湖南中医药高等专科学校附属第一医院（湖南省直中医医院） 湖南株洲 412000
Validation method for the microbial limits test of Quyuxiaozhong Heji
LONG Huanzhou HU Xuelai
（The First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical College（Hunan Provincial Hospital Of Traditional Chinese Medicine），Zhuzhou，Hunan 412000）
【摘 要】目的：建立祛瘀消肿合剂的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版一部附录微生物限度检查法验证的要求对祛瘀消肿合剂微生物限度检查进行了方法建立和验证研究。供试液制备采用稀释法，制成1∶10供试液。采用培养基稀释法（1∶10供试液，每皿1 mL）进行细菌计数检验，稀释法（1∶10供试液，每皿1 mL）进行霉菌及酵母菌计数检验，采用常规法进行控制菌检查。结果：5种验证菌株的回收率均高于70%；控制菌检查经方法验证，可按常规法进行大肠埃希菌检查。结论：建立的方法准确、可靠、重现性好，适用于祛瘀消肿合剂的微生物限度检查。
【关键词】祛瘀消肿合剂；微生物限度；方法验证
祛瘀消肿合剂是由细辛、独活、赤芍、红花等10味中药组成的医院自制制剂。功能祛瘀活血，通络消肿止痛。用于跌打损伤，血瘀气滞之肿痛症。按《中国药典2010年版一部》[1]要求，需做细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查，同时需对检验方法进行验证，以确保检验方法的准确可靠。
1 试验材料
1.1 仪器 净化工作台、全自动压力蒸汽消毒器、恒温水浴锅、TP-320A电子天平（感量0.01g）、恒温培养箱、生化培养箱
锥形瓶（100～150mL）、平皿（90mm）、量筒（100mL）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1mL分度0．01mL，10mL分度0.1mL）均于180℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。
1.2 试验样品 祛瘀消肿合剂 厂家：湖南中医药高等专科学校附属第一医院，批号：150108，150429，140927。
1.3 实验菌株 金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501、白色念珠菌CMCC（B）98001、黑曲霉CMCC（F）98003均购自中国医学细菌保藏中心。
1.4 培养基 营养琼脂培养基（批号：140625）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：141203）、改良马丁培养基（批号：140527）、改良马丁琼脂培养基（批号：140708）、营养肉汤培养基（批号：140614）、胆盐乳糖培养基（批号：141115）（均由北京路桥技术有限公司生产）：MUG培养基（批号：201404233）（由广东环凯微生物科技有限公生产）
1.5 试剂及稀释剂 pH7.0的无菌氯化钠一蛋白胨缓冲溶液（批号：140216，由北京路桥技术有限公司生产），0.9％灭菌氯化钠溶液、靛基质试液。
2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证[2][3]
验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
2.1 方法
2.1.1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤中，在30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，在25℃培养24～48小时。上述培养物均用0．9％灭菌氯化钠溶液制成每1m L含菌数为50～100CFU的菌悬液，备用。
2.1.2 供试液制备 分别取供试品各1OmL，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液至100mL，制成1：10的均匀供试液，备用。
2.1.3 试验组 细菌计数采用常规法。取1：10的供试液1mL，置平皿中，每个平皿加试验菌液1mL，加入营养琼脂培养基15～20mL，平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在30～35℃温度培养48小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。
霉菌和酵母菌计数采用常规法，取1：10的供试液1mL，置平皿中，每个平皿加试验菌液1mL，加入玫瑰红钠琼脂培养基1 5～20mL，平行制备2个平皿，放冷，倒置平板，在25℃温度培养72小时，观察结果。按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。
2.1.4 菌液组 分别取50～100CFU／mL的试验菌液1mL注入平皿中，立即倾注培养基，平行制备2个平皿，置适宜温度培养48～72小时，观察结果，按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定菌数。
2.1.5 供试品对照组 按《中国药典2010年版一部》微生物限度菌落计数方法测定本品的本底数。采用常规法检查细菌数、霉菌及酵母菌数。
2.1.6 稀释剂对照组 取pH7．O无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL代替供试液，余下同试验组。
2.2 菌回收率试验 验证试验进行三次独立的平行试验，并分别计算各次试验的菌回收率。
2.3 结果判断 试验组及对照组的菌回收率均应不低于 70％。
2.4 实验结果 经试验验证，各试验菌株及稀释剂对照组菌回收率均大于70%，符合《中国药典2010年版一部》要求，结果见表1。
3 控制菌检查方法的验证[2][3]
本品为口服给药制剂，因此以大肠埃希菌作为验证菌株，检查大肠埃希菌，以金黄色葡萄球菌为阴性对照菌株。
菌液：取细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证中的50～100CFU/mL的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液。
3.1 大肠埃希菌
3.1.1 试验组 取1：10的供试液10mL以及50～100CFU／1mL的大肠埃希菌菌液1mL接种至100m1胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。
3.1.2 阳性对照组 取50～100CFU/mL的大肠埃希菌菌液1mL接种至1OOmL胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。
3.1.3 阴性菌对照组 取1：10的供试液1OmL及50～100CFU／mL的金黄色葡萄球菌悬液1mL接种至100mL的胆盐乳糖培养基中，在35℃培养18～24小时。
3.1.4 结果判断 取上述培养物0.2mL，接种至含5mLMUG培养基的试管内，培养于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后沿培养基的管壁加入数靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性：呈试剂本色，为靛基质阴性。
3.1.5 实验结果 大肠埃希菌检查法采用常规法检查，阳性对照菌能正常生长，阴性对照菌未检出。结果见表2
4 试验结论
上述试验表明：本品采用常规法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、白色念珠菌生长均无影响。其试验组、稀释剂对照组回收率均达70％以上，同时按常规法对大肠埃希菌进行了验证试验，符合《中国药典2010年版一部》微生物限度检查验证试验要求。以此确定本品微生物限度检查法如下：取本品10mL加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL制成1：10供试液。采取常规法检查细菌数、霉菌和酵母菌数，采用常规法检查大肠埃希菌。
参考文献：
1 中国药典 [S].2010版.一部.附录 ⅩⅢ C：79.
2 李国成，刘春霞，余晓霞.祛痰合剂的微生物限度检查方法验证[J]，中国医院药学杂，2011（03）
3 杨静.药品微生物限度检查法的影响因素分析[J].中国药事.2008（12）
论文作者:龙欢周,胡雪来
论文发表刊物:《中国蒙医药》2016年9月第9期
论文发表时间:2017/1/17
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