天津市第一中心医院普外科 天津 300192
【摘 要】目的：观察去甲斑蝥素（NCTD）对裸鼠原位胰腺癌血管生成及瘤体血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管内皮细胞钙黏蛋白（VE‐Cd）、低氧诱导因子-lα(HIF-lα)表达的影响 ，探讨NCTD抑制胰腺癌的可能作用机制。方法：胰腺癌细胞（Capan-2）培养转代后注射到裸鼠胰尾部被膜下建立移植瘤模型，40只胰腺癌（Capan-2细胞）移植瘤裸鼠，随机分成对照（NS）组20只和实验（NCTD）组20只。采用免疫组化法分析VE‐Cd、,VEGF、HIF-lα等促血管生成因子的表达水平。结果：与对照组相比 ，经NCTD干预的裸鼠生长状态基本不受影响，但瘤体生长受到抑制，瘤内血流峰值（PI）明显下降，VE‐Cd、,VEGF、HIF-lα表达减少，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论：去甲斑蝥素能明显抑制胰腺癌的血管生成，其机制跟下调VEGF 、VE‐Cd 、HIF-lα等促血管生成因子的表达有关。
【关键词】去甲斑蝥素；胰腺癌；血管内皮生长因子；血管内皮细胞钙黏蛋白
【中图分类号】R322.4+91 【文献标识码】B 【文章编号】1764-8999（2015）7-0609-02
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤，具有起病隐匿，病情进展迅速、预后差等特点，诊断治疗均较困难。近年来胰腺癌发病率、死亡率均呈上升趋势。有资料显示，全世界胰腺癌发病率约为每年185000例，而我国的胰腺癌的发病率已达5.1/10万1。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是我国传统中药斑蝥有效成分斑蝥素的衍生物。大量研究结果表明，NCTD对肝癌、胆囊癌等肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用2。然而，NCTD对人胰腺癌的抑制作用报道较少，本研究旨在观察NCTD对裸鼠胰腺移植瘤血管生成及VE‐Cd、,VEGF、HIF-lα的表达的影响，探讨其抗胰腺癌的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
NCTD购自南京泽朗医药科技公司（纯度 ＞99％ ） ；胰腺癌细胞株（Capan-2）购自中国科学院上海细胞库；BALB/cnu/nu裸小鼠４０只，购自上海肿瘤研究所实验动物部，雄性，鼠龄6～8周，体质量20g左右，在SPF级条件下饲养。RPMI‐1640培养液和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司 ；兔抗VE‐Cd单克隆抗体购自Abcam公司 ，兔抗VEGF 、HIF-lα、CD34多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体购自R&D公司。Ｂ超仪使用具有超声造影程序的Simens$2000超声诊断仪。
1.2方法
1.2.1细胞的培养和传代
胰腺癌Capan-2细胞采用贴壁培养的方法，养于37℃含5％C02的培养箱中。使用添加有10％胎牛血清并100 U／ml青霉素和100 U／ml链霉素的RPMIl640培养基进行细胞培养，长至80％、90％细胞时传代。取对数生长期的细胞用于实验研究。
1.2.2动物模型建立、分组及给药方法
2％戊巴比妥钠(50mg／Kg)腹腔注射麻醉裸鼠，取左上腹直肌旁lcm切口，暴露脾脏和胰腺尾部，用50u L微量注射器吸取50u L胰腺癌细胞悬液，在放大镜下注射到脾脏下面的胰尾部被膜下，以被膜下出现可鉴别的隆起性液泡而无液体渗漏到腹腔为注射成功的标志。注射成功后分两层关闭腹壁，共制备40只裸鼠。4周后如可在裸鼠左上腹触及一结节，即为模型建立成功。40只裸鼠均造模成功。鼠称重后随机分为2组：对照（生理盐水）组(NS)、去甲斑蝥素组(NCTD),每组20只。分组当天开始腹腔注射给药，对照组 0.9%生理盐水腹腔注射0.4mL；实验组 NCTD?20mg/kg 腹腔注射,均每3天一次，共7次。
1.2.3 超声造影法检测两组原位移植瘤的血供情况
末次给药后第7天麻醉裸鼠，俯卧位置于操作台上，探头和裸鼠皮肤间涂以离心后的超声耦合剂。经尾静脉团注超声造影剂20mL，随即推注0.2mL生理盐水，同时开始采集l min的造影全过程。图像采集帧频30～37Hz，使用内置的超声造影分析软件在机分析，造影录像以DICOM的AVI格式导出，应用对比脉冲序列造影成像技术对肿瘤的血供进行定量评价。以整个移植瘤为感兴趣区(region of interesting，ROI)，获得峰值强度(peak intensity，PI)参数。
1.2.４原位移植瘤数据采集
末次给药后第7天处死所有裸鼠，解剖胰腺原位移植瘤，比较肿瘤生长情况，分别测肿瘤长径及短径，并计算肿瘤体积，体积计算公式按照v=兀／6×a2×b（a为短径，b为长径）。
1.2.5免疫组化分析肿瘤组织中细胞VE‐Cd、,VEGF、HIF-lα的表达量。
每组随机抽取10个标本，用4％多聚甲醛将肿瘤组织固定，然后石蜡包埋，常规脱蜡 ，柠檬酸高温修复抗原 ，加3％ 过氧化氢消除内源性过氧化物酶 ，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，加入兔抗人VE‐Cd、VEGF、HIF—l抗体，4℃冰箱12小时后PBS漂洗，5分钟×3次，后放入37℃水浴箱复温45min；加入抗兔IgG抗体，37℃水浴箱孵育30min，PBS洗，5分钟×3次；DAB显色、苏木素复染、PBS冲洗返蓝，脱水封片。图片结果用Image—Pro Plus 6．0图像处理软件进行分析。
1.2.6 Western Blot检测VE‐Cd、VEGF、HIF-1 a蛋白表达
每组剩余10个标本，用细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，紫外光分光光度计法进行蛋白定量。50ug/孔 上 样 ，加 入10%SDS-PAGE 分离胶中进行电泳，之后将蛋白质通过干转移法转移到 PVDF 膜上，然后将PVDF 膜放入TBST 中清洗3次，每次5 min，摇床摇动，用含 5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭 6 h，加入一抗（兔抗人VE‐Cd、VEGF和HIF-1 a）37℃孵育90 min，摇床摇动，将 PVDF 膜放入 TBST 中清洗3次，每次5min，接着加入荧光二抗（抗兔 IgG） 37℃孵育1h，摇床摇动，然后 TBST 充分漂洗（3 次，每次10 min），最后应用 odyssey 成像仪显色。
1.3 统计分析
所有数据用SPSS15．0统计软件包进行处理。计量资料用(X±s)表示，两组均数比较用t检验，以P<0．05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NCTD对裸鼠移植瘤体积、瘤重的影响 用药前各组肿瘤平均体积及平均体重，差异均无统计学意义(P>O．05)。用药后NCTD组裸鼠体重21.14±0.25g与NS组20.70±0.27g相比，差异无统计学意义(P>O．05)；而NCTD组的瘤体平均体积为(212.56±22.35)mm3、瘤体质量0.38±0.27g与NS组体积(318.78±34.25)mm3、瘤体质量0.62±0.25g相比，差异有统计学意义(P<O．05)。实验过程中裸鼠体重及瘤重变化如表1示。
2.2 NCTD对裸鼠移植瘤血供影响 通过对裸鼠肿瘤行超声造影检测，结果显示：用药后NSTD组肿瘤血供较对照组明显减少（见图1），用药前两组血流峰值（PI）无明显差异p＞0．05，用药后NSTD组肿瘤血供较对照组明显减少，NCTD组峰值强度为17.28±2.20db，NS组PI为41.05±1.78db（见表2），差异有统计学意义p<0．05)。
2.2 NCTD对裸鼠胰腺癌移植瘤VE‐Cd、VEGF、HIF-lα其蛋白表达量的影响 图2所示分别为VE‐Cd、VEGF、HIF-lα免疫组化染色图片，NS组均有大量表达，而NCTD组表达均明显减少。应用Totallab2．1软件分析Western印迹图像并记录灰度值，如图3所示。NCTD可以显著下调VE‐Cd、VEGF、HIF-lα蛋白的表达量，差异有统计学意义(P<O．05)。
3 讨论
1971年Judah Folkman首次提出假说，认为新生血管生成是肿瘤的生长的首要条件，这一观点被认为是肿瘤研究领域具有里程碑意义的概念，而之后的许多相关试验也证实了这一假说的正确性。VEGF是目前所发现的作用最强、特异性最高的促血管生成因子，许多实验证实VEGF的表达水平与肿瘤组织的微血管密度及恶性度呈正相关，并明显高于非肿瘤组织。VE‐Cd是由内皮细胞特异性表达的一种跨膜粘附分子，控制着内皮细胞之间连接的稳定性，并负责向细胞内传导信号和促进血管的成熟，下调VE‐Cd的表达将延缓血管样通道的形成3。低氧诱导因子(HIF-lα)则是在肿瘤生长过程中出现缺血坏死时激活血管生长因子(VEGF)的基因表达，促进血管新生，为肿瘤的侵袭及转移创造条件4。
本研究利用超声造影法检测裸鼠原位移植瘤的血供情况，证实NCTD可明显减少胰腺癌组织中的血管的生成。进一步的免疫组化结果提示，NCTD组胰腺癌移植瘤内VEGF 、VE‐Cd 、HIF-lα等促血管生成因子的表达水平较NS组明显下降，其蛋白表达亦受到抑制，所以我们推测NCTD可以下调VEGF 、VE‐Cd 、HIF-lα等3种蛋白的表达，从而抑制肿瘤组织新生血管的生长，发挥抑制肿瘤侵袭的作用。但NCTD抑制胰腺癌的作用可能有多个方面，至于NCTD抗胰腺癌是否还涉及其他途径或者靶点，则有待于更广泛深入的研究。
参考文献
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论文作者:宋冰,张文婧△,郭仁德,谷川
论文发表刊物:《中医学报》2015年7月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/20
标签：肿瘤论文; 血管论文; 胰腺癌论文; 造影论文; 细胞论文; 斑蝥论文; 内皮论文; 《中医学报》2015年7月第30卷供稿论文;