【基金项目】2016TZC-S-14-3；课题编号：2016KTZDSF01-03-03。
【摘要】目的：建立TSG冻干粉针剂中二苯乙烯苷含量测定方法。方法：建立HPLC法测定TSG冻干粉针剂中二苯乙烯苷含量测定标准曲线，通过精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验对标准曲线进行验证。结果：二苯乙烯苷进样量在0.05～0.25μg范围内，线性关系良好，r=0.9994。结论：该方法精密度高，专属性好，可用于TSG冻干粉针剂中二苯乙烯苷含量测定。
【关键词】冻干粉针剂，二苯乙烯苷，高效液相，含量测定
引言：
我国糖尿病肾病（ DiabetienePhroPathy，DN）的发生率约为43.7％，是慢性肾功能衰竭的主要诱因[1-2]。DN病程呈动态发展，发病机制复杂，病程中临床表现变化大，治疗困难。目前研究表明，糖代谢紊乱引起的氧化应激水平激升是DN的重要致病因素[3]。课题组前期研究证实：蓼科植物何首乌中单体成份2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-o-β-D-葡萄糖苷（简称二苯乙烯苷，2,3,5,4'-t etrahydroxy-stilbene-2-O-β- D-glucoside，TSG）具有强抗氧化应激活性[4]，对实验性DN大鼠治疗作用显著。依据氧化应激致DN理论，以提高不断扩增的DN发病人群生活质量为目标，课题组研发了TSG冻干粉针剂。针对约5000万DN患者缺乏专科高效低毒治疗药物的实际，以TSG为原料药，开发和创制高效低毒治疗DN创新药物，填补国内外该领域空白。为保证制剂的质量标准和稳定性，建立质控标准，课题组建立了TSG冻干粉针剂中TSG含量的高效液相（HPLC）检测方法。
1 材料
1.1 主要试剂和材料
乙腈，分析纯，韩国SK化工有限公司
乙醇，分析纯，韩国SK化工有限公司
去离子水，自制
二苯乙烯苷标准品（由中国食品药品检定研究院提供，批号：110844-201512）
TSG冻干粉针剂
1.2 主要仪器
高效液相色谱仪，型号LC-20A，日本岛津公司；
XB-C18色谱柱，编号：GAS46250BIO1556,Unimicro, Technologies,Inc.
2 实验方法
2.1 色谱条件
XB-C18色谱柱：4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈-水=35:60；检测波长：320nm；流速：0.95mL/min；柱温：21℃；进样量：10μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取5.625mg二苯乙烯苷对照品置25mL容量瓶中，加稀乙醇定容至刻度线，振荡使二苯乙烯苷充分溶解，摇匀，得0.2380mg?mL-1二苯乙烯苷对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取5.050mg二苯乙烯苷供试品置25mL容量瓶中，加稀乙醇定容至刻度线，振荡使二苯乙烯苷充分溶解，摇匀，得0.162mg?mL-1二苯乙烯苷供试品溶液。
3结果
3.1 线性关系考察
精密吸取4mL、3mL、2mL、1mL二苯乙烯苷对照品溶液，稀乙醇定容至5mL，得0.1904 mg?mL-1、0.1428mg?mL-1、0.0952mg?mL-1、0.0476mg?mL-1二苯乙烯苷溶液，0.45?m微孔滤膜滤过，各进样10μL，测定峰面积，以峰面积对进样浓度进行线性回归。绘制标准曲线，计算回归方程。计算得到的回归方程为：y=32899840x+123968，r=0.9994，线性范围：0.05-0.25mg/Ml(图1)
图1 标准曲线
3.2 精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液，按本文“2.1色谱条件”重复测定5次，记录每次峰面积，计算二苯乙烯苷峰面积的RSD值，得到RSD为0.29%，结果表明仪器精密度良好（表1）。
表1 精密度实验结果
3.4 重复性实验
精密吸取同批样品共5份，按“2.2.2供试品溶液的制备”方法平行制备5份供试品溶液，并按2.1色谱条件”进样进行测定，记录二苯乙烯苷的峰面积。计算RSD为0.26%，结果表明该方法的重复性良好（表3）。
表3 重复性实验结果
4 讨论
DN是糖尿病的严重并发症，是糖尿病的主要死亡原因，其发生发展与多种因素有关。大量研究表明：糖尿病肾病病程中，机体内高血糖导致组织及细胞内氧化应激水平升高、非酶的糖基化蛋白和葡萄糖的自身氧化增加，导致肾单位损伤，引发肾脏功能障碍，最终导致肾脏功能衰竭。TSG现有研究证实其具有修复血管损伤、抗炎等药理活性，对糖尿病肾病有显著的防治作用。二苯乙烯苷原料药的基源系何首乌，该原料药是我国大宗，常用中药材，资源丰富，价格便宜。有望用于所有患者，有效改善500万DN患者生活质量。
二苯乙烯苷冻干粉针剂以复溶解性好，活性成分损失少和易于长期保存的特点确保了TSG的安全性，稳定性，和有效性。提高药物在体内的血药浓度并有效的保持了血药浓度维持，使二苯乙烯苷的强抗氧化应激作用发挥到最大效益。冷冻干燥法制备的二苯乙烯苷冻干粉针剂质量优良，有利于临床应用，可用于工厂大规模生产，为千百万DN患者带来康复的希望，并产生巨大社会和经济效益。为检验TSG冻干粉针剂中二苯乙烯苷含量，本实验建立了高效液相检测方法。HPLC 法测定简便，准确，快速，线性关系好，可用于制剂质量控制。由此可见TSG冻干粉针剂可成为高效低毒治疗DN的创新药物，有利于减轻国家和DA治疗带来的诸多潜在危害填补国内外该领域空白，为惠及民生、稳定社会、促进和发展医药成业做出重大贡献。
专属性试验检测波长的选择：取二苯乙烯苷对照品溶液适量，在210～450 nm间扫描测定。结果二苯乙烯苷在320 nm处有最大吸收。所以选择320nm作为二苯乙烯苷的检测波长。
柱温的选择[5]：研究发现，柱温的不同对待测成分和杂质峰的分离度有一定的影响，分别考察20，25，30，35，40，45摄氏度的柱温对色谱分离的影响。一般情况下，随柱温的升高二苯乙烯苷与杂质的分离度下降。实际检验中应根据样品分离情况在20～4O度范围内选择适宜的柱温。
参考文献：
[1]李林峰,陈杏梅. 慢性肾功能衰竭538例病因分析[J]. 现代诊断与治疗,2015,04:872-873.
[2]王宗谦,尹丽,张思晴. 慢性肾功能衰竭937例病因分析[J]. 中国实用内科杂志,2013,01:58-61.
[3]沈玥,严玉澄. 氧化应激与糖尿病肾病[J]. 上海医学,2012,09:800-803.
[4]吕丽爽. 何首乌中二苯乙烯苷的体外抗氧化研究[J]. 食品科学,2007,01:313-317.
[5]梁丽谊,罗伟良. HPLC测定心通口服液中二苯乙烯苷的含量[J]. 今日药学,2016,01:39-41.
作者简介：
张士玉，辽宁丹东人，中国人民解放军第四军医大学药学本科生。
通讯作者：周暄宣
论文作者:张士玉,杨倩,毕琳琳,谢艳华,孙纪元,周暄宣*,
论文发表刊物:《中医杂志》2016年12月
论文发表时间:2017/6/1
标签：苯乙烯论文; 溶液论文; 冻干论文; 高效论文; 粉针剂论文; 精密论文; 色谱论文; 《中医杂志》2016年12月论文;