广西医科大学第一临床附属医院放疗科 广西南宁 530021
【摘 要】目的：比较健康人与鼻咽癌患者鼻咽部菌群结构的组成分布及多样化表现，探讨细菌结构变化与鼻咽癌的关联。方法：使用T-RFLP分析技术分析对比健康者及鼻咽癌患者鼻咽部群菌结构的差异。结果：9例健康者共获取82种T-RFs片段，并以 T-RF119、T-RF152、T-RF 235、T-RF 400的优势菌群为代表；而7例鼻咽癌患者共获得91种T-RFs片段，优势菌群分别为T-RF 62、T-RF 77、T-RF 146、T-RF 333、T-RF 400；多样性指数方面，鼻咽癌患者的香农指数、辛普森指数、均匀度指数均低于健康人，但T-RFs数目明显增高（P<0.05）。结论：健康人与鼻咽癌患者在鼻咽部的菌群构成和丰度存在明显差异；T-RF 62、T-RF 77、T-RF 146、T-RF 333所代表的优势菌群可能与鼻咽癌相关；与健康人相比，鼻咽癌患者的菌属种类明显增多，但优势菌群减少，菌群结构的多样化程度下降，物种分布均匀度较差。
【关键词】鼻咽癌；菌群；T-RFLP技术；多样性指数
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）全球每年总体发病率小于1/10万，但在我国华南地区特别是广西、广东两省其发病率却大于20/10万[1-2]。EB病毒感染、遗传因素、环境影响等常见因素在鼻咽癌病因学中起重要作用[3-4]。但随着分子生物学的发展，不断有学者发现人体细菌群落结构的改变与肿瘤的发生发展可能存在某种关联。例如Burkit的淋巴瘤研究结果发现，EBV可能并非唯一的感染性致癌因素，而是与其他微生物如疟原虫的协同感染而促使细胞癌变[5-6]。中南大学的研究组曾在鼻咽癌患者的鼻咽部发现纳米细菌，并认为可能与鼻咽癌发病有关[7]。这些线索提示我们，了解鼻咽癌与健康人鼻咽部微生物的群落组成结构的差异，对鼻咽部肿瘤的病因学研究及防治有着极为重要的意义。
本研究通过分别对10例健康者及鼻咽癌患者的鼻咽部进行样本采集，利用末端限制性酶切片段长度多态性分析技术（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP），比较两者间细菌菌群的组成结构及分布，根据香农指数、辛普森指数、均匀度的多样性指数描述其多样化程度差异，探究鼻咽部菌群结构的改变与鼻咽癌的可能关联，并为鼻咽癌的病因病机供基础数据和科学依据。
1 材料与方法
1.1 标本 选择2013年9月至2014年4月在广西医科大学第一临床附属医院放疗科的7例鼻咽癌患者为研究对象，年龄18-70岁，KPS评分>90，并在近1个月内无抗生素、激素及免疫抑制剂使用史；采取调强适形放疗技术进行治疗，治疗周期约6-7周。对照组为9例健康志愿者。对所有研究对象采集鼻咽拭子样本共20份，使用400μL PBS缓冲液储存拭子样本并置于-20℃超低温冰箱备用。
1.2 鼻咽拭子DNA提取 使用玻璃珠机械破碎法+溶菌酶裂解法结合DNA提取试剂盒法（Beads--Lysozyme+QIA法）进行DNA的提取[8]。
1.3 T-RFLP技术 利用通用引物对16SrRNA基因可变区进行扩增。正向引物 8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，荧光标记FAM™；反向引物 1492R：5'-GYTACCTTGTTACGACTT-3'，荧光标记CY3。使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段纯化回收。纯化后的PCR产物经过Hha I和Msp I双酶切消化后在ABI3100遗传分析仪上进行测序，得到的T-RFLP图谱用GeneScan version3.7软件进行分析。
1.4数据分析方法 实验数据利用SPSS19.0统计软件分析处理，健康人和鼻咽癌患者的T-RFs丰度的比较采用两样本均数t检验，当P值<0.05差异具有统计学意义。通过BI0-DAP程序计算菌群结构的多样性参数：香农指数（Shannon index H）、辛普森多样性指数（Simpson index D）、均匀度指数（Eveness index E）。
2 结果
2.1 健康者与鼻咽癌患者的鼻咽部细菌群落在构成和丰度上均有显著差异
研究结果显示，9例健康志愿者共获取82种不同T-RFs片段，其中有27种TR-F片段的相对丰度>1 %，可视为优势片段，而相对丰度在前5名的优势菌属在各个健康志愿者中均能检测出，它们分别为：T-RF 119（9.5%）、T-RF 152（4.4%）、T-RF 235（6.4%）、T-RF 400（18.4%）；鼻咽癌患者共获取91种T-RFs片段，共有22种优势片段，前5位优势片段为T-RF 62（7.8%）、T-RF 77（6.5%）、T-RF 146（6.1%）、T-RF 333（6.3%）、T-RF 400（11.9%），并在各个鼻咽癌患者中均能检出。对比健康人与鼻咽癌患者的T-RFs丰度，利用两样本均数比较的t检验分析，发现两组间存在明显差异（t值=3.50；P值=0.17），差异具有统计学意义，说明鼻咽癌患者的的丰度明显高于健康者。
2.2 鼻咽癌患者鼻咽部菌群的多样化参数均低于健康者
根据T-RFLP图谱中末端限制性片段的数目及其相对峰面积，分别计算健康人与鼻咽癌患者鼻咽部菌群的多样性指数。如表2所示，鼻咽癌患者的香农指数、辛普森指数、均匀度指数均低于健康人，说明与健康人的鼻咽部菌群结构作对比，鼻咽癌患者的菌属种类明显增多（9.9%），但优势菌群减少（18.5%），菌群结构的多样化程度下降（6%），物种分布均匀度较差（8.4%）。
3 讨论
鼻咽部是联系鼻、耳、口、呼吸道的枢纽位置，其腔内适宜的温度、湿度以及周围结构的复杂性，为各种细菌的生长、繁殖和定居提供了适宜的环境，成为众多微生物定植的主要部位，并具备较高的微生物群落多样性。一般情况下人体鼻咽部的微生物不致病，在受各种因素影响下固有细菌群落出现丰度和密度的波动、均势遭到破坏时，机体便可罹患各种感染性疾病、过敏性疾病，甚至肿瘤[15]。
本研究通过基于原核细胞16S rRNA 基因的T-RFLP技术分别对9例健康人与7例鼻咽癌患者鼻咽部菌群结构的分布及多样化程度进行分析，发现两者的优势菌群分布及T-RFs数目均明显不同，这与江青山[9]、陈弈霞[10]等人的研究中发现鼻咽癌患者与健康人细菌分布不同结论一致。目前，鼻咽癌的病因机制仍存在许多未知领域，但我们的研究结果在某种程度上提示了鼻咽癌与微生物菌群结构的改变存在某种关联。
关于菌群在癌症的发生及发展中所表现的作用机制，被广泛认可的最早学说是慢性炎症与癌症的患病风险相关。这一假说是由Virchow[11]在1863年提出，并陆续有研究证明，持续性的炎症反应是肿瘤发展的一个不可忽视的前提，其促进粘附在细菌表面的细胞破损，使发生炎症的黏膜逐步演变为低度不典型增生，并最终导致肿瘤的发生[12]。该假说在Liu S、Sun X等人[13]的动物模型研究及Newton K[14]等人的研究中得到进一步证实。可以说，炎性信号通路可作为由病原体引发的炎性反应与肿瘤之间重要的关联[13]。也有学者提出不同观点，认为菌群的代谢紊乱可导致癌症发生。当人体局部菌群失调时可导致该组织器官代谢功能紊乱，破坏其微生态环境的稳定状态，进而可能引起某些致癌物的合成或激活，或减少有益物质的生产，导致癌症的发生[16]。Zhu等人[17]在研究结直肠癌大鼠模型的肠道菌群中发现，产生丁酸盐（一种来源于肠道共生菌群的有益短链脂肪酸，可导致多种肿瘤细胞的凋亡）的细菌显著减少，从而使其抑癌作用下降。
尽管我们的研究表明了鼻咽癌患者鼻咽部的菌群种类、数目、细菌菌群结构多样化程度均发生了明显的改变，而且以T-RF 62、T-RF 77、T-RF 146、T-RF 333、T-RF 400为代表的优势菌群可能与鼻咽癌有某种密切关联。但由于T-RFLP技术主要应用于菌群结构的研究，尚不能对与鼻咽癌密切关联的菌属种类定性分类，而有关于哪些类群的细菌诱发了鼻咽癌的发生，亦或是鼻咽部肿瘤的生长利于这些细菌类种的定植尚不能定论，因此还需我们结合其它分子生物学实验技术完善实验方法及进一步的动物性实验和前瞻性研究。
4. 结论
健康人与鼻咽癌患者在鼻咽部的菌群构成和丰度存在明显差异；T-RF 62、T-RF 77、T-RF 146、T-RF 333、T-RF 400所代表的优势菌群可能与鼻咽癌相关；与健康人相比，鼻咽癌患者的菌属种类明显增多，但优势菌群减少，菌群结构的多样化程度下降，物种分布均匀度较差。
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论文作者:陈静珊,黄婷婷,何峰,张勇
论文发表刊物:《航空军医》2016年第7期
论文发表时间:2016/6/22
标签：鼻咽癌论文; 鼻咽论文; 患者论文; 健康论文; 细菌论文; 结构论文; 指数论文; 《航空军医》2016年第7期论文;