黎真[1]2004年在《Myostatin基因成熟区DNA的克隆、序列分析及其在真核甲醇酵母中融合表达的研究》文中认为肌肉生长抑制素(Myostatin)是一种抑制动物骨骼肌生长发育的负调控因子，在肌细胞的形成过程中有着重要的生理功能。本课题通过分子生物学手段获得了猪、鸡、鸭Myostatin成熟区DNA的克隆，并在真核生物甲醇酵母中分泌融合表达了猪、鸡Myostatin蛋白，目的是为日后开发利用Myostatin基因，生产Myostatin疫苗阻断其生理效应从而提高动物产肉率提供前期的物质准备，同时也为今后开展其他外源基因的真核表达研究提供了技术支持。 从金华猪、萧山鸡和番鸭的全血中抽提各自的基因组DNA，经PCR扩增得到各自Myostatin成熟区DNA片段，以pUCm-T Vector为载体，克隆了Myostatin的成熟区段，并进行了测序。将测序结果与GenBank上登录的相应物种的序列进行比较，发现金华猪的序列与GenBank上登录的猪DNA碱基序列完全一致，萧山鸡存在两个碱基的变异(T~(218)→C~(218)，C~(219)→T~(219))，鸭的序列在GenBank上尚未见报道。将测序结果与GenBank上其它物种的相应序列进行同源性分析，结果显示，金华猪Myostatin与哺乳动物猪(Sus scrofa)、马、人、猴、牛、兔、山羊、绵羊、小家鼠和大鼠的同源性分别为100％、97％、95％、95％、93％、93％、93％、89％、90％和89％，与鸟类鹅、火鸡、鸡(Gallus gallus)、鸽子、萧山鸡和番鸭的同源性分别为87％、87％、86％、86％、86％和85％，与鱼的同源性为76％；萧山鸡Myostatin与鸟类鸡(Gallus gallus)、火鸡、鸽子、鹅和番鸭的同源性分别为99％、97％、93％、92％和92％，与哺乳动物猴、人、马、猪(Sus scrofa)、金华猪、小家鼠、大鼠、绵羊、兔、山羊和牛的同源性分别为87％、86％、86％、86％、86％、85％、85％、85％、84％、84％和83％，与鱼的同源性为74％；番鸭Myostatin与鸟类鸡(Gallus gallus)、火鸡、鸽子、鹅和萧山鸡的同源性分别为91％、92％、90％、95％和92％，与哺乳动物猴、人、马、猪(Sus scrofa)、金华猪、小家鼠、大鼠、绵羊、兔、山羊和牛的同源性分别为84％、84％、85％、85％、85％、83％、81％、81％、83％、81％和82％，与鱼的同源性为73％。以上数据表明，Myostatin基因在不同物种间具有高度的保守性，表明其具有重要的生理功能。通过测定的序列我们还构建了各物种的系统进化树，该树反映出的各物种进化关系与传统的分类基本一致，但也存在两处疑点，一是牛和兔之间的遗传距离比和绵羊、山羊还要近，二是马和猪的遗传距离十分相近。 将筛选到的猪、鸡Myostatin成熟区DNA的阳性克隆子经EcoR Ⅰ和NotⅠ双酶切后，连接入经同样酶消化的穿梭载体pPIC9K Vector(可在大肠杆菌和甲醇酵母之间穿梭)中，构建重组表达载体Myostatin-pPIC9K，然后通过电转仪将线性化的重组表达载体(Bgl Ⅱ酶切)转化入酵母中，使之与酵母染色体DNA进行同源重组，从而将目的基因整合入酵母染色体中稳定传代并用甲醇诱导其表达，最后用SDS-PAGE凝胶电泳检测表达的Myostatin蛋白。用甲醇酵母表达系统表达目的蛋白的主要优点是能对表达的蛋白质进行翻译后加工修饰处理，从而使表达出的蛋白具有生物活性，且能将目的蛋白分泌表达至培养液中，使后续的纯化工作大为便利。
黎真, 林一心, 牛冬, 阮晖, 傅衍[2]2007年在《鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达》文中进行了进一步梳理根据GenBank中鸡myostatin(AF019621)成熟区段的cDNA序列设计了1对引物,利用PCR技术扩增了萧山鸡myostatin的成熟区段,构建了重组真核表达载体myostatin-pPIC9K,并在甲醇酵母中融合表达了myostatin蛋白。结果发现,萧山鸡myostatin基因存在2处碱基变异:T204→C204(编码的氨基酸没有变),C205→T205(编码的氨基酸由Pro变成Ser),从而产生了1个EspⅠ或Bpu1102Ⅰ限制性内切酶酶切位点。核苷酸序列同源性分析表明,myostatin基因成熟区段DNA在不同物种间具有高度的保守性。SDS-PAGE鉴定结果表明,表达的目的蛋白(26 ku)具有生物学活性。
参考文献：
[1]. Myostatin基因成熟区DNA的克隆、序列分析及其在真核甲醇酵母中融合表达的研究[D]. 黎真. 浙江大学. 2004
[2]. 鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达[J]. 黎真, 林一心, 牛冬, 阮晖, 傅衍. 中国兽医科学. 2007