新型遗传标记DIP-STR多重复合扩增体系的构建论文

新型遗传标记DIP-STR多重复合扩增体系的构建

郑文彦¹，王致远²，罗高司²，符晶²，梁桑华²，黄源坚¹，钱水^2*

（1.广东华美众源生物科技有限公司，广东佛山528000；2.佛山市公安司法鉴定中心，广东佛山528000）

摘要：目的建立一种同时检测人常染色体插入缺失多态性（Deletion/Insertion Polymorphisms，DIP）位点和短串联重复序列多态性（Short Tandem Repeat，STR）基因座的多重荧光标记复合扩增体系，为不均衡混合样本DNA检测提供有效的辅助方法。方法在多色荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术的基础上，利用DIP和STR两种遗传标记串联组合成新型遗传标记DIP-STR，构建荧光标记复合扩增体系同步检测分析样本的8个DIP-STR基因座。结果建立了一种同时检测8个DIP-STR基因座分型的检测方法。结论本研究通过设计针对DIP位点插入或缺失的特异性引物，在现有法医物证常规检验设备和方法的基础上，可对现场物证中不均衡混合样本进行分型，为现场案件混合DNA检测提供有效辅助方法。

关键词：插入-缺失多态性位点；短串联重复序列；DIP-STR；不均衡混合样本；检测方法

在法医物证学领域，微量DNA及混合DNA的检测一直是现场案件检测的重点与难点。随着DNA检测技术的发展，许多微量接触类生物检材通过STR、SNP等遗传标记可以获得稳定可靠的DNA分型^［1］。但是对于主次成分差异比较大的混合样本，常规法医DNA检测方法只能提供非常有限的分型结果^［2-3］。

为了克服这一难题，Castella V等 ^［4］在2011年率先提出了一种由插入-缺失多态性（Deletion/Insertion Polymorphisms，DIP）和短串联重复序列多态性（Short Tandem Repeat,STR）两种遗传标记串联组合在一起形成的新型复合遗传标记DIP-STR。该遗传标记是STR序列上/下游500 bp范围内存在DIP位点，根据DIP位点的插入或缺失状态分别设计特异性引物，利用DIP双等位基因特异分型的优势，结合STR的多态性优势，能够在极不平衡的双源DNA混合物中检测出次要成分，同时保留了由连锁的多等位基因提供的强大识别能力^［5］。

目前，国外已有利用DIP-STR标记检测不均衡样本的体系建立及案件应用的报道。Castella V等^［4］建立了由7个DIP-STR位点组成的复合扩增体系。此后该团队陆续报道了经过改良的DIP-STR复合扩增体系及该体系在8宗案件上的应用^［6-7］，显示出DIP-STR遗传标记能够补充样本的分型结果或为调查提供新线索的作用。而国内针对DIP-STR遗传标记的研究起步晚、成果少，其中Tan Y等 ^［8］在2017年选取了6个DIP-STR基因座对西南汉族人群的不平衡样本进行了研究。

综合上述情况，本研究在UCSC及NCBI数据库中查找、筛选了8个适合法医DNA检验的DIPSTR组合遗传标记，设计特异性扩增引物，构建复合扩增体系，设计分析方法，通过模拟样本评估验证其法医效能，从而建立一种同时检测人常染色体DIP和STR基因座的方法，为案件现场微量物证检验中不均衡混合样本的DNA检测提供有效的辅助方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

扩增目的DIP-STR位点的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他试剂主要包括PCR master mix和热启动C-Taq酶均购自无锡中德美联生物技术有限公司。标准对照DNA 9948购自美国Promega公司。

样本采用Mastercycler^® nexus PCR仪（Eppendorf公司，德国）进行扩增，产物用3130XL型遗传分析仪（ABI公司，美国）进行电泳检测。

①流量预警规则：对8：00流量超预警门槛值的设定站点，发布一次预警；以后每过2小时巡查一次，将流量与上次预警时流量比较，如增幅达到或超过预警要求，发布预警。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及标记

通过NCBI和UCSC查找筛选及参考相关文献，最终选定8个DIP-STR基因座。筛选参数包括：DIP位点插入/缺失片段大小为3～10 bp，STR基因座核心序列为3～5碱基，DIP与STR间距小于250 bp，DIP-STR片段大小在500 bp以内。对每个基因座分别设计两条带有不同荧光的用于识别DIP位点缺失（S）/插入（L）分型的上游引物及一条普通公共下游引物，其中rs35032587-STR、rs60194384-STR、rs72406828-STR和rs2308142-STR的S上游引物为FAM标记，L上游引物为HEX标记；rs34212659-STR、rs146332920-STR、rs145423446-STR和rs111478323-STR的S上游引物为TAMRA标记，L上游引物为ROX标记。DIP-STR基因座信息如表1所示，扩增产物排布图如图1所示。

实验结果显示，该复合扩增体系扩增单一成分样本时能获得清晰准确的分型，且基因座间具有较好的均衡性。

表1 DIP-STR基因座信息

图1 DIP-STR扩增产物排布图

1.2.2 复合扩增体系的建立

95℃预变性2 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，共10个循环；90℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共20个循环；最后72℃延伸10 min。

1.2.3 聚合酶链式反应

表2 引物终浓度 μM

DIP-STR复合扩增检测体系采用25 μL标准反应体系设置，其中含有12.5 μL Reaction Mix（各组分终浓度为 50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L MgCl₂、0.25 mmol/L dNTP Mix），5 μL 混合引物以及1 μL热启动C-Taq酶（5 U/μL），加入1片1.2 mm人血斑样本或0.5～2.0 ng提取的人基因组DNA，加水补足至25 μL，充分混匀后短暂离心。体系内混合引物终浓度如表2所示。

仅从这两首诗歌看，陆游的创作心态虽不能改变客观景致本身，却可以改变他自己当前对景致的美恶感受；而景致本身的美恶，则无法改变他一时的心境好坏。两首景致相似却创作心境相反的诗歌，证明个人的即时创作心境或情绪，是陆游观看与书写地域景致的关键元素。

采用前述复合扩增体系，模拟法医物证现场不均衡混合样本进行扩增测试。对两份实际提取样本标准品（女性样本与男性样本各一份），按一定比例混合模拟不同比例的男女混合斑，以此作为扩增模板进行复合扩增及毛细管电泳检测。样本混合比例分别为 1：10、1：25、1：50、1：100；10：1、25：1、50：1、100：1。

“嘀嘀嘀”，安安的手机响了，安安不敢碰手机，梁诚用颤抖的手拿过手机，发现是条短信，打开放到安安眼前，安安苍白的脸直接变得惨白。

2 结果

2.1 复合扩增体系测试

选取两个样本的基因组DNA作为模板，按上述建立体系进行复合扩增及毛细管电泳，结果如图2、3所示。以样本1的rs72406828-STR位点为例（见图2），电泳图显示该位点在FAM和HEX各出一峰，分型为S9/L8，表明此位点的DIP分型是缺失（S）+插入（L），S型DIP位点后接9重复STR，L型DIP位点后接8重复STR。又以样本2的rs146332920-STR位点为例（见图3），电泳图显示该位点在ROX出2个峰，而TAMRA不出峰，分型为L13/L14，表明该位点的DIP分型是插入（L）+插入（L），L型DIP位点后分别接13和14重复的STR。

受人力资源有限及临床实际情况限制,利用传统护理质量评价方法在短时间内收集完整、客观、有效的护理质量评价数据困难较大，数据后期质量分析客观性和准确性不足[9]。本研究以固定成员通过信息化平台结合现场评价方式采集指标数据，有利于在减少人力资源浪费，缩短现场检查时间的同时保证数据客观性、精准性。研究中构建的指标体系各指标维度、指标名称、计算公式、数据来源、数据采集方法及备注界定明确，数据采集时间相近,利于实现质量评价的量化统一，且信息化护理质量控制指标体系使用方法及可操作性强，有利于提高护理质量控制效率，提高质量控制员满意度。

将12 μL去离子甲酰胺与0.5 μL分子量内标Marker SIZ-500（无锡中德美联有限公司，中国）混合。再加入1 μL PCR反应产物，涡旋混匀，3 500 r/min离心2 min，95℃变性3 min，冰浴3 min，用ABI3130XL遗传分析仪进行毛细管电泳。运用Gene Mapper ^®IDX（ABI公司，美国）软件结合产物排布设置对DIP-STR位点分型结果进行分析。

图2 样本1 分型图

图3 样本2分型图

2.2 不均衡混合样本测试

1.2.4 毛细管电泳检测

测试结果显示，当样本主次成分比值在50：1以内时，本方法能够获得较好的分型效果。当两种成分样本的DIP-STR位点没有相同的分型时，可准确得出两种样本各自的分型（见图4～5），其中图4样本分型分别为S7/S11与L12，图5样本分型分别为L12与S11/L13；但是若混合样本两者的DIP-STR位点存在分型重合，且没有其中一个样本的单独分型辅助拆分，则存在无法分辩出两者分型的可能（见图6）。在能够获得其中一个样本的分型时，才能对混合样本进行拆分。

我在这里也想借此发出呼吁，希望有更多对水科学感兴趣的人一起参与其中。目前已经到了这样一个阶段，即由中国科学家领头开创一个新方向、新领域正在变得越来越可行，也越来越重要。这样坚持数年、几十年，中国科学一定会走到前面。我们期待着这一天的早日到来。

图4 混合样本的rs60194384-STR位点分型图

图6 混合样本的rs2308142-STR位点分型图

3 讨论

DIP-STR是基因组中两种遗传标记的串联组合，它既有STR高多态性的优势，又有DIP双等位基因特异分型的特点。与传统STR标记相比，DIP-STR检测不均衡样本的优势在于：1）当主次成分STR分型一致时，可以通过DIP位点加以区分；2）能够避免将主成分的stutter峰与次成分的主峰混淆的情况发生；3）可以对主次比例更悬殊的不均衡样本进行分型^［8］。

本研究通过设计针对DIP位点插入或缺失的特异性上游引物及公共下游引物，运用聚合酶链式反应及毛细管电泳，建立了能够单管同时扩增8个DIP-STR基因座的复合扩增体系。测试结果显示，在检测主次成分相差50倍以内的不均衡样本时能获得较好的分型结果。此方法的建立，为法医现场混合样本的检测提供了新思路。

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然而，DIP-STR遗传标记在用作法医DNA检测的方法时仍存在一些不足之处。由于结合了两种遗传标记，每个位点所需的分型位置增加了一倍，导致一个复合扩增里能够包含的基因座比STR要少，位点数量有限制。再者，当混合样本中不同个体的DIP-STR位点分型出现重叠时，仍然存在无法区分混合成分的可能。因此，在未来的研究中，需要对这些不足进行改进，让DIP-STR遗传标记在现场物证检验的应用更具优势、更有效。

参考文献：

［1］雷亮,臧丽丽,徐洁,等.法医学混合斑研究进展［J］.中国法医学杂志,2015,30（3）：273-276.

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［3］GREEN R L,LAGACÉ R E,OLDROYD N J,et al.Developmental validation of the Amp FℓSTR ^® NGMS Elect^TMPCR Amplification Kit：A next-generation STR multiplex with the SE33 locus［J］.Forensic Science International Genetics,2013,7（1）：41-51.

［4］HALL D,CASTELLA V.DIP-STR：Anew marker for resolving unbalanced DNA mixtures［J］.Forensic Science International Genetics Supplement,2011,3（1）：1-2.

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［8］TAN Y,WANG L,WANG H,et al.An investigation of a set of DIP-STR markers to detect unbalanced DNA mixtures among the southwest Chinese Han population［J］.Forensic Science International Genetics,2017,31：34-39.

Construction of multiplex amplification system with new genetic marker DIP-STR

ZHENG Wen-yan¹,WANG Zhi-yuan²,LUO Gao-si²,FU Jing²,LIANG Sang-hua²,HUANG Yuan-jian¹,QIAN Shui²

（1.Guangdong Homygene Biological Technology Co.ltd,Foshan 528000,China;2.Foshan Public Security Bureau,Foshan 528000,China）

Abstract： Objective To establish a fluorescence labeling multiplex amplification system for simultaneous detection of human autosomal Deletion/Insertion Polymorphisms(DIP)and Short Tandem Repeat(STR)loci,which provides an effective auxiliary method for forensic mixed sample detection.Methods On the basis of multi-fluorescent marker amplification and capillary electrophoresis(CE),DIP loci and STR loci were combined as DIP-STR and eight DIP-STR locus were detected and analyzed.Results A method for simultaneous detection of 8 DIP-STR locus were established.Conclusion In this study,we designed specific primers for insertion or deletion of DIP loci.On the basis of the existing forensic evidence routine testing equipment and methods,we can classify the mixed imbalanced samples in the field of physical evidence,which becomes an effective auxiliary method for case DNA detection.

Key words： insertion-deletion polymorphic loci;short tandem repeat loci;DIP-STR;imbalanced mixed sample;detection

中图分类号： D919

文献标志码： A

文章编号： 1008-0171（2019）04-0026-06

收稿日期： 2018-10-17

基金项目：广东省公安厅科研计划项目（TKY2016001）

作者简介：郑文彦（1990-），女，广东佛山人，广东华美众源生物科技有限公司职员。

*通信作者：钱水（1979-），男，湖南湘乡人，佛山市公安司法鉴定中心副主任法医师。

【责任编辑：王桂珍 foshanwgzh@163.com】

标签：插入-缺失多态性位点论文; 短串联重复序列论文; DIP-STR论文; 不均衡混合样本论文; 检测方法论文; 广东华美众源生物科技有限公司论文; 佛山市公安司法鉴定中心论文;