黑龙江省大庆油田总医院肿瘤科二病区 163001
摘要：目的：探讨新辅助化疗前后宫颈癌组织中MDR1、Bcl-2的表达情况及与紫杉醇联合卡铂新辅助化疗疗效的关系。方法：采用免疫组织化学S-P法分别检测60例宫颈癌患者新辅助化疗前后癌组织中Bcl-2和MDR1基因编码的P-gP的表达阳性率的差异。结果：化疗临床有效率为65%；化疗后Bcl-2表达低于化疗前，P>0.05；化疗后P-gP的表达水平明显高于化疗前组，P<0.05；化疗前P-gP、Bcl-2的表达在化疗有效组均低于无效组，但P-gP降低的更明显，P<0.05；Bcl-2阳性组中P-gP表达阳性率高于Bcl-2阴性组，P>0.05。结论：化疗能诱导P-gP的表达，P-gP可作为预测化疗疗效的指标；Bcl-2的过量表达也可能是宫颈癌产生耐药的原因；在宫颈癌组织中P-gP与Bcl-2的表达无明显相关性。
关键词：宫颈癌 MDR1 Bcl-2 卡铂 紫杉醇 新辅助化疗
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，位居女性恶性肿瘤的第二位。近年来，宫颈癌术前或放疗前的化学治疗越来越受到国内外学者的重视。新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NACT）即肿瘤患者在接受主要治疗手段之前给予一定疗程的化疗，使肿瘤体积缩小，降低临床分期，改善患者的一般情况，增加手术机会，提高手术的效果，减少手术的并发症，尤其是对放疗不敏感的腺癌有较好的疗效。
NACT疗效差异的原因众多，多药耐药（（Multidrug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因。产生肿瘤MDR可能的机制较多，但目前研究最集中的是MDR1基因编码的P一gP（MDR1/P一gP）过度表达，同时能在临床上证实与一些肿瘤MDR相关的也只有MDR1/P一gP[1]。MDR1基因的表达产物P一gP分布在细胞膜、细胞核内和高尔基体。当药物进入细胞后P一gP结合药物分子，同时其ATP位点结合ATP后释放能量使药物转运到胞外，也可直接从胞膜排出药物使其细胞毒作用减弱或丧失。P一gP还可使药物在细胞内再分布，导致药物聚集于与药物作用无关的细胞器如溶酶体内导致耐药[2]。由于P一gP过度表达，其药物外排作用增强，从而介导肿瘤细胞产生MDR。
近年来研究认为细胞凋亡抑制也是引起多药耐药的一个主要原因。为此我们观察了紫杉醇联合卡铂的新辅助化疗前、后宫颈癌组织中P-gP与Bcl - 2 的表达情况，现报告如下：
1 材料与方法
1.1临床资料
所有标本均来自我院病理科存档蜡块（2014年-2016年）。HE切片均经镜下病理检查证实，60名患者均具备化疗前后组织共120个样本（化疗前均未进行任何治疗），其中53例为鳞状细胞癌，7例为腺癌，年龄从28-70岁之间，中位年龄49岁。经3名以上的妇科专家检查，并按国际妇产科联盟（FIGO）的分期标准进行分期，其中Ⅰb、Ⅱa期35例，Ⅱb期17例，Ⅲa-Ⅲb期8例；局部病灶最大直径<4cm或≥4cm分别为38例、22例。
1.2研究方法
1.2.1试剂：免疫组化试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司。
1.2.2免疫组化方法：将存档的福尔马林固定、石蜡包埋组织行4μm连续切片，作HE染色和SP免疫组化染色，免疫组化SP法严格按照说明书操作步骤进行，DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封片，显微镜下观察用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，并用高压锅对组织抗原进行修复处理。
1.2.3治疗方案：经静脉全身化疗：在各项实验室检查无化疗禁忌后，给予紫杉醇联合卡铂静脉化疗，分别于化疗前一晚 22：O0 及次 日6：O0 给予地塞米松 10mg口服，紫杉醇 135 ～175 mg/m2静脉滴注（D1），卡铂AUC 4～5静脉滴注（D2），期间监测血常规、生化等相关指标，观察化疗不良反应。每次疗程结束后相关实验室检查无明显异常可出院。
1.2.4结果判定：
结果判定标准：Bcl-2阳性细胞在宫颈癌组织中呈弥漫或散在分布，阳性产物主要定位于胞浆。高倍镜下取4个视野各计数200个细胞，阳性细胞数<10%为（-），10%一25%为（+），25%一75%为（++），>75%为（+++），（+一+++）为阳性。（如图1）
（MDR1）P-gP 阳性表达产物为棕黄色，细颗粒状，主要定位于肿瘤细胞膜，部分胞浆亦可见染色。高倍镜下取4个视野各计数200个细胞，阳性细胞数<10%为（-），10%一25%为（+），25%一75%为（++），>75%为（+++），（+一+++）为阳性。（如图2）
化疗效果的判断：化疗前测量宫颈肿块的最大直径及其最大垂直横径，以二者乘积表示肿块大小。3周期化疗结束后3周结合妇科检查、CT、核磁等综合评定病灶大小变化情况。采用国际抗癌协会（UICC）疗效判定标准，完全缓解（CR）和部分缓解（PR）视为临床有效，无变化（NC）和临床进展（PD）视为临床无效。
1.2.5统计学处理 应用SPSS统计软件16.0进行X?检验。
2 结果
2.1 60例患者经NACT后完全缓解（CR）5例，部分缓解（PR）34例，临床无效21例，临床有效率为65%（39/60）。
2.2 NACT化疗前、后P-gP、Bcl-2表达的变化：P-gp表达阳性率分别为：33.3%、58.3%，经X?检验P<0.05（P=0.0006）；Bcl-2表达阳性率分别为：53.3%、38.3%，经X?检验P>0.05（P=0.099）。见表1
表1 宫颈癌NACT前、后P-gP、Bcl-2表达的变化
3讨论
宫颈癌严重危害妇女健康，自上世纪50年代开始，NACT逐渐应用于宫颈癌的综合治疗，主要针对局部晚期宫颈癌，为局部晚期宫颈癌的综合治疗开辟了新的模式，对局部晚期宫颈癌的综合治疗具有积极意义。
紫杉醇是一种从云南紫杉中提取的新型抗肿瘤药物，属细胞周期特异性药物，主要作用于微管，可使微管过稳定化及排列异常，影响细胞分裂，从而发挥抗肿瘤作用。卡铂是第二代铂类抗癌药物，与非铂类抗癌药物无交叉耐药，故可与多种抗癌药物联合应用。本研究中采用紫杉醇和卡铂联合化疗，经过3个周期的治疗，宫颈癌局部肿块大部分有不同程度缩小，临床有效率达到65%，无进展病例，与Sultan等[4]报道相近。虽然NACT疗效确切，但目前仍有部分患者对此不敏感，MDR是肿瘤化疗失败的主要原因。MDR基因家族在人类含有MDR1和MDR3两个基因，其中只有人类的MDR1基因可产生MDR现象。遗传学研究显示，人类MDR1基因位于染色体7q21一23位点，包括29个外显子和28个内含子，编码药物运载体P一gP蛋白。P一gP是ATP结合转运蛋白（ATP binding cassette，ABC）超家族成员之一，嵌插于细胞膜上，跨膜区作为膜通道有利于物质转运，具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能，可以将细胞内底物包括多种抗肿瘤药物泵出胞外，使细胞内化疗药物达不到有效杀伤剂量而产生耐药。P一gP是一种药物“外排泵”。P一gP外排作用介导肿瘤MDR与P一gP表达有一定相关性。P一gP在药物敏感的肿瘤细胞中通常表达量较低，而在耐药肿瘤细胞中常高水平表达。Lingy等[5]通过离体研究发现，P一gP的表达与耐药细胞的MDR呈正相关。Konishi等[6]通过研究发现P一gP表达水平越高化疗疗效越差（P<0.05），提示 P一gP可作为宫颈癌患者化疗疗效的一个预测性指标。本研究发现，宫颈癌NACT前、后P-gP表达阳性率分别为：33.3%、58.3%，化疗后P-gP表达明显高于化疗前，两者有显著差异性（P<0.05）；化疗有效组、无效组在化疗前P-gP表达阳性率分别为：23.1%、52.4%，无效组明显高于有效组，两者有显著性差异（P<0.05）。此结果与目前多数研究结果相一致。
Bcl-2是目前已知的一种参与细胞凋亡的癌基因，Bcl-2基因家族对细胞凋亡起着调节作用并能改变肿瘤对化疗药物的敏感性。已证实临床上某些肿瘤细胞中存在Bcl-2的高表达，并且这种Bcl-2高表达的肿瘤细胞对化疗药物敏感性较低[7]。本研究发现，宫颈癌NACT前、后Bcl-2表达阳性率分别为：53.3%、38.3%，化疗后Bcl-2表达低于化疗前，两者差异不显著（P>0.05）；在化疗有效组、无效组化疗前Bcl-2表达阳性率分别为：46.2%、66.7%，无效组高于有效组，两者差异不显著（P>0.05）。本研究显示，宫颈癌组织中Bcl-2高表达，化疗无效组Bcl-2也是高表达，由此可见，Bcl-2过量表达可能是肿瘤产生耐药的原因之一，而高表达Bcl-2的肿瘤细胞也许是耐药瘤株，故也有人把Bcl-2视为一种新的耐药相关基因。
由于耐药机制的复杂性，同一肿瘤细胞的耐药可能由几种机制参与。本研究中，化疗前宫颈癌组织中Bcl-2阳性组P-gP表达的阳性率为40.6%，Bcl-2阴性组P-gP表达的阳性率为25%，两者差异不显著（P>0.05），提示：P-gP的表达与Bcl-2的表达无明显相关性，说明与凋亡有关的Bcl-2基因参与耐药的机制可能不是通过经典途径发挥作用的，而是抑制了肿瘤细胞的凋亡从而表现出MDR。国内卢步峰等[8]研究结果显示，细胞内Bcl-2水平的高低直接影响到其对多种化疗药物的敏感性和耐受性，并且那些经转染使Bcl-2蛋白水平升高引发耐药形成的肿瘤细胞株本身并无P-gP过度表达。近年来研究显示，引起肿瘤细胞发生多药耐药有多种机制，除P-gP引起的经典耐药机制外，Bcl-2通过抑制肿瘤细胞凋亡途径导致耐药的发生[9]也是其中之一。Bcl-2过度表达，可使肿瘤细胞获得优势生长，从而促进耐药发生。
细胞凋亡是细胞生物学行为中的一个复杂的主动过程，其始动和进展受细胞内、外许多因素的调节，明确其调控因素，无疑是防治肿瘤研究的重要方向。随着对MDR机制的深入研究，必将有更多的分子意义上的新发现，其中MDR与凋亡现象之间的内在联系的研究，可从本质上揭示MDR原理和发现克服MDR的新靶标，为合理选用已有药物、研究开发抗MDR的新药、预防耐药发生、探索克服MDR新途径奠定基础。
图2：腺癌P-gP 阳性表达分布在胞膜/胞浆（×200）
参考文献：
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论文作者:于欣欣,冯英,朱丹丹,张国栋,张力
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第5期
论文发表时间:2017/6/27
标签：宫颈癌论文; 肿瘤论文; 细胞论文; 药物论文; 阳性论文; 紫杉醇论文; 基因论文; 《中国误诊学杂志》2017年第5期论文;