摘要：目的：观察电针百会、太冲、三阴交对鱼藤酮致帕金森（PD）大鼠的行为学变化和中脑黑质中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)的影响，研究针刺治疗PD的作用机制。方法：78只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、西药组和电针组，采用颈、背部皮下注射鱼藤酮溶液0.8mg/kg·d制备PD大鼠模型，造模成功后，西药组给予美多巴混悬液灌胃，1.67mg/kg·d，电针组选百会、三阴交、太冲穴，用φ0.30mm×13mm毫针刺入，接韩氏电针仪，采用疏密波，频率疏波2Hz、密波80Hz，强度2.0mA，每次10mg/kg·d，电针正极接一侧三阴交，负极接同侧太冲，双侧相同；西药和电针组均7d/疗程，共治疗2个疗程，疗程间休息1d；除西药组外，其余各组均灌服等体积的生理盐水；除电针组外，其余各组也均采用同一体位固定10min。各组大鼠行为学测试后脱臼处死，取脑，行中脑黑质TH免疫组化(S-P法)染色检查。结果：悬挂实验：模型组评分值低于正常组，P＜0.05，电针组评分值均高于模型组，P＜0.05，西药组评分值与模型组相比，P＞0.05，电针组评分值与西药组相比，P＞0.05；网格实验：模型组大鼠移动潜伏期大于正常组P＜0.05，电针组低于模型组，P＜0.05，西药组与模型组相比，P＞0.05，电针组与西药组相比，P＞0.05。结论：电针百会、太冲、三阴交具有改善PD大鼠行为学，可使模型大鼠中脑黑质区TH免疫反应阳性神经元数目明显增多，为临床应用电针治疗PD提供了理论支持。
关键词：电针；帕金森；悬挂实验；网格实验；开阔实验；酪氨酸羟化酶；大鼠
PD是常见的中老年神经系统变性疾病，临床以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为主要特征[1]。主要病理改变为中脑黑质DA能神经元逐渐变性死亡，纹状体 DA含量下降[2]。本病在我国65岁以上人群患病率为2.05%。随着人类平均寿命的延长和社会老龄化的到来，PD发病率呈明显上升趋势，成为影响人类身体健康和生活质量的重要疾病。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选用清洁级Wistar大鼠，雄性，体重200±20g，由河北医科大学动物实验中心提供。合格证号：201103042。动物喂养使用河北医科大学动物实验中心提供的大鼠基础饲料。在河北医科大学中医学院实验中心提供的清洁级动物实验房饲养，室温20～24 ℃，自然采光，通风良好。
1.1.2 实验针具及药物 华佗牌无菌不锈钢毫针，φ0.30mm×13mm；韩氏(HANS)电针仪，型号LH202H，北京华卫产业开发公司；多巴斯肼片(美多芭)，上海罗氏制药有限公司，批号H10930198，实验时采用生理盐水配制成所需浓度的混悬液。
1.1.3 实验试剂和仪器 鱼藤酮(RoteNone)，石家庄植物农药研究所，批号：SZYC20100113R，实验时采用二甲基亚砜配制成所需浓度的溶液；二甲基亚砜(DMSO)，天津市凯通化学试剂有限公司，批号：Q/HG3144-99；免疫组化染色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；HM-200型电子分析天平，日本AND； 600型电热恒温水箱，天津；DW-40L262立式低温冷藏箱，青岛海尔医用低温科技有限公司；2035型LEICA切片机，德国；Citadel-2000包埋机英国姗顿公司； HMIAS-2000显微图像分析系统，武汉同济医科大学。
1.2 方法
1.2.1 78只Wistar大鼠均自然光照，自由饮水进食，正常饲养1周后，根据参考文献[3]造模，随机选取58只作为模型组大鼠，采用颈、背部皮下注射鱼藤酮溶液0.8mg/ kg·d，(溶剂为二甲基亚砜，浓度为2mg/ml) 28d制备PD大鼠模型；其余20只作为正常组注射等体积的溶剂。造模结束后，通过网格实验、悬挂实验和开阔实验对比模型组和正常组大鼠的行为学变化，模型组和正常组各随机选取10只剖杀，观察组织形态和神经生化变化，以判定造模成功与否。造模成功后将模型组大鼠随机分为模型组、西药组和电针组。
1.2.2 治疗方法 造模成功后，西药组大鼠每日给予美多巴混悬液灌胃1.67mg/kg·d(生理盐水配制的浓度为25mg/ml的美多巴混悬液)；电针组大鼠每日按顺序给予治疗，将大鼠固定在自制束鼠器上，参照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》，选百会、三阴交、太冲穴，用φ0.30mm×13mm毫针刺入，接韩氏电针仪，采用疏密波，频率疏波2Hz、密波80Hz，强度2.0mA，10min/次·d，西药组和电针组均7d/疗程，共治疗2个疗程，疗程间休息1d；除西药组外，其余各组均灌服等体积的生理盐水；除电针组外，其余各组均采用同一体位固定10min/次·d。治疗均由同一操作者操作。
1.2.3 取材与检测方法 治疗结束后，观察大鼠包括悬挂实验、网格实验及开阔实验在内的行为学变化后，将大鼠脱臼处死取脑，左脑参照Paxinos和Watson鼠脑立体定位图谱，切取包含黒质的脑组织(前囟后5.0～5.2 mm处)，放入备好的4%多聚甲醛的磷酸缓冲液中，固定一周以上。
1.2.3.1 行为学检测
悬挂实验：根据参考文献[4]，将大鼠两前爪悬挂于距离地面1m水平固定的绳子(直径2mm，长100cm)上，记录大鼠落地前的时间，3s内大鼠跌落或仅一爪抓住绳子均属失败。根据参考文献评分：0～4s评0分；5～9s评1分；10～14s评2分；15～19s评3分；20～24s评4分；25～29s评5分；超过30s评6分。每隔5min测1次，共测3次。
网格实验：根据参考文献[5-6]，选择与水平面垂直的独立金属网格(面积80cm×50cm，网格大小1cm×1cm) 作为实验装置，将大鼠正立置于金属网格中央，使大鼠位置与地面垂直，各趾爪均抓住金属网格。用秒表记录大鼠由静止状态直至其任意一爪移动时所花的时间，即为大鼠移动潜伏期。每隔5min测1次，共测3次。
开阔实验：根据参考文献[7]，将大鼠放置在大鼠笼内，观察大鼠自主活动情况(持续150s)，计测大鼠两前肢离地累积的持续时间为大鼠直立时间；令大鼠四肢着地，头与身体均保持静止，计测其蹲于某一位置所积累时间，为大鼠静止性蹲坐时间。
1.2.3.2
中脑黑质TH免疫组化染色检查
将在4%多聚甲醛的磷酸缓冲液中固定一周以上的中脑黑质组织，经脱水、透明、石蜡包埋，切取6μm厚的冠状切片，先行HE染色，光镜下观察中脑黑质组织形态学变化。
再用S-P法行TH免疫组织化学染色，镜下观察TH阳性表达细胞
2 结果
2.1治疗前后各组大鼠行为学观察
悬挂实验：治疗前模型组、西药组和电针组评分值均低于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)；模型组、西药组和电针组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后模型组评分值低于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)；电针组评分值均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)；西药组评分值与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；电针组评分值与西药组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。(表1)。
网格实验：治疗前模型组、西药组和电针组大鼠移动潜伏期均高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)；模型组、西药组和电针组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后模型组大鼠移动潜伏期大于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)；电针组低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)；西药组与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；电针组与西药组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。(表2)。
开阔实验：治疗前模型组、西药组和电针组大鼠静止性蹲坐时间均高于正常组，站立时间均低于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)；模型组、西药组和电针组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后电针组和西药组大鼠静止性蹲坐时间均低于模型组，站立时间均高于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.01)；电针组大鼠静止性蹲坐时间与西药组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，站立时间低于西药组，差异有统计学意义(P＜0.01)。(表3-4)。
表1 治疗前后各组大鼠悬挂实验评分值比较 (±s)
注：与正常组比较▲P＞0.05，与模型组比较△P＜0.01，与西药组比较★P＜0.01。
2.2 治疗后各组大鼠中脑黑质HE染色镜下观察
光镜下观察：正常组DA能神经元形态完整，细胞排列相对整齐；核呈圆形或锥形，大而清晰，核仁明显；神经纤维排列整齐，结构紧密。模型组神经元部分轻度肿胀，体积增大,细胞间隙增宽；细胞核形态不一，体积增大,偏居一侧,核仁不明显，神经纤维排列紊乱，结构疏松。电针组与模型组相比中脑黑质DA能神经元改善明显，神经元肿胀减少减轻，体积变小，细胞间隙变窄；细胞形态较规则，体积较正常，核仁较明显，神经纤维排列较整齐，结够较密集，西药组改善差于电针组差，优于模型组。电针组、西药组均差于正常组。(图1-4)。
2.3 治疗后各组大鼠中脑黑质TH免疫组化染色观察
正常组TH免疫反应阳性神经元呈棕褐色，密集分布，数量较多，胞体较大，神经元突起明显。模型组TH免疫反应阳性神经元数目明显减少，神经元胞体轮廓及突起不清晰。电针组与模型组相比TH改善明显，阳性神经元数目增多，神经元胞体轮廓及突起较清，西药组改善差于电针组，优于模型组。（图5-8)。
3 讨论
PD的治疗中，L-DOPa替代疗法和各种外科手能够在一定程度上改善患者症状，但不能阻止黑质DA能神经元的持续丢失，更不能恢复黑质DA能神经元数目；神经营养因子的使用，可以保护残存DA能神经元的功能；神经干细胞移植和基因治疗的研究，可以保护黑质DA能神经元免于死亡和恢复黑质DA能神经元数量，彻底逆转PD的病理状态，可能对PD的彻底治愈有所突破，期待有更好进展。近年，有关针刺治疗PD的实验研究和临床报道越来越多，有报道针灸能引起PD大鼠黑质和纹状体区神经干细胞发生显著增殖现象，且观察到在增殖的神经干细胞中有一部分转化为神经元[8]，证实了针灸治疗PD的有效性。
DA是DA能神经元合成和释放的主要功能性神经递质，DA的合成过程以酪氨酸为底物，经过TH羟化，多巴脱羧酶脱羧而成。因而TH是酪氨酸转化成DA的关键限速酶，提高TH酶蛋白含量，促进L-DOPA的生成，增加DA含量及释放量是治疗PD的策略之一。
本实验结果说明电针百会、太冲、三阴交穴可增加黑质TH阳性神经元的数量和纹状体DA的含量,对DA能神经元具有一定的保护作用。实验结果进一步证明电针PD大鼠的百会、太冲、三阴交穴，一方面通过针刺太冲、百会发挥熄风止颤的作用，改善PD大鼠的行为学变化，减轻PD大鼠的肌肉震颤、全身抖动、四肢僵直等症状，另一方面通过针刺百会、三阴交达到滋补肝肾，填精益髓目的，使脑髓得以充养，与实验结果中PD大鼠TH增加相吻合，从PD发病机制的角度证实了PD的发病与肾虚髓空的关系，为临床应用补肾养肝填髓，熄风通络止颤之法治疗PD提供了有力的实验依据。
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论文作者:李霞1,肖红玲2,宋海平3,谢俊玲4,曹风莉5
论文发表刊物:《中国实用内科杂志》2016年7月第7期
论文发表时间:2016/12/12
标签：电针论文; 大鼠论文; 西药论文; 模型论文; 神经元论文; 中脑论文; 统计学论文; 《中国实用内科杂志》2016年7月第7期论文;