钟武[1]2004年在《基于AGEs交联结构逆转血管硬化化合物的设计、合成和生物活性评价》文中研究表明本文以AGEs交联为靶点，进行逆转老年性和糖尿病型血管硬化药物的研究。根据先导化合物ALT-711的作用机理和结构特征，设计新类型的虚拟先导优化组合化合物库，采用MOPAC方法计算活性位点的负净电荷，对化合物库进行虚拟筛选，确定优选化合物；构建虚拟先导发现组合库，采用DiverseSolution的BCUT描述符定义类药性分子的化学空间和活性分子的化学空间，并进行多样性和类药性评价。基于上述设计思想，合成硒唑类化合物2个、硒吩类化合物11个、噻吩类化合物10个和咪唑并硒唑类化合物18个，共计四大类41个化合物。化合物的结构都经IR、1HNMR、MS和元素分析等确证。在合成研究中发现一步法合成2-氨基硒唑的新方法和一步法合成咪唑并硒唑类化合物的新方法，能够缩短反应步骤，提高产率，适合于组合化学大规模平行合成。完成化合物体外裂解AGEs的活性研究，结果表明有20个化合物在0． 1mmol浓度下，17个化合物在0． 01或者0． 001mmol浓度下裂解AGE-BSA-胶原交联结构的能力优于阳性化合物ALT711。体内试验表明化合物ZW1能够显着降低体内RBC-IgG交联的含量；显着降低总外周阻力，提高全身动脉顺应性和改善胶原蛋白对水解酶的敏感性。初步急性毒性试验研究表明优选化合物ZW1，ZW6，ZW7，ZW20， ZW21和ZW22均低于阳性药物ALT711。构效关系分析结果表明咪唑并硒唑类化合物结构中C9，N10和Se14上的电荷密度和裂解能力密切相关，N10位是可能的质子化位点；季胺盐类化合物分子的最低空轨道和次一级空轨道的差值(△L)对化合物的裂解活性有着重要作用；C2的净电荷对活性也至关重要， 2位上负电荷密度越大，化合物的裂解活性越强，提示在C2上引入对其净电荷负值起贡献的基团将会使化合物的裂解活性增强。在基于KBase的软件平台上，构建了季胺盐类目标化合物结构和裂解活性的定量构效关系(QSAR)模型。基于描述符的QSAR方程结果表明化合物的裂解活性和Charg2、 QV、I和JT四种描述符代表的性质密切相关；基于碎片的QSAR方程结果表明四种主要的结构碎片对裂解活性起重要的贡献;建立的模型预测18个己知的化合物的裂解活性，结果与其实验值能够较好吻合。两个QSAR模型的建立为快速预测化合物的活性和对虚拟组合化合物库进行筛选提供可信工具;提供了先导化合物优化的策略。 本文通过设计、合成和生物活性研究，优选出候选化合物ZWI，该化合物具有明显的裂解AGES交联结构能力，对由AGEs交联结构引起的糖尿病大鼠动脉硬化症状具有明显改善作用，毒性较低，可以作为逆转老年性和糖尿病型血管硬化的候选药物进一步研究。
张冰[2]2008年在《AGEs裂解剂对DM大鼠心血管系统保护作用研究》文中研究表明老龄人口的迅速增加以及糖尿病发病率的迅速攀升使老龄及糖尿病并发症的防治成为亟待解决问题。心血管系统功能紊乱是老龄人与糖尿病患者最为突出的并发症,是导致老龄人口死亡、糖尿病患者生存质量下降的最主要原因。因此发展具有针对性的治疗措施具有重要意义。晚期糖基化终产物(Advanced glycation endproducts, AGEs)是由葡萄糖及其它还原糖与蛋白质经过一系列非酶促反应形成的巨型交联物。AGEs交联结构在心血管组织的长命蛋白上的形成与积聚与老年和糖尿病患者心血管系统硬化,心血管组织对生物活性分子与外源性调节分子的敏感性下降密切相关。裂解AGEs交联结构是一种新型的、基于逆转心血管硬化的治疗策略。临床前和临床研究表明,AGEs裂解剂明确改善老年和糖尿病的心血管系统功能紊乱。然而,作为一种发展中的具有完全创新性思路和全新机制的药物,AGEs裂解剂的新作用、作用机制以及新型AGEs裂解药物还有待进一步研究。本研究的目的有两个,其一,对自主研发的新型AGEs裂解剂C36体内水解主要产物C36D2进行逆转糖尿病大鼠心血管系统硬化的作用及机制进行研究,确证C36D2是C36的体内活性形式,为C36体内的有效性提供实验依据。其二,探讨AGEs裂解剂通过改善心血管系统功能是否能够改善降压药物的敏感性以及可能的机制。第一部分工作主要以C36为对照,用经典AGEs裂解剂的评价方法对C36D2进行了实验研究。首先通过体外制备牛血清白蛋白(BSA)-AGEs-胶原的交联结构,结合酶联免疫吸附测定(ELISA)方法以及裂解糖尿病大鼠红细胞表面IgG(RBC-IgG)交联实验,对C36D2进行了体外裂解体内、外形成的AGEs的评价;其后,给予STZ诱导3个月病程的糖尿病大鼠3个剂量(9、18、36 mg/kg)的C36D2 4周,采用超声多普勒结合血流动力学检测技术,对大鼠收缩压、舒张压、心率、左室内压峰值及左室舒张末期压进行了测定,并计算心输出量、总外周阻力、系统顺应性及左室内压最大变化速率;同时,采用荧光检测法测定了主动脉、左心室心肌以及肾脏组织上AGEs含量,采用酸性条件下限制性胃蛋白酶消化实验测定尾胶原、左心室心肌胶原溶解性。结果表明,C36D2能够在体外裂解体内、外形成的AGEs交联结构,在体内显着提高糖尿病大鼠系统顺应性(7.92±1.11 vs. 5.55±0.94 10-3ml/mmHg),降低总外周阻力(77.0±19.6 vs. 109.87±19.0 103.dyne.sec/cm5),增加心输出量(84.9±13.6 vs. 60.3±7.9 ml/min);显着增加糖尿病大鼠左心室内压峰值( 170.65±8.94 vs. 153.49±20.05mmHg )和左室内压最大变化速率(12201.2±1872.2 vs. 9410.2±1294.2mmHg/s)(7762.8±1320.2 vs. 6684.2±1400.7 mmHg/s),降低左室舒张末期压(5.73±1.44 vs. 8.16±3.05mmHg),改善左室功能;并增加糖尿病大鼠尾胶原、左心室心肌胶原溶解性;显着减少糖尿病大鼠主动脉、左心室心肌以及肾脏的AGEs荧光含量。其药效强度均与阳性药ALT-711和C36相当,且作用机制与ALT-711和C36相同。因此,C36D2能够改善糖尿病大鼠心血管功能紊乱,其机制与裂解体内过度形成的AGEs交联结构相关;C36D2是新型AGEs裂解剂C36在体内的主要要的活性形式,也是一个新型的AGEs裂解剂。第二部分工作,首先采用慢性给予STZ诱导糖尿病大鼠1%NaCl饮水的方法,复制和建立了一种新型的糖尿病-高血压大鼠模型;在此模型建立的基础上,预灌胃给予AGEs裂解剂4周,采用乌氯合剂麻醉大鼠,颈总动脉插管监测血压,股静脉插管,从低至高浓度梯度给予硝苯地平,观察AGEs裂解剂对作用在血管平滑肌上的降压药的降压作用的影响。同时,对循环血液及肾组织中与高血压相关的一些生物活性因子的含量及基因表达进行了测定,并采用免疫组织化学的方法对肾脏中ET-1的表达进行了分析;此外,采用离体动脉环试验对AGEs裂解剂对血管及内皮细胞功能的影响进行评价。实验结果表明,给予AGEs裂解剂治疗的糖尿病-高血压大鼠对硝苯地平的降压反应明显强于对照组的糖尿病-高血压大鼠(ALT-711最大升高降压幅度达108%,C36D2达83.74%),并且其血浆NO含量明显升高(8.45±1.85,7.72±1.61 vs. 3.53±1.32μmol/L);主动脉前内皮素原基因的表达和肾脏血管紧张素原的基因表达显着降低,肾脏ET-1蛋白表达显着降低,但血浆中的AngⅡ、ET-1未表现出明显变化。此外,给予AGEs裂解剂的糖尿病大鼠胸主动脉环对ACh诱导的内皮依赖性血管舒张反应明显增强。表明,STZ致糖尿病大鼠慢性饮用1%NaCl可成功诱导出与AGEs相关的糖尿病基础上的高血压大鼠。该模型大鼠血压稳定升高,并伴有缩血管活性物质的ET-1以及肾脏AngⅡ分泌的增加;AGEs裂解剂在糖尿病高血压大鼠模型上,对硝苯地平的降压作用具有增敏效应,其机制主要与改善糖尿病诱导的血管内皮细胞功能紊乱相关。此外,AGEs裂解剂对肾脏局部RAS的影响可能也参与了此作用。综上所述,自主研发的AGEs裂解剂C36及其水解产物C36D2作为治疗糖尿病和老年心血管系统并发症的候选药物具有进一步发展的价值;AGEs裂解剂在治疗糖尿病与老年心血管并发症的联合用药上具有广阔的应用前景。
陈金龙[3]2007年在《二苯乙烯类化合物E2的降糖作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理糖尿病是一种以高血糖为特征的胰岛素缺乏或相对缺乏导致的内分泌代谢疾病，并发的多种慢性合并症是病人致残或致死的主要原因。已有的口服降糖药均不能完全有效的改善糖尿病的病理异常，因此，寻找预防和治疗糖尿病的有效药物已成为世界范围内的一个重大课题。二苯乙烯类化合物E2是我室从大黄根茎中提取纯化的一类结构全新的具有自主知识产权的降糖药物，作用机制不明。为此，我们开展了E2的降糖以及相关并发症的改善作用实验研究，系统的研究其可能的作用机制，同时对糖尿病发病机理进行了探索性研究。目的是评价E2的降糖作用，阐明其降糖作用机制，包括E2对多种糖尿病模型的降糖效果，对靶细胞的生物学效应和分子调控，为开发新型降糖药物提供理论基础；并在国内外首次进行鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPK)在糖代谢调控中的作用研究，探讨其作为调控糖代谢新靶标的可能性，为糖尿病发病机制研究提供实验基础。本文首先采用5种不同类型的糖尿病实验动物模型系统研究了E2对糖尿病及其并发症的治疗效果，研究结果表明：E2能明显降低不同糖尿病动物的血糖血脂水平，显着改善葡萄糖耐量的异常，血清生化指标检测证实E2不能促进胰岛素分泌，病理形态学结果显示E2对胰岛细胞具有保护作用，血液动力学和电镜观察超微结构结果表明E2对受损的心脏、肾脏、肝脏和脾脏的结构具有修复和保护作用；E2能显着增加糖尿病大鼠肝脏和心肌组织的糖原合成；血流动力学结果表明，E2能有效裂解糖基化形成的终产物AGEs从而能显着提高大鼠心输出量，降低总外周阻力，提高全身动脉顺应性；Western Blot结果显示E2能明显提高肝脏胰岛素受体含量，活化肝脏和心肌组织Akt、GSK-3β信号通路。在上述药效学实验的基础上，我们对E2降糖降脂改善并发症的细胞和分子机理进行了较为系统的探索研究。首先对调控糖代谢的靶细胞进行了筛选，发现E2能明显的促进高糖状态下的肝L0-2细胞的葡萄糖消耗，而对肌母C2C12细胞作用不明显，提示E2作用的靶细胞可能是肝细胞。选用βTC3胰岛细胞观察E2是否具有促胰岛分泌作用，结果证实，E2不能促进胰岛细胞分泌胰岛素。其次我们对E2调控糖代谢的分子机理进行了探讨，研究结果表明：E2在体外可以激活Akt、GSK-3β激酶磷酸化，促进肝细胞的葡萄糖调控。同时我们也首次发现胰岛素和E2能明显增强SPK激酶活性，SPK和磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI-3K)同属脂质激酶，而PI-3K激酶是调控糖代谢的一个关键分子，结合脂质激酶在糖代谢中的重要地位，我们大胆推测，SPK很有可能是糖代谢调控的另一个新的关键分子。为此，我们又对鞘氨醇激酶SPK在糖代谢调控中的作用进行了探索性研究，试图阐明SPK是否是除PI-3K外的另一个与糖代谢密切相关的分子。首先用腺病毒介导的SPK1基因转染肝L0-2细胞和C2C12肌母细胞，结果表明，SPK1基因转染可以直接刺激细胞的葡萄糖吸收，也能明显促进胰岛素刺激的细胞对糖的吸收，SPK阻断剂DMS抑制SPK1表达及其酶活性，能够导致细胞摄取葡萄糖的能力减弱，并且也使细胞在胰岛素刺激下的葡萄糖吸收显着地降低。其次用腺病毒介导的SPK1基因转染原发2型糖尿病KK-Ay小鼠，在整体动物水平观察并确定SPK对糖代谢的调控作用，研究结果发现，SPK1能够明显降低2型糖尿病KK-Ay小鼠的血糖；改善胰岛素抵抗，SPK1在肝组织、心肌组织、骨骼肌组织中都有较高的表达，这些结果提示SPK1是参与糖代谢调控的一个关键分子，有望成为糖尿病防治的新靶点。通过以上结果，我们可以得出：(1)E2能明显的降低糖尿病模型的血糖和血脂，显着改善心功能，逆转血管硬化，对肝脏、脾脏和肾脏损伤具有较为明显的保护作用，因此，E2是预防和治疗糖尿病及其相关并发症的一种新的行之有效的药物(2)E2的作用机制是：①不刺激胰岛细胞分泌胰岛素，对胰岛细胞具有保护作用；②增加肝脏胰岛素受体数目；③通过激活Akt、GSK-3β激酶磷酸化促进肝糖原和心肌糖原合成；④促进肝细胞的葡萄糖消耗；⑤通过裂解糖基化终产物AGEs改善血管硬化；⑥活化鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPK)，提高对糖代谢的调控；(3)SPK可能是除PI-3K外的另一个与糖代谢密切相关的脂质激酶。
袁媛[4]2017年在《基于非酶糖基化反应的葛根减轻丙酮醛损伤内皮细胞作用机制研究》文中研究指明研究背景糖尿病是引起血糖升高,造成身体代谢紊乱的一种常见慢性病,它的发病机制可能是由于胰岛素分泌缺陷或是其生物作用受损,又或是二者兼有所引发的[1]。糖尿病的发生发展过程中大都会引起身体其他部位并发症,如神经系统、心脏、肾脏及视网膜等部位的病变,其中糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死的主要原因[2]。近年来国内外大量研究表明,非酶糖基化(non-enzymatic glycosylation)是诱发糖尿病血管病变的主要发病机制之一[3],它由一系列复杂的酶促反应构成,是葡萄糖的羰基和蛋白质、脂质、核酸的氨基反应,形成不稳定的schiff碱等早期糖基化产物,再经分子重新排列、氧化交联,形成不可逆非酶晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,简称 AGEs)[4],AGEs在体内逐步累积,由于不可逆转以及与蛋白质、脂质、核酸等发生交联,从而破坏了它们的结构,促进了机体氧化应激反应,最终影响其生理功能,引发糖尿病血管并发症的发生和发展。研究表明,在糖尿病肾病的发病过程中,AGEs与其受体RAGE结合引发的肾细胞的氧化应激反应致使肾脏的功能和结构发生改变。活性二羰基化合物是形成AGEs的前体,属于高反应活性糖基化因子[5],研究表明多种中药活性成分可通过阻止糖化氧化或者清除活性二羰基化合物等途径抑制AGEs形成[6]。葛根是多年生豆科落叶藤本植物野葛Puerarialobata(Willd)Ohwi的干燥根,中医临床用于活血化瘀,治疗包括高血压,糖尿病、心绞痛、视网膜病变等。葛根含有丰富的化学成分,其主要活性物质葛根素,具有较强的抗氧化性,具有降血糖、改善心脑血管及微血管循环、保护细胞内皮等作用[7][8]。本实验通过C57BL/6小鼠采用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素(40 mg·kg-1)构建糖尿病模型,用荧光光度法测定AGEs的荧光值,考察葛根素体内外抑制AGEs生成的规律,以探讨葛根抑制AGEs这一途径减轻糖尿病损伤内皮细胞引起血管并发症的可能作用和机制。研究目的本实验基于非酶糖基化反应,通过模拟非酶糖基化反应条件,比较检测葛根提取物与丙酮醛反应前后的成分变化,筛选出葛根中可能存在的具有捕捉羰基化合物活性的成分,并探究葛根抑制AGEs生成的作用机制,从而筛选出潜在的抑制AGEs生成的活性成分,为进一步创制预防和治疗糖尿病血管并发症现代创新中药提供科学的依据。研究对象与方法C57BL/6小鼠采用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素(40 mg·kg-1)构建糖尿病模型。造模成功后随机分为模型组、氨基胍组(100mg·kg-1)、葛根素低剂量组(50 mg·kg-1)、葛根素中剂量组(100 mg·kg-1)、葛根素高剂量组(200 mg·kg-1),另设空白对照组。连续给药8周后,检测空腹血糖含量(Fasting blood glucose,FBG)、口服糖耐量(Oral glucose tolerance test,OGTT)、糖化血清蛋白(Glycosylated serum protein,GSP)、血肌酐(Serum creatinine,Scr)及血清AGEs含量。此外将不同浓度的葛根素(0.5、1.0、2.0 μmol·L-1)与丙酮醛(Methylglyoxal,MGO)和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)共孵育144 h,建立体外非酶糖基化反应模型,用荧光光度法测定AGEs的荧光值,考察葛根素体外抑制AGEs生成的规律。研究结果葛根素能够显着降低糖尿病小鼠的空腹血糖含量,改善口服糖耐量,降低糖化血清蛋白,改善肾脏功能和结构的改变,抑制血清AGEs的生成。此外,葛根素在体外非酶糖基化反应体系中抑制AGEs的生成,并有一定的剂量依赖性。研究结论葛根素具有显着的治疗糖尿病血管并发症效果,抑制AGEs生成是其发挥药效的潜在作用机制。
张风雷[5]2007年在《葡萄籽原花青素抑制AGEs诱导的内皮细胞黏附分子及RAGE表达的实验研究》文中研究说明第一部分葡萄籽原花青素选择性抑制AGEs诱导的内皮细胞黏附分子表达背景随着社会发展及人口老龄化，糖尿病发生率逐年增加，而其血管并发症已成为糖尿病病人致死或致残的主要原因。近年来研究显示尽管强化降糖治疗能改善部分糖尿病微血管并发症的预后，但对糖尿病动脉粥样硬化等大血管并发症影响不大，而且血糖严格控制往往容易导致严重的低血糖反应，病人难以耐受。进一步的研究揭示，此“高血糖记忆现象”与糖尿病病人体内积聚的糖基化终产物(Advanced glycation end products，AGEs)有关。一方面AGEs直接作用于血管壁，发生交联反应，造成血管壁增厚、弹性下降及顺应性减退，也能作用于脂质，导致LDL易于氧化及血管壁沉积，HDL糖基化使其胆固醇逆转运功能降低。然而，AGEs最主要的致病机制是通过与其受体RAGE相互作用介导的，抗RAGE抗体或可溶性RAGE(sRAGE)阻断AGEs与RAGE相互作用能逆转血管高通透性，抑制血管病变的早期发展及动脉粥样硬化病变的进展，抑制血管损伤后的内膜过度增生，改善神经传导，减轻肾肿大、肾小球硬化及蛋白尿等。随着研究的深入，除了严格控制血糖外，以AGEs-RAGE系统为靶点的药物治疗将成为糖尿病血管并发症防治的重点之一。目的大量证据证实AGEs与其受体RAGE相互作用在糖尿病血管并发症的发生和发展中起了至关重要的作用，AGEs与RAGE结合能诱导细胞内氧化应激，活性氧簇(ROS)产生增加，增加的ROS反过来激活一系列复杂的信号传导途径及随后的转录因子NF-κB等，后者进一步促进多种基因的表达，其中大多数是与炎症、免疫和动脉粥样硬化相关的，如黏附分子、趋化蛋白、生长因子、组织因子等。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)是从葡萄籽中提取的多酚类化合物，拥有很强的抗氧化活性。本研究以体外培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)为研究对象，观察GSPE是否能通过抗氧化机制抑制AGEs诱导的内皮细胞黏附分子表达。方法牛血清白蛋白(BSA)与高浓度的葡萄糖在37℃下孵育12周以制备糖基化终产物AGE-BSA。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪评价细胞内ROS产生，流式细胞仪测定细胞表面VCAM-1及ICAM-1蛋白表达，RT-PCR检测细胞内VCAM-1及ICAM-1 mRNA水平。首先用200μg／ml AGE-BSA与内皮细胞孵育不同时间，观察AGEs对内皮细胞ROS产生及VCAM-1、ICAM-1蛋白及基因表达的时间刺激强度。接下来，先用不同浓度(5、15、25μg／ml)GSPE预处理内皮细胞4h，然后加用200μg／ml AGE-BSA刺激内皮细胞不同时间，观察GSPE是否能抑制细胞内ROS产生，进而抑制VCAM-1及ICAM-1蛋白及基因的表达。结果1．200μg／ml AGE-BSA与内皮细胞孵育3h时VCAM-1及ICAM-1蛋白表达开始增强，12h时达到高峰，24h表达降低，但仍未到达基础水平。对照组未处理的内皮细胞VCAM-1及ICAM-1蛋白表达很低，未糖基化修饰的BSA与25μg／mlGSPE均没有影响VCAM-1及ICAM-1蛋白表达。而不同浓度(5、15及25μg／ml)GSPE与内皮细胞预孵育4h显着抑制200μg／ml AGE-BSA刺激的VCAM-1蛋白表达，并呈剂量依赖性，但却没有影响增高的ICAM-1蛋白水平。在不同剂量组，VCAM-1蛋白表达分别降低到79.90％±8.49％(5μg／ml GSPE组)、52.09％±5.19％(15μg／ml GSPE组)、20.53％±5.21％(25μg／ml GSPE组)(与AGE-BSA诱导组相比，P＜0.01)。2．AGE-BSA处理内皮细胞2h时VCAM-1及ICAM-1 mRNA水平均开始增加，6h时达到高峰，12h时有所下降，但未接近基础水平。不同剂量(5、15及25μg／ml)GSPE与内皮细胞预孵育4h，再用200μg／ml AGE-BSA刺激6h，与VCAM-1及ICAM-1表面蛋白表达相一致，GSPE显着降低了VCAM-1 mRNA水平，并呈剂量依赖性，而增强的ICAM-1 mRNA水平却没有改变。不同剂量的GSPE分别将VCAM-1 mRNA水平从0.388±0.035(AGE-BSA诱导组)降低到0.275±0.015(5μg／ml GSPE组)、0.146±0.031(15μg／ml GSPE组)、0.077±0.009(25μg／ml GSPE组)(与AGE-BSA诱导组相比，P＜0.01)。3．激光共聚焦显微镜检测结果显示，AGE-BSA与内皮细胞孵育0min时细胞内荧光强度较弱，ROS产生较低，15min时ROS产生增加，30min时达到高峰，以后逐渐下降，60min时接近基础水平。5、15、25μg／ml的GSPE与HUVEC预孵育4h明显抑制了200μg／ml AGE-BSA诱导的ROS产生，抑制作用随GSPE剂量的增加而增强(AGE-BSA诱导组：3.12±0.31、5μg／ml GSPE组：2.36±0.34、15μg／ml GSPE组：1.95±0.41、25μg／ml GSPE组：1.14±0.23，与AGE-BSA诱导组相比，P＜0.01)。流式细胞仪测定细胞内ROS也得出相似的结果。结论1．体外制备的AGE-BSA与内皮细胞孵育能诱导细胞内氧化应激，ROS产生增加，进而促进内皮细胞VCAM-1及ICAM-1蛋白与mRNA表达。2．不同剂量的GSPE预处理内皮细胞选择性抑制了AGE-BSA诱导的VCAM-1蛋白及mRNA表达，并呈剂量依赖性，但没有影响ICAM-1水平。3．通过其抗氧化特性，GSPE以剂量依赖的方式抑制了细胞内ROS产生，这可能涉及GSPE对AGEs诱导的黏附分子表达的选择性抑制作用。4．GSPE能选择性抑制AGEs诱导的内皮细胞VCAM-1的表达，因此，GSPE有助于防止糖尿病早期血管病变的发生，这将为GSPE在糖尿病病人中的应用提供理论依据。第二部分葡萄籽原花青素对AGEs诱导的内皮细胞RAGE基因表达的影响背景研究证实RAGE是一信号传导受体，属于免疫球蛋白超家族成员，是介导AGEs致糖尿病血管病变的主要结合蛋白。RAGE与AGEs结合能诱导细胞内氧化应激，激活下游信号传导，促进炎症反应等。多种细胞如内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞及淋巴细胞等均能表达RAGE，正常情况下表达量很低，但在某些病理条件下表达增加并能持续数年，且AGEs与RAGE表达之间存在正反馈调节机制，在血管系统AGEs增多的病变部位往往伴随着RAGE表达的增加，这种正反馈调节被认为能促进并延长RAGE与配体的致病作用。另外，内皮细胞表面RAGE还可作为黏附受体与白细胞β2整合素作用，直接参与血管壁炎症细胞的募集。因此，限制RAGE表达将有助于抑制AGEs-RAGE系统的致病作用，并能阻断其恶性循环。目的葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中提取的天然抗氧化物质。本研究以体外培养的人脐静脉内皮细胞为研究对象，观察GSPE是否能抑制AGEs诱导的内皮细胞RAGE基因表达。方法激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS的改变，RT-PCR测定RAGE mRNA水平。首先用200μg／ml AGE-BSA与内皮细胞孵育不同时间，观察AGEs对内皮细胞RAGE基因表达的刺激作用，然后用不同浓度(5、15及25μg／ml)GSPE与内皮细胞预孵育4h，再用200μg／ml AGE-BSA刺激内皮细胞，观察GSPE是否抑制AGEs诱导的内皮细胞RAGE基因表达。结果1．200μg／ml AGE-BSA与内皮细胞孵育2h时RAGE mRNA的表达有增加趋势，4h时表达明显增强，6h时达到峰值，以后RAGE mRNA表达逐渐降低，但12h时未接近正常水平。BSA及GSPE单独没有影响细胞内RAGE mRNA的水平。不同剂量GSPE与内皮细胞预孵育4h能以剂量依赖的方式抑制AGE-BSA诱导的内皮细胞RAGE mRNA表达，5、15、25μg／ml GSPE降低细胞内RAGEmRNA水平分别从1.12±0.15(AGE-BSA诱导组)到0.75±0.11、0.48±0.08、0.27±0.10(与AGE-BSA诱导组相比，P＜0.01)。2．激光共聚焦显微镜测定结果显示，与正常对照组相比较，BSA及GSPE单独没有增强细胞内ROS产生，同样的，GSPE与内皮细胞预孵育4h以剂量依赖的方式抑制了细胞内ROS的产生。细胞内ROS水平分别从3.02±0.29(AGE-BSA诱导组)降低到2.49±0.42(5μg／ml GSPE组)、1.95±0.24(15μg／mlGSPE组)、1.26±0.41(25μg／ml GSPE组)(与AGE-BSA诱导组相比，P＜0.01)。另外，流式细胞仪测定细胞内ROS也得出相一致的结果。结论1．体外制备的AGE-BSA能诱导细胞内氧化应激，ROS产生增加，并能导致RAGE mRNA表达增强，未修饰的BSA和GSPE单独没有影响细胞内ROS及RAGE mRNA水平。2．不同剂量GSPE与内皮细胞预孵育明显抑制AGE-BSA刺激的内皮细胞RAGE mRNA表达，并呈剂量依赖性，这有助于阻止AGEs-RAGE相互作用，阻断其致病过程的恶性循环，进一步为GSPE防治糖尿病血管并发症提供理论依据。3．GSPE同样以剂量依赖的方式抑制AGEs诱导的细胞内ROS产生，因此，GSPE对ROS的抑制可能也涉及其对RAGE mRNA的影响作用。4．GSPE对AGEs诱导的内皮细胞黏附分子的选择性抑制作用可能也与其降低RAGE表达有关。
王碧蕾[6]2006年在《单克隆抗体技术检测血清与组织糖基化终产物的初步应用》文中认为研究目的:为探讨糖基化终产物(AGEs)在糖尿病慢性并发症发生发展过程中的作用,本研究对已获得的5株抗AGEs单克隆抗体进行特异性及抗原表位的鉴定,并进一步制备出叁株抗AGEs单克隆抗体,用所得单抗对糖尿病大鼠主动脉进行AGEs的western blot分析,并对糖尿病大鼠肾脏、心脏进行AGEs的免疫组化分析;为建立检测血清中AGEs浓度的微量测定技术奠定基础,为糖尿病慢性并发症的诊断、治疗及预后评估提供依据,用所得单抗通过western blot对正常对照、糖尿病及透析病人血清中的AGEs进行探查。研究方法:间接酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选培养上清,包被的抗原为纯化后的第一峰AGEs-HSA,选择对AGEs阳性,对HSA阴性的多克隆孔进行亚克隆,间接ELISA筛选亚克隆板孔的细胞培养上清。收集阳性单克隆细胞株,注射Babl/c小鼠制备腹水,经固相化甘露聚糖结合蛋白(MBP)柱纯化腹水。进行亚型鉴定,并通过间接ELISA、western blot对抗体行特异性鉴定并初步鉴别其所针对的抗原表位。应用所得抗AGEs单克隆抗体对正常对照组、糖尿病组及透析组人血清和糖尿病大鼠主动脉进行AGEs的western blot分析,并对糖尿病大鼠进行肾脏、心脏AGEs的免疫组化研究。结果:1将冻存杂交瘤细胞复苏后,经筛选、亚克隆,得到3株阳性单克隆细胞株。扩增3株细胞株,取细胞培养上清行亚型鉴定为IgM型;2对已获得的5株及新制备的3株抗AGEs单克隆抗体细胞株进行扩增,注射小鼠腹腔产生腹水,经固相化甘露聚糖结合蛋白(MBP)柱纯化,抗体特异性鉴定示与AGEs-HSA特异性结合,而与对照物(人血清白蛋白、孵育人血清白蛋白、牛血清白蛋白)结合较低;3初步鉴别其抗原表位非羧甲基赖氨酸(non- carboxymethyl lysine);单抗相加实验证实各单抗间相加指数AI<50%;4在正常对照、糖尿病及透析组人血清中检测到葡萄糖源性AGEs;5用所得单抗行western blot,显示糖尿病高血压大鼠主动脉含AGEs特异显色,而正常对照组不明显;6应用抗AGEs单克隆抗体对糖尿病大鼠肾脏、心脏的免疫组化研究显示,在糖尿病大鼠肾小球系膜基质扩展区、结节性损伤区和心肌细胞内可见明显AGEs沉积,而正常对照组未见或仅见少量AGEs。结论:8株抗AGEs单克隆抗体细胞株具有较高的抗原特异性,可定性显示血清和组织中的AGEs。
张再超[7]2009年在《高糖及糖基化终末产物减少皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的机制初探》文中提出糖尿病是以高血糖为特征的慢性代谢性疾病,近几年来其发病率一直呈上升和低龄化趋势,研究表明糖尿病易引起心、血管、眼、神经肌肉、肾脏、皮肤等并发症的发生,严重危害人体健康,糖尿病并发症是导致糖尿病患者致残和致死的主要原因。临床上常见糖尿病患者皮肤菲薄、易破损及创面难愈导致远端肢体溃疡,而且糖尿病皮肤并发症最常见的表现为皮肤干燥、瘙痒,严重影响患者的生活质量,具体产生的作用机制目前还不清楚。我们前期研究发现糖尿病小鼠皮肤变薄,皮肤胶原蛋白含量减少,真皮层胶原纤维结构疏松、紊乱。为什么糖尿病会引起皮肤胶原蛋白含量减少?具体作用机制是什么?本文旨在从细胞分子水平探讨不同浓度高糖和糖基化终产物对皮肤成纤维细胞的影响,研究皮肤胶原蛋白合成减少的原因并初步探讨其作用机制,为今后临床上防治糖尿病皮肤并发症的发生和药物研发提供实验数据和理论依据。一、高糖对大鼠皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响目的:研究不同浓度葡萄糖对体外培养的大鼠皮肤成纤维细胞的损伤作用,以及对胶原蛋白合成的影响,探讨糖尿病皮肤变薄的机理。方法:取新生乳鼠皮肤进行真皮成纤维细胞的原代和传代培养。实验分四组:正常对照组(25mmol/L)、高糖1组(30mmol/L)、高糖2组(35mmol/L)、高糖3组(40mmol/L),分别培养24h、36h,倒置相差显微镜观察细胞形态结构;MTT法测定细胞存活率;生化法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量;用试剂盒法(消化法)检测细胞培养液中羟脯氨酸含量的变化;用RT-PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达以及基质金属蛋白酶(MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制酶(TIMP-2)mRNA水平的表达情况。结果:高糖(30、35、40mmol/L)对体外培养的皮肤成纤维细胞增殖具有明显的抑制作用。高浓度葡萄糖对大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤比较明显,细胞中SOD和GSH含量显着低于对照组,而MDA含量明显高于对照组(P＜0.05和P＜0.001)。细胞培养液中羟脯氨酸的含量与对照组比较差异显着(P＜0.001),并随葡萄糖浓度的增高羟脯氨酸含量降低越明显。RT-PCR结果显示,高糖培养的皮肤成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白的表达水平明显下调,MMP-2 mRNA水平明显上升,TIMP-2则明显下降,与对照组比较差异显着(p＜0.05)。结论:高浓度葡萄糖对大鼠皮肤成纤维细胞具有明显的氧化损伤作用,并能减少胶原蛋白分泌,其作用机制是通过下调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和TIMP-2 mRNA的表达或上调MMP-2 mRNA的表达从而降低胶原蛋白的合成。二、糖基化终末产物对大鼠皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的影响目的:研究不同浓度AGEs对大鼠皮肤成纤维细胞的损伤,以及对胶原蛋白合成的影响,初步探讨不同浓度AGEs与糖尿病皮肤病变之间的关系。方法:将100mmol/L葡萄糖与50g/L牛血清白蛋白(BSA)在37℃条件下孵育3个月后制备糖基化终产物。以体外培养的皮肤成纤维细胞为实验对象加入AGEs作为损伤剂,分别培养24h、36h。实验分为4组:正常对照组(0mg/mL);AGEs 1组(0.5mg/mL);AGEs 2组(1mg/mL);AGEs 3组(2mg/mL);用MTT法测定细胞存活率;生化法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。试剂盒法(消化法)检测细胞培养液中羟脯氨酸分泌情况;RT-PCR法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达以及MMP-2和TIMP-2 mRNA表达情况。结果:AGEs以剂量依赖方式抑制成纤维细胞的增殖(P＜0.001)。AGEs 1组、AGEs 2组以及AGEs 3组细胞内MDA含量显着高于正常对照组(P＜0.05和P＜0.001),但SOD和GSH含量却明显下降(P＜0.05和P＜0.001)。细胞培养液中羟脯氨酸含量明显降低,并且作用时间越长,抑制作用越明显(P＜0.05和P＜0.001)。RT-PCR结果显示,AGEs可下调皮肤成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白的表达水平,MMP-2mRNA水平较对照组明显上升,TIMP-2则明显下降,与对照组比较差异显着(p＜0.05,P＜0.001)。结论:AGEs呈浓度依赖性地抑制皮肤成纤维细胞增殖,糖尿病状态下AGEs蓄积是导致大鼠皮肤成纤维细胞功能异常的重要原因,可能也是导致糖尿病患者皮肤病变的重要原因和皮肤胶原蛋白减少以及胶原蛋白紊乱的重要原因之一。综合上述实验结果可得出如下结论:(一)高糖和AGEs对皮肤成纤维细胞有明显损伤作用,能影响细胞增殖,并呈明显的剂量关系,其可能是通过氧化应激(OS)途径、晚期糖基化终末产物(AGEs)途径等来影响成纤维细胞的正常生理功能的,而且AGEs比高浓度葡萄糖对成纤维细胞的损伤作用更明显。(二)高糖和AGEs均能影响皮肤成纤维细胞胶原蛋白的合成,机制可能是通过直接抑制成纤维细胞中Ⅰ型、Ⅲ型前胶原蛋白和TIMP-2 mRNA水平的表达和提高MMP-2 mRNA的表达,从而抑制皮肤成纤维细胞胶原蛋白的分泌,这可能是糖尿病皮肤变薄、皮肤胶原纤维紊乱的主要原因之一,也可能是导致糖尿病皮肤病变发生重要因素之一。
张玉凤[8]2016年在《SIRT1和HMGB1在AEGs诱导的视网膜色素上皮细胞炎症反应中的作用研究》文中指出糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管病,也是成人常见的致盲眼病。糖尿病的发生发展从视网膜微血管病变,微血管渗漏,出现视网膜缺血缺氧,造成大量无灌注区形成,最后形成视网膜新生血管的增值性病变,导致视力严重下降。DR的发病机制复杂,包括多元醇通路流量增加、蛋白激酶C激活、己糖胺途径流量增多等途径,以及晚期糖基化终末产物增加,晚期糖基化终产物(AGEs) AGEs积聚在糖尿病视网膜血管细胞、神经元和神经胶质细胞导致DR的发病。第一部分AGEs干预后的ARPE-19细胞中HMBG1和SIRT1的表达目的：通过检测AGEs干预下的ARPE-19细胞中HMGB1、SIRT1的表达,探讨其在DR发病机制中的作用方法：AGEs与ARPE-19细胞共同孵育4,8,12小时后PCR检测细胞中TNF-α,IL-1,IL-6、MCP-1、RANTES和IP-10以及HMGB1、SIRT1mRNA的水平,24h后western blot分析HMGB1、SIRT1蛋白水平。结果：与对照组相比实验组炎性细胞因子白细胞介素1、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子mRNA表达上调,两组间比较差异有统计学意义,并且随着AGE剂量的增加,两组间差异更加显着；与对照组相比实验组HMGB1mRNA及蛋白表达上调,两组间HBMG1mRNA表达差异有统计学意义；与对照组相比实验组SIRT1mRNA、蛋白水平及活性下调,两组间表达差异有统计学意义。结论：结果表明,应用AGEs作用后促进了TNF-α, IL-1, IL-6、MCP-1、RANTES和IP-lOmRNA表达,呈剂量依赖。AEGs治疗也显着促进HMGB1在mRNA和蛋白水平的表达,呈剂量依赖性,同时降低了SIRT1的活性和蛋白表达。第二部分HMGB1基因下调对AGEs诱导的炎性细胞因子和趋化因子的影响目的：构建慢病介导的短发夹RNA下调HMGB1的表达,观察其对AGEs介导的TNF-α,IL-1,IL-6、MCP-1、RANTES和IP-10的影响方法：设计并合成可抑制HMGB1表达的sh RNA,转染进入不同条件下的ARPE-19细胞。利用RT-real-time PCR方法检测TNF-α, IL-1, IL-6、MCP-1、RANTES和IP-lOmRNA的表达情况。结果：与空白对照组比较,外源性HMGB1能显着提高IL-1β mRNA的表达。外源性HMGB1组,敲除HMGB1对IL-Iβ表达无统计学差异。在AGEs组,敲除HMGB1能显着降低IL-1 β mRNA的表达。对白细胞介素6、肿瘤坏死因子及趋化因子的检测也得出相同结果。结论：下调HMGB1的表达能介导AGE诱导的炎性细抑制胞和趋化因子的表达第叁部分SIRT1激活剂与抑制剂对HMGB1的影响目的：了解在AGE诱导的ARPE-19中炎性反应中SIRT1和HMGB1的关联。方法：通过SIRT1的激活剂和抑制剂来调节SIRT1的活性。分别用RSA(即白藜芦醇,SIRT1激活剂)和Sirtinol(SIRT1抑制剂)作用AGE干预的ARPE-19细胞,然后做PCR/Western blot分析。结果：RSA和Sirtinol对AGE作用的ARPE-19细胞SIRT1、HMGB1mRNA水平表达无影响。sirtinol激活了AGE诱导IL-1和IL-6mRNA的表达,而RSV则抑制了二者的表达。Sirtinol增加了胞浆HMGB1,但抑制了细胞核HMGB1的蛋白水平,RSV则是抑制了细胞质HMGB1蛋白水平,增加了细胞核HMGB1蛋白水平。结论：SIRT1可能通过抑制HMGB1从胞浆到细胞核的迁移和释放,调节AGE诱导的致炎细胞因子和趋化因子。
夏欣[9]2004年在《糖化终末产物受体参与糖尿病视网膜病变机制及其干预研究》文中指出持续的高血糖是引起糖尿病并发症的一个重要因素，在高血糖环境中，还原性糖如葡萄糖与循环蛋白或结构蛋白通过共价交联，发生非酶糖化作用形成糖化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)。这些共价化合物与组织血液中多种细胞成份密切相关，其在各种组织蛋白上的过度沉积可引起老龄化和糖尿病的多种并发症。 糖化终术产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)是近年来被明确称为细胞表面分子免疫球蛋白超家族新成员的AGEs的特异性受体，可在多种细胞表面表达。但是关于视网膜微血管内皮细胞和周细胞RAGE的表达尚在研究阶段，深入研究RAGE的特性和寻找有效阻断该受体的方法，有助于系统地探索糖化终末产物参与糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)的病理机制。 本实验室在前期工作中通过免疫组化观察到糖尿病大鼠视网膜血管上AGEs的沉积，而且体外孵育的AGE-BSA和AGE-RSA能够诱导正常大鼠发生类糖尿病视网膜血管病变的发生。本研究应用选择性培养基进行牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞的原代培养，观察微血管细胞上RAGE的表达以及针对RAGE序列的反义寡核苷酸的干预作用；并同时观察了随糖尿病病程的延长，体内RAGEmRNA表达的变化以及氨基胍是否具有干预作用。 第一部分 糖化终末产物受体参与糖尿病视网膜病变机制的研究 首先应用PCR方法，分别观察2wk，4wk和8wk糖尿病大鼠以及氨基胍干预8wk后视网膜RAGEmRNA的表达。本实验发现随着糖尿病病程的延长，4wk组糖尿病大鼠视网膜上RAGEmRNA的表达(relative IOD=0.3350+0.0696)较2wk组(relative IOD=0.2134+0.0554)明显升高(P＜0.01)，但其增加不是无限制的，8wk组视网膜上RAGEmRNA的表达(relative IOD=0.2956+0.0255)未见增加，与4wk组比较无统计学意义(P＞0.05)。无论微血管组织或细胞表面的受体，都可能达到一定的饱和，所以在8wk病程糖尿病大鼠组，RAGEmRNA的表达与4wk组比较未见明显的升高。正常对照组在整个实验过程中，其RAGEmRNA均未见明显改变，但可见弱表达，说明正常组织中也存在RAGEmRNA的表达，持续的高血糖可能促进RAGEmRNA表达水平的上调，从而加强AGE~RAGE的相互作用，促进DR的发展。本研究观察了swk病程组糖尿病大鼠给予氨基肌治疗后，RAGEmRNA的表达(relative IOD=0.1237士0.0225)较未予以氨基肌治疗组明显下降(:elative IOD=0.2956士0.0255)(P<0.01)，与正常对照组(relative IOD=0.1460士0.0282)和氨基肌治疗对照组(relative IOD=0.1055士0.0218)比较无明显差异(P>0.05)，推测氨基肌可能直接或间接调节细胞AGES受体基因的表达，从而减少AGE-RAGE相互作用可能导致的组织病理改变，提示氨基肌和其他AGES抑制剂在防治糖尿病慢性并发症中的重要意义。 其次本实验应用牛视网膜微血管进行消化分离，采用含10%人血清、100协g/ml肝素(Heparin)的nulbeeeo改良的Eagle培养基(Dulbeeeo，5 ModifiedEagle’s Medinm，DMEM)和含20%胎牛血清的DMEM培养基分别选择性培养内皮细胞(Bovine Retinal Endothelial Cells，BREC)和周细胞(Bovine RetinalPericytes，BRP)。通过荧光显微镜观察乙酞化低密度脂蛋白Dll一Ac一LDL吞噬情况和应用Von Willebrand因子抗体免疫组织化学鉴定内皮细胞;以及a一平滑肌肌动蛋白抗体免疫组织化学鉴定周细胞。选择性培养基的应用使得内皮细胞和周细胞的纯度达到98%以上，并能连续传代。BREC早期似小鲤鱼状聚集在微血管碎片周围，呈片状鹅卵石样单层生长，存在接触性抑制;周细胞多散布在距血管碎片稍远处，形状不规则，呈无接触性抑制的生长。BREC可吞噬Dil一Ac一LDL，细胞浆内有荧光表达;消化传代后BREC中Von Wlllebrand因子表达阳性，而a-平滑肌肌动蛋白表达阴性;BRP的a一平滑肌肌动蛋白表达阳性，而Von Wilfebrand因子表达阴性。本实验通过选择性培养基的应用和培养皿的处理，可分别获得较高纯度的内皮细胞和周细胞，简单并具有良好的重复性，无需额外的步骤来去除内皮细胞中混杂的周细胞。 本实验取第二代细胞应用多克隆抗R了、GE抗体，检测到BREC和BRP有糖化终末产物受体的表达，内皮细胞和周细胞均为浆表达，核无染色。原代培养的BREC和BRP在传代至第二代时提取BREC和BRP的总RNA，经Rl飞PCR扩增出386bp的条带。确定了正常生物体内存在RAGE的固有基因，为进一步选择性阻断糖化终末产物的致病途径提供有力的证据。 同时，本实验取终浓度somg/ml BsA，soommol/LD一Glucose，于37oC孵箱内避光孵育12wk，制备外源性AGEs，经sePhaeryls一300层析纯化，SDS一队GE蛋白电泳鉴定AGE一BSA和CO~assie法测定蛋白浓度。观察体外孵育的AGE一BSA对BREC和BRP的毒性作用。发现随着AGEs剂量的增加，细胞被抑制呈上升趋势，说明AGEs对B既c和BRP的抑制与浓度呈正相关。500林留mlAGE一BSA抑制内皮细胞为空白对照组的72.8月5.9%，抑制周细胞为空白对照组的64.8士9%。本实验还发现低浓度AGES对内皮细胞有一定促增生作用，但与空白对照组比较无统计学意义。应用相差倒置显微镜观察500卜g/ml AGE一BSA和BSA
杨芳[10]2007年在《中药提取物对体外蛋白非酶糖化抑制作用的研究》文中认为非酶糖化(nonenzymatic glycosylation，NEG)在糖尿病慢性并发症发病机制中的作用已经越来越引起人们的重视，对于NEG和非酶糖化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)抑制药物的研究也日益深入，也取得了一定的成就，一些对NEG具有抑制作用的化合物也相继出现。近年来，一些学者对中药(Traditional Chinese Medicine，TCM)抑制NEG的作用也进行了一些研究，但大多停留在对方剂的疗效总结和粗提物的筛选方面，深入的研究则较少。本实验通过建立体外蛋白质非酶糖化筛选模型，从20味中药中筛选对体外AGE生成具有抑制作用的中药，然后再从筛选出的有效药物中选取黄芪进行分段，将各段产物在同一筛选模型中进行检测，从而寻找其中的有效组分。首先我们进行20味药物的筛选：将各浓度中药提取物加入含500mmol／l葡萄糖与50 mg／ml牛血清白蛋白的非酶糖化反应液中，37℃条件下避光孵育1个月。测定产物的荧光度值，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)显色反应强度，并用自制抗体对其进行酶联免疫检测(ELISA)。然后我们从筛选出有效的几味药物中，选择黄芪进行组分有效性检测：制备黄芪水提物，采用大孔吸附树脂分离法，用不同浓度的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱液同上孵育1个月，测定产物的荧光度值，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)显色反应强度，ELISA检测。最后通过体外筛选模型的筛选：8号、9号、10号、13号、14号药物对体外蛋白非酶糖化具有很好的抑制作用。在同一筛选模型中，对有效药物中的黄芪经大孔吸附树脂分离的5个组分的检测结果表明，其中的30％、50％、70％乙醇洗脱部分对体外非酶糖化有显着抑制作用。本研究结果显示：8号、9号、10号、13号、14号中药对非酶糖化所引起的糖尿病并发症可能有一定的治疗作用。黄芪的30％、50％、70％乙醇洗脱部分可能是非酶糖化抑制的有效组分，可用于治疗非酶糖化所引起的糖尿病并发症的进一步研究。
参考文献：
[1]. 基于AGEs交联结构逆转血管硬化化合物的设计、合成和生物活性评价[D]. 钟武. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. AGEs裂解剂对DM大鼠心血管系统保护作用研究[D]. 张冰. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[3]. 二苯乙烯类化合物E2的降糖作用及其机制研究[D]. 陈金龙. 中国人民解放军军事医学科学院. 2007
[4]. 基于非酶糖基化反应的葛根减轻丙酮醛损伤内皮细胞作用机制研究[D]. 袁媛. 南京医科大学. 2017
[5]. 葡萄籽原花青素抑制AGEs诱导的内皮细胞黏附分子及RAGE表达的实验研究[D]. 张风雷. 山东大学. 2007
[6]. 单克隆抗体技术检测血清与组织糖基化终产物的初步应用[D]. 王碧蕾. 东南大学. 2006
[7]. 高糖及糖基化终末产物减少皮肤成纤维细胞胶原蛋白合成的机制初探[D]. 张再超. 华东师范大学. 2009
[8]. SIRT1和HMGB1在AEGs诱导的视网膜色素上皮细胞炎症反应中的作用研究[D]. 张玉凤. 武汉大学. 2016
[9]. 糖化终末产物受体参与糖尿病视网膜病变机制及其干预研究[D]. 夏欣. 复旦大学. 2004
[10]. 中药提取物对体外蛋白非酶糖化抑制作用的研究[D]. 杨芳. 四川大学. 2007
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