合物3组,3月后处死动物取标本行大体及组织学检测。4.构建脱细胞骨支架及骨髓来源内皮祖细胞复合物,制备兔尺骨缺损模型,分空白,脱细胞骨支架及细胞支架复合物3组修复兔尺骨缺损,2,4,8周处死动物取标本行组织学检测。结果:1.组织学显示直径100μm以内软骨细胞微粒通过软骨脱细胞处理后无细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色,番红O及二型胶原免疫组化染色成阳性,光镜下见软骨基质结构部分保留;生化定量结果表明DNA成分去除,保留大量细胞外基质成分;2.组织学显示含部分透明软骨的骨软骨组织块脱细胞处理后无细胞碎片残留,软骨侧甲苯胺蓝染色,番红O及二型胶原免疫组化染色成阳性,骨软骨连接结构功能基本保留;生化定量结果表明DNA成分去除,保留大量细胞外基质成分;含骨软骨连接结构的脱细胞骨软骨支架经组织学检测骨软骨支架连接完好,羊骨髓间充质干细胞在支架上生长良好,软骨侧番红O及二型胶原免疫染色阳性,电镜及组织学显示细胞生长良好,有细胞外基质分泌;3.修复羊负重区骨软骨缺损模型实验结果显示细胞支架复合修复组骨软骨有较好修复,空白支架组软骨下骨基本修复、软骨侧无明显修复,空白对照组未见明显修复,缺损边缘软骨退变;4.骨髓来源干细胞能通过体外分离扩增,接种骨髓来源的内皮祖细胞的脱细胞骨基质支架体内修复大段骨缺损后,修复组织内微血管密度较空白支架组高(p<0.05),并能对兔尺骨大段骨缺损进行一定程度的修复。结论:粉碎的软骨微粒、厚度100μm左右软骨片及仅含100μm厚透明软骨的骨软骨组织通过脱细胞处理,均可去除组织内细胞成分,保留大部分细胞外基质结构功能;通过冻干及化学交联可制备含骨软骨连接结构脱细胞骨软骨支架,该支架软骨侧为软骨脱细胞多孔支架,软骨下骨侧为脱细胞骨,骨软骨连接结构保留,该支架具备良好细胞相容性,无明显细胞毒性;含骨软骨连接结构的脱细胞骨软骨支架接种种子细胞能较好的修复羊负重区骨软骨缺损;脱细胞骨支架及骨髓来源内皮祖细胞复合物,对兔尺骨缺损修复及促进微血管生成具备一定作用。
简月奎[6]2007年在《改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究》文中研究指明研究背景:由于创伤、骨病或肿瘤引起的大段骨缺损是骨科临床上经常遇到的棘手问题之一,目前常用的方法是植骨术。移植物来源包括自体骨、同种异体骨、异种骨及各种无活性的人工骨等。自体骨移植存在来源有限、取骨处有并发症、二次手术等缺陷;同种异体骨有伦理、传播传染性疾病、免疫排斥及来源亦有限等;异种骨除了伦理、传播疾病之外,作为移植材料最大的障碍是免疫排斥;各种无活力的人工骨只是单纯的人工替代材料,存在降解困难或降解速率与骨生长速率不一致,影响成骨或机体功能。组织工程学的兴起为大段骨缺损的修复带来了新的希望。利用体外细胞培养技术将种子细胞扩增并和可降解的生物材料复合培养构建有生命活力的组织,植入体内修复缺损,重建骨的功能已不再是遥远的梦想。目前自体细胞来源的组织工程骨研究动物实验已取得了骄人的成绩,并已初步试用于临床,取得了一定的成功。然而,支架材料仍是制约组织工程骨大规模临床应用的瓶颈,制备来源丰富、价格低廉、性能优良的支架材料是研究热点之一。近年来国内外虽然有异种骨用于骨组织工程支架材料的许多研究,如Keil骨、Bio-Oss骨等,但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题。基于此,本实验以猪股骨为原料制备异种脱蛋白骨,在制备工艺上作了改进,主要是尽量保留胶原蛋白,去除非胶原蛋白、肽类、脂类及细胞等,在降低抗原性的同时保留力学强度,作了理化性能、生物安全性、细胞相容性及小型动物成骨等检测。并以制备的异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料与山羊自体骨髓间充质干细胞复合,加入成骨性骨诱导因子rhBMP2构建组织工程骨修复山羊胫骨中下段20%节段性缺损,观察成骨能力和免疫排斥反情况,为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床提供实验依据。目的评估改良法制备异种脱蛋白骨(Xenogenic Deprotein Bone,XDPB)作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段骨缺损的能力,并对XDPB的免疫原性,新生骨的数量、质量进行评价,为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床应用提供实验依据。方法(一)异种(猪)脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究:参照改良法制备,将制备的脱蛋白骨放入-80℃超低温冰箱冷冻3月后取出,真空包装,Co60照射后置-20℃保存。计算每块脱蛋白骨的平均质量、大小,扫描电镜观察并测定材料的孔径和孔隙率,氨基酸分析仪检测氨基酸种类和含量,万能生物力学测试仪检测材料的抗压缩、叁点抗弯曲等力学指标。部分脱蛋白骨块于术前浸入含rhBMP2浓度为75ng/ml溶液中2h备用。(二)山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测。1.MSCs培养:在山羊髂骨处用骨穿针穿刺抽取约10ml骨髓,分离MSCs,培养、收集细胞。2. MSCs生物学特性观察:活细胞动态观察、倍增时间;3.MSCs定向诱导分化:第二代细胞进行成骨、成脂诱导培养及钙染色、脂肪染色、ALP染色、ALP活性测定和Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色等。(叁)异种脱蛋白骨支架材料的细胞相容性研究。1.异种脱蛋白骨支架材料与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养:倒置镜、扫描电镜观察细胞在材料表面、孔隙内附着、生长和增殖情况。2.异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究:山羊24只,分两组,自体骨对照组6只(自体骨)和实验组18只(异种脱蛋白骨),分别于术后0、3、7、14、28、56天抽外周血,流式细胞仪检测细胞免疫和ILISA检测体液免疫指标。3.在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究:培养山羊MSCs,传至第叁代,细胞同步化后加入BrdU培养。观察BrdU标记的MSCs形态,将BrdU标记的MSCs与XDPB复合培养7天后植入山羊自体内,术后4周处取出移植材料检测标记细胞。(四)异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的临床观察:山羊24只,分4组,每组6只,在每只山羊左侧胫骨中下段造成胫骨总长度20%节段性骨缺损,据不同植入材料不同命名为A组(单纯XDPB)、B组(XDPB+自体MSCs)、C组(自体骨)及D组(XDPB+自体MSCs+rhBMP2),采用半环槽式外固定器固定。术后即时、4、8、12、16、20、24周对各组山羊进行摄X片,24周处死山羊取右侧胫骨进行双能X线(DEXA)、血管化、生物力学和组织学检测。结果(一)异种(猪)脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究:新制备的XDPB块肉眼观呈白色,略带黄色,长条状,质硬脆,见大量蜂窝状孔隙。光镜下见骨块疏松多孔,孔隙较规则,孔中残留物少。扫描电镜该材料具有原始骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统,具有天然的网孔结构,平均孔径(386.55±25.64)μm,孔隙率(75.33±2.35)%。氨基酸分析胶原类氨基酸(Gly、Arg、Lys)波峰较高,芳香簇氨基酸酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)波峰消失。力学检测除弹性模量升高外,抗压缩、叁点抗弯曲破坏载荷及破坏极限载荷与新鲜骨差异无统计学意义。(二)山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测:1.MSCs培养:原代MSCs接种后1～2天开始贴壁,5～6天形成集落,12～14天长成单层,绝大部分细胞呈梭形,形态均一,分布不均。传代细胞2～4小时完成贴壁,5～6天铺满瓶底,形态更加单一,均匀分布,排列成有规则的方向性。细胞数量在第3天明显增加,第6天达峰,倍增时间为35.5小时。2. MSCs鉴定:成骨诱导培养10～12天形成圆形或卵圆形钙化结节,ALP染色染成灰黑色,核固红染色呈红色结节状,Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色细胞浆内有大量黄色颗粒。成脂诱导培养10～12天出现圆形脂肪小滴,油红O染色呈桔黄色脂肪滴。(叁)异种脱蛋白骨支架材料的相容性研究。1.异种脱蛋白骨支架材料的与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养:倒置镜、扫描电镜观察显示山羊MSCs在材料孔隙内生长、分化增殖,在相同时间点细胞增殖测定显示细胞增殖峰值、细胞数量与单纯培养组差异无统计学意义(P>0.05)。2.异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究:异种脱蛋白骨植入组细胞免疫指标在术后3天和7天有轻度升高,14天以后逐渐下降,自体骨组无明显变化,在同一时间点统计学分析两组差异无统计学意义(P>0.05)。体液免疫指标术后无明显变化。3.在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究: XDPB复合BrdU标记的山羊自体MSCs植入术后4周,免疫荧光检测可见BrdU标记细胞在XDPB网孔内生长增殖。(四)异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的动物实验研究:异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损:术后1～15周,空白对照组骨缺损处无骨形成,随时间延长出现骨端硬化,髓腔闭合。术后1～24周,实验组表现为:在同一时间点, X线、骨密度、生物力学、血管化水平和组织学,C组>D组>B组>A组,D组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05),A、B组与C、D组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.本改良法制备的XDPB支架不引起明显细胞和体液免疫反应,有良好的相容性;2.通过BrdU细胞标记技术显示,自体MSCs在DPHP内良好存活、生长并成骨;3.改良法制备异种脱蛋白骨能够作为组织工程支架修复山羊胫骨大段骨缺损;4.本法制备的异种脱蛋白骨的免疫原性低,不影响自体MSCs成骨,若再结合rhBMP2,其成骨能力与自体骨相当。5.单纯XDPB修复骨缺损能力最差,B组其次,复合自体MSCs和rhBMP2组成骨能力和自体骨相当。
王玉路[7]2011年在《兔骨髓间充质干细胞片（MSCs）包裹新型rhBMP-2-硫酸钙支架修复兔大段尺骨缺损的实验研究》文中指出研究背景：随着我国经济和交通的高速发展,高能量的各种车祸伤创伤等所导致的骨缺损越来越多；以及骨组织感染、肿瘤切除和发育异常等疾病等导致的骨缺损发病率也在增高。这不仅给患者和社会带来沉重的经济负担,而且也严重影响患者的生活质量,是临床治疗的难题。目前,临床多采用新鲜自体骨移植治疗,但由于骨来源的限制、二次损伤及治疗相关并发症等问题,限制了该方法的广泛应用。因此,研究新的治疗策略已十分必要。最近,组织工程技术的发展为治疗大段骨缺损提出了新的思路,即将活细胞体外培养扩增后接种于某些特殊支架材料上,以构建生物人工组织,植入受体后在局部微环境的作用下发挥细胞的成骨效应。目的：研究复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸钙支架体外对骨髓间充质干细胞分化的影响；其次,在体内,研究骨髓间充质干细胞(MSCs)包裹的复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸钙人工骨支架修复兔长骨骨缺损的作用与效果。方法：1.兔骨髓间充质干细胞的分离与培养：8周龄雄性新西兰大白兔15只,每只动物均行双侧髂骨骨髓穿刺抽取骨髓,体外密度梯度离心法联合细胞贴壁法分离培养扩增新西兰兔MSCs。2.支架对MSCs的成骨分化：将材料做成直径6mm,厚度2mm的圆盘状,放在培养板中,种上密度为5000个/cm2的细胞,常规进行贴壁培养7天、14天后对细胞的碱性磷酸酶含量进行测定。3.干细胞片的制作：将密度为50000个/cm2的细胞悬液用培养基连续培养2-3周,直至形成细胞薄片。将细胞片包裹在硫酸钙支架上备有。4.兔骨缺损修复：选用20只新西兰大白兔,制成单侧前肢15mm的尺骨骨缺损模型,随机分为四组：A组植入单纯硫酸钙支架；B组植入复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸钙支架；C组植入经骨髓间充质干细胞(MSCs)包裹的硫酸钙支架；D组植入骨髓间充质干细胞(MSCs)包裹的复合重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)硫酸钙支架。在术后4周随机处死动物,作下列检测：大体观察、X线检查、microCT、组织学检测、X线片的计算机图像分析、microCT的骨量分析、组织切片的计算机图像分析并对以上结果进行统计学分析。结果：1.体外7天测得碱性磷酸酶含量(nmol/s/mg蛋白)为：rhBMP-2-硫酸钙支架组含量为0.51±0.08,比单纯的硫酸钙组(含量为：0.30±0.03)明显升高(p<0.05)；在14天时,碱性磷酸酶含量rhBMP-2-硫酸钙支架组(1.22±0.21)明显高于单纯硫酸钙组(0.424±0.04),P<0.05；但是,在两个时间点上无论是rhBMP-2-硫酸钙支架组还是单纯硫酸钙支架组的碱性磷酸酶含量都明显高于单纯培养瓶组(P<0.05)。2.标本大体观察：A组缺损大部分由纤维组织连接；B组与c组大体上区别不大,两组的缺损外缘和中间有很多纤维组织,紧靠挠骨处和两个断端周围都有一定量的骨组织存在；D组缺损几乎都被大量骨组织替代；3.X线检查示：B组与C组无明显差别,但是都优于A组(p<0.05)；D组优于B组和C组(P<0.05)。X线评分所示：D组>B组≈C组>A组。4.micro CT与骨量分析：在四周后,各组硫酸钙大部分都已经吸收,A组骨组织非常有限；而B组和C组CT扫描显示有大量骨痂生成,但是在缺损中心以及远离挠骨一侧的缺损处骨量很少,并且髓腔结构不明显；在D组,大量骨痂形成,并且骨缺损已经成骨性愈合,可见大部分髓腔阴影。CT骨量分析示：B组与C组无明显差别,但是都优于A组(p<0.05)；D组优于B组和C组(P<0.05)。5.组织学切片与组织学半定量：组织切片结果与microCT相似,组织半定量也显示B组与C组无明显差别,但是都优于A组(p<0.05)。结论：1.证明硫酸钙支架是生长因子rhBMP-2的良好载体,并可以作为间充质干细胞片附着的良好支架。2.骨髓间充质干细胞片的移植可以有效地促进新骨的生成及骨缺损的愈合。3.rhBMP-2复合硫酸钙诱导成骨的作用也非常明显。4.结论也说明MSCs片包裹的rhBMP-2-硫酸钙支架由于具有成骨的叁要素细胞、诱导因子以及支架结构,可以有效地促进新骨的生成,对于长段骨缺损的修复将发挥很大的作用。
任广铁[8]2014年在《组织工程骨膜修复兔桡骨大段骨缺损的早期观察及BMP-2对组织工程骨膜体外成骨能力的影响》文中提出目的：观察比较由经成骨诱导的同种异体兔骨髓间充质干细胞及猪小肠粘膜下层构建而成的组织工程骨膜及脱蛋白骨对兔桡骨大段骨缺损的早期修复效果,研究人工构建组织工程骨膜并移植修复大段骨缺损的可行性。方法：分离兔骨髓间充质干细胞后经体外增殖诱导,制成细胞悬液接种于猪小肠黏膜下层表面共培养,构建组织工程骨膜。取12周龄新西兰大白兔24只,随机分为3组各8只,手术方法制备单侧桡骨干30mm骨膜-骨缺损模型,A组缺损区植入组织工程骨膜进行修复,B、C组则分别植入单纯猪小肠黏膜下层和脱蛋白骨作为对照。术后4周,行X线检查并杀取标本予以组织学染色及评分,比较不同组别骨缺损修复效果。结果：经放射学和组织学观察,在A组中缺损区町见大量新骨形成并桥连两缺损端；而在B组和C组中未见明显新骨形成。结论：使用组织工程骨膜修复同种异体兔桡骨大段骨缺损是可行的,且明显优于脱蛋白骨。目的：探讨重组人骨形态发生蛋白-2对由猪小肠粘膜下层及兔骨髓间充质干细胞共同构建的组织工程骨膜体外成骨能力的影响,以期构建性能更加优良的产品用于临床。方法：分离兔骨髓间充质干细胞经离体成骨诱导培养,接种于猪小肠黏膜下层构建成为人工组织工程骨膜,分别对其使用含有100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml及不含有重组人骨形态发生蛋白-2的成骨诱导培养基进行培养,7天后行电镜扫描,并对各组在多个时间点采用MMT法绘制生长曲线、测定碱性磷酸酶和骨钙素含量,分析重组人骨形态发生蛋白-2对组织工程骨膜体外成骨能力的影响。结果：加入重组人骨形态发生蛋白-2培养的组织工程骨膜在细胞增殖速度、碱性磷酸酶和骨钙素表达量均高于未加入重组人骨形态发生蛋白-2组,且与浓度成正相关。结论：经体外成骨能力测定,重组人骨形态发生蛋白-2可明显提高组织工程骨膜成骨能力。
吴雪晖[9]2007年在《血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究》文中研究表明骨缺损、特别是大段骨缺损常因战创伤高能量损伤性骨折、严重开放性骨折伴感染、骨不连多次手术植骨内固定失败、骨髓炎病理性骨折及大块死骨切除、先天性胫骨假关节及肿瘤大段骨切除等所致。传统的手术治疗方法极为困难,最终很多病例不得不采用截肢术或用支具保护性负重。因此其治疗成为骨科临床的一大难点,探索新的治疗手段成为当前国内外骨科界的迫切需求。近年来,骨组织工程技术成为骨缺损修复的研究重点。其研究多集中在种子细胞的选择与培养及支架材料的选择与修饰两方面。国内外许多学者和我们的早期研究证明,用组织工程骨修复小段骨缺损时,其早期成骨及后期骨愈合效果明显。但应用大块组织工程骨修复大段骨缺损时,其核心部位往往发生缺血坏死,导致修复失败,其主要原因就在于未能很好解决组织工程骨的血管化问题。目前的主要方法有:(1)血管内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)与成骨细胞(Osteoblast)或血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)加生物材料联合移植。但ECs体外培养的要求很高,周期长,规模扩增相当困难,且成熟ECs的成血管作用较弱。(2)利用血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血管生成素(Angiopoietin,Ang)等与生物材料复合促进血管生长。但直接应用的促血管生长因子在体内迅速降解,达不到理想的效应浓度。因此有学者将各种促血管生长因子的基因转染种子细胞,再将其种植于支架材料表面构建组织工程骨后植入骨缺损部位,这是组织工程骨血管化的主要研究方向之一。但存在如何提高转染率,使细胞高效表达及生物安全性问题。(3)应用显微外科技术将成骨细胞、生物材料及带血管蒂的组织瓣包埋或血管束植入重建组织工程骨血运。此方法造成异位创伤,且治疗周期长。因此,对于皮肤、心脏瓣膜等较薄的组织工程移植体,其血运的重建能较容易地在早期完成,而对于体积较大、功能复杂的骨组织,其早期血管化问题就成为了目前限制组织工程骨修复大段骨缺损应用的关键所在。血管内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)最早由Asahara等于1997年报道,它是一群具有游走特性,尚未表达成熟血管内皮细胞表型,体外培养后能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。它不仅参与人胚胎血管生成,而且在骨髓、脐带血及外周血中均存在能在出生后的血管新生过程中有很强的促血管生成作用,并以血管发生方式形成新生血管的EPCs。这一发现,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论,为缺血性疾病的治疗提供了新的思路。近年来,有关EPCs在成体血管形成中作用的研究主要集中在缺血心肌、缺血肢体、损伤角膜、损伤皮肤的修复等方面。随着日益成熟的分离培养、诱导和扩增技术,EPCs可以相对容易地从外周血或骨髓中获得。因此,本实验拟从动物自体骨髓中分离出单个核细胞,经体外培养、诱导后获得EPCs,并将其与同样来源于自体骨髓的经成骨诱导的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)及脱钙骨基质(Decalcified Bone Matrix,DBM)共同构建促血管化组织工程骨。建立兔桡骨20%大段骨缺损修复模型,观察组织工程骨的早期血管化程度及骨缺损区新生骨愈合效果。主要实验方法及结果:1.采用密度梯度离心法从兔自体骨髓中得到单个核细胞,在特定的条件下进行分离纯化,通过贴壁培养、体外扩增获取细胞,采用细胞表型检测、免疫组化及免疫双荧光等方法进行鉴定,结果证实通过此方法获得的细胞即是EPCs。2.采用密度梯度离心法将来源于自体骨髓的单个核细胞进行分离纯化、体外传代培养,获得纯度较高、能满足组织工程种子细胞数量要求的BMSCs。通过骨钙素免疫组化、钙结节茜素红染色及四环素荧光染色等方法进行鉴定,证实其在成骨诱导条件下,能向成骨细胞方向分化。将经成骨诱导的BMSCs与EPCs按1:1的比例置于DBM支架上,在体外条件下构建促血管化组织工程骨。3.建立兔桡骨20%大段缺损模型,将体外构建的EPCs促血管化组织工程骨植入骨缺损区。通过墨汁灌注、免疫组化、放射性核素骨显像等方法观察组织工程骨的早期血管化情况,结果显示手术后2周骨缺损区血流量开始升高,4周和8周时达到峰值,12周后开始下降。EPCs组的局部血流量在术后2、4、8周明显高于对照组,提示EPCs能促进组织工程骨的早期血管化。4.观察EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损时骨愈合情况。X线片结果显示,EPCs组术后4周骨痂明显多于对照组,8周可见髓腔部分再通,对照组髓腔尚封闭,12周新生骨密度均匀,髓腔已完全再通,而对照组新生骨仍可见部分低密度区,髓腔大部分再通。16周实验组新生骨已基本完成塑形,对照组髓腔完全再通,新生骨处于重建塑形期。骨密度、组织学光镜、透射电镜、免疫组化等结果显示EPCs组的成骨活跃程度、骨愈合速度均优于对照组。12、16周生物力学测试结果显示EPCs组骨抗扭强度高于对照组。提示EPCs促血管化组织工程骨成骨能力强,能促进骨愈合,是修复大段骨缺损的有效方法。结论1.采用密度梯度离心法收集兔自体骨髓中的单个核细胞,在特定的诱导条件下通过贴壁培养可以获取足够数量的EPCs,在短时间内可在体外扩增,并最终分化为有功能的具有内皮细胞特异性标志物的成熟血管内皮细胞。同时由于EPCs来源于自体骨髓,不存在移植后免疫排斥问题,为临床应用提供了可能。2.采用密度梯度离心法从骨髓中获得的单个核细胞在一定条件下可以在体外大量扩增,获得足量和纯度较高的BMSCs。在成骨诱导条件下,可以向成骨细胞方向分化。因此,BMSCs是骨组织工程理想的种子细胞。DBM因其良好的组织相容性和无细胞毒性而成为骨组织工程较为理想的支架材料之一。将EPCs与经成骨诱导的BMSCs共同置于DBM支架上,可在体外条件下成功构建促血管化组织工程骨。3.来源于自体骨髓的EPCs及经成骨诱导的BMSCs两种细胞与DBM共同构建的促血管化组织工程骨修复兔桡骨20%大段骨缺损,能促进组织工程骨的早期血管化,并进一步促进成骨,加速骨愈合。为临床采用EPCs促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的设想提供了实验基础。
管大凡[10]2016年在《hBMP2/hVEGF165双基因腺病毒转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66修复兔桡骨缺损的实验研究》文中认为背景 骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因具有多向分化潜能而被公认为理想的种子细胞。骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2,BMP2)和血管内皮生长因子165(Vascular endothelia growth factor 165,VEGF165)分别是目前公认的成骨诱导因子和血管再生因子。多孔纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)因其良好的的生物学和力学性能已被广泛应用于临床。本实验将采用hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66体外构建组织工程骨并植入体内观察,旨在为临床上应用组织工程骨治疗骨缺损提供可靠的理论支持和依据。目的 本实验拟通过体外构建hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66组织工程骨并检测其诱导成骨分化能力,继而植入体内以观察评定其在兔桡骨缺损修复模型中的修复能力。方法 1.采用髂骨穿刺抽吸骨髓液,密度梯度离心分离BMSCs,种植于25cm~3培养瓶中,48h后换液,观察BMSCs的大体形态,细胞融合度达80%以上传代培养,取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定。2.取第3代生长良好的BMSCs作为实验对象,计算细胞数,使用不同感染复数感染BMSCs,48h后换液,2d后倒置相差显微镜下观察细胞状态并使用倒置荧光显微镜观察转染情况,找出最佳MOI值,并进行ELISA检测细胞hBMP2和hVEGF165的表达;将感染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,于转染后1w、2w、3w、4w进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性测定并于3w、4w进行茜素红染色观察并电镜扫描观察。3.使用1%的戊巴比妥钠(3.5ml/kg)进行麻醉新西兰大白兔,手术制作桡骨中段15mm长骨缺损,将组织工程骨植入骨缺损部位,逐层缝合伤口。4.在术后2w、4w、8w、12w,进行X线、CT叁维重建观察骨缺损愈合情况,并取出组织工程骨并进行HE、甲苯胺蓝、Masson染色观察成骨及血管形成情况。结果 1.细胞分离培养48h后换液,倒置显微镜下观察,可见少量贴壁细胞,呈多角形或梭形,随时间延长,细胞呈集落生长并增大,形成漩涡状或人字状细胞排列,原代细胞5-7d即可达80%融合度以上,随着传代次数增多细胞呈梭形改变,细胞形态逾趋一致,待3代左右细胞纯度可达95%以上。3代细胞经流式细胞仪检测其细胞表型:CD29(99.82%)和CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)和CD34(0.34%)。2.Ad-BMP2,Ad-VEGF165腺病毒载体由山东大学魏奉才教授馈赠,Ad-BMP2-VEGF165重组腺病毒载体由上海生工构建,病毒滴度达1×10~(10)PFU/ml。分别转染bmscs后,elisa检测hBMP2和hVEGF165蛋白表达水平,BMP2、VEGF165在3-28d均有表达,3-5d时达到高峰,5d后开始降低。倒置相差显微镜下观察生长状态良好,倒置荧光显微镜观察GFP正常表达,转染效率在90%以上。在3w、4w时茜素红染色观察显示各组均已形成钙结节及矿化区,但双基因组优于其他各组,BMP2、VEGF165次之,BMSCs最差。扫描电镜观察钙化结节并可见细胞紧密粘附于支架材料上,4w周时,双基因组可见密集的钙结节形成,其他各组也有不等量钙结节形成。碱性磷酸酶活性检测结果显示双基因组在各个时期均高于其他各组,各组间差异均有统计学意义(p<0.05)。3.手术构建兔桡骨中段长15mm骨缺损模型,尺骨保存完整,各组植入物均稳定植入且术中术后无移位。术后观察切口无感染、红肿等异常情况。4.在术后2w、4w、8w、12w,行X线、CT叁维重建观察显示植入物位置良好,且与周围组织生长紧密,在不同时相点均可清楚观察到骨缺损有程度不同的修复,在12w时可见双基因复合多孔n-HA/PA66组支架材料已被骨皮质完全包裹,取出组织工程骨行HE、甲苯胺蓝、Masson染色观察成骨及血管形成情况。C2组各时相点各观测指标均优于其他组(p<0.05);B1组血管数较B2组为优(p<0.05),同时C1组血管计数明显优于A2组(p<0.05);各组各时相点观察结果均优于A1(p<0.05)。结论1.BMSCs无论在体内还是在体外均具有向成骨细胞分化的潜能,可作为种子细胞应用于构建组织工程骨。2.BMSCs被Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒转染后可以正常的生长,并能够持续高量表达目的蛋白,转染后的BMSCs能在多孔n-HA/PA66网孔上良好的生长、黏附并矿化。3.hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66构建组织工程骨可有效地促进骨缺损修复。
参考文献：
[1]. 兔骨髓间充质干细胞的生物学特性及用于大段骨缺损修复的实验研究[D]. 范海涛. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. 骨髓间充质干细胞成骨分化影响因素分析及体内成骨研究[D]. 王晶. 暨南大学. 2007
[3]. 组织工程化纳米—羟基磷灰石/聚己内酯人工骨支架的制备及其相关性能的研究[D]. 夏琰. 第二军医大学. 2013
[4]. BMP-9基因转染羊骨髓间充质干细胞的实验研究及其修复同种异体羊大段骨缺损的初步研究[D]. 向慧. 重庆医科大学. 2010
[5]. 骨软骨脱细胞基质材料研制及修复功能动物实验研究[D]. 谭洪波. 第叁军医大学. 2010
[6]. 改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究[D]. 简月奎. 第叁军医大学. 2007
[7]. 兔骨髓间充质干细胞片（MSCs）包裹新型rhBMP-2-硫酸钙支架修复兔大段尺骨缺损的实验研究[D]. 王玉路. 浙江大学. 2011
[8]. 组织工程骨膜修复兔桡骨大段骨缺损的早期观察及BMP-2对组织工程骨膜体外成骨能力的影响[D]. 任广铁. 兰州大学. 2014
[9]. 血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复大段骨缺损的实验研究[D]. 吴雪晖. 第叁军医大学. 2007
[10]. hBMP2/hVEGF165双基因腺病毒转染BMSCs复合多孔n-HA/PA66修复兔桡骨缺损的实验研究[D]. 管大凡. 新乡医学院. 2016