李玲1通讯作者 李琼灿1 王云姣2 莫雪莹2
1长沙市中心医院麻醉科 湖南长沙 410004；2湘雅医院麻醉科 湖南长沙 410004
【摘 要】目的 研究无创性远端肢体缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的影响。方法 30只雄性SD大鼠（250-300g）随机分成3组（n=10），假手术组（Sham组）：不进行大脑中动脉梗阻；缺血再灌注组（I/R组）：采用大脑中动脉梗阻（MCAO）法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型；无创远端肢体缺血后处理组（NRIPoC组）：在大脑中动脉缺血90min，再灌注即刻行无创远端肢体缺血5min，再灌注5min，反复3次。再灌注24h后对所有动物行神经功能学评分（NDS），然后取脑TTC染色测定脑梗死容积；HE染色观察脑组织形态；Nissl染色测定存活的神经细胞。结果 NRIPoC组较IR组24h NDS评分降低，但无显著差异（P>0.05），脑梗死容积百分比显著减少（P<0.05），缺血侧皮层半影区存活的神经元数量显著增加（P<0.05），且半影区神经细胞层次较为清楚，形态较为完整，间质水肿减轻。结论 无创远端肢体缺血后处理可减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。
【关键词】肢体；缺血后处理；缺血再灌注损失；无创
【Abstract】 Objective To observe the protective effects of noninvasive limb remote ischemic postconditioning against ischemic-reperfusion injury in MACO rats.Methods Thirty adult male Sprague-Dawley rats were divided randomly into three groups（n=10，each）：Sham group，I/R goup and NRIPoC group.The rats in Sham group only were isolated the vessels.The rats in I/R and NRIPoC group were received right middle cerebral artery occlusion（MCAO），and the rats in NRIPoC group were accepted 3 cycles of 5 minutes reperfusion followed by 5 minutes ischemia on right hind limb at the beginning of reperfusion in middle cerebral artery.At 24h after cerebral reperfusion，the neurologic deficit scores（NDS）of the rats in three groups were evaluated by the methods of Longa’s.Five rats of each were then killed to measure their cerebral infarct size by TTC staining；and another five rats were randomly selected to observe the tissue morphology by HE staining，detect the survival nerve cells by Nissl staining.Results The NDS in NRIPoC group was lower than that in I/R group，but there was no significant difference between two groups（P>0.05）.The brain infarction volume in NRIPoC group decreased significantly than that in I/R group（P<0.05）.The neurons in penumbra cortex in NRIPoC group were more clear and integrated than that in I/R group.Contrarily，the quantity of neurons was also more but the interstitial edema were alleviative in penumbra cortex in NRIPoC group.The number of survival neurons of penumbra cortex in NRIPoC group increased significantly compared with that in I/R group（P<0.05）.Conclusion：Noninvasive limb remote ischemic postconditioning may have protective effects against cerebral I/R injury.
【Keywords】Limb；Ischemic postconditioning；Cerebral ischemic reperfusion，；Noninvasive
‘脑血管性疾病、严重的颅脑外伤以及大型手术等都可能引起全脑或局部脑组织缺血，而血液再灌注往往会导致脑组织发生缺血再灌注损伤，因此探寻有效的脑保护方法具有重要意义。目前远端缺血后处理尤其是肢体后处理在临床心肌保护中已做了广泛研究，并取得了不少研究成果，但其对脑保护的研究则刚起步，而且现有的肢体后处理方法是直接分离动脉并将其夹闭，显然这种有创的方法不适于临床应用[1]。此外已有文献证实无创性远端肢体缺血预处理具有脑保护作用，但由于围术期急性脑缺血事件的不可预知性，预处理的临床应用鲜有实施。因此本文拟研究无创性远端肢体后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响，以期找到一种有效的、适合于临床应用的脑保护方法。
材料与方法
实验动物及分组 健康成年雄性SD大鼠，体重250-300g（中南大学动物实验中心提供）。随机分为3组，每组10只，假手术组（Sham组）：暴露并分离颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，不进行结扎及置入栓线，缝合伤口后观察24h；缺血再灌注组（I/R组）：建立大脑中动脉梗阻（MCAO）模型，大脑中动脉缺血90min，再灌注24h；无创远端缺血后处理组（NRIPoC组）：建立MCAO模型，大脑中动脉缺血90min，大脑中动脉再灌注同时行肢体远端缺血5min，再灌注5min，反复3次。
MCAO模型 大鼠腹腔注射10%的水合氯醛300mg/kg麻醉，仰卧位固定。参照Longa[8]的线栓法制备取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉。结扎右颈总动脉近心端及颈外动脉，动脉夹夹闭颈内动脉，于颈总动脉分叉下方约2mm处剪一小口，将头端已烧制成球形的尼龙栓线（北京沙东公司，中国）置入颈内动脉约18-20mm，结扎颈总动脉远心端。右侧大脑中动脉阻闭90 min后拔出尼龙线10mm，恢复再灌注。假手术组操作同上，仅分离血管，不置入栓线。术中和术后用白炽灯照射大鼠保暖，以保持直肠温度在37.0±0.5℃。
无创远端肢体缺血后处理方法 采用改良的无创血压袖带套住大鼠右后肢根部，脉搏传感器置于足背动脉处。当NRIPoC组大鼠建立MCAO模型缺血90min再灌注即刻，启动动物无创血压持续充气，连续监测脉搏，以脉搏波消失、肢体远端体温下降、皮肤发绀，作为阻断股动脉标志。五分钟后释放血压袖带的压力，脉搏感应器感应有脉搏，体温回升、皮肤潮红，提示肢体恢复血液灌注，持续五分钟；反复三次[2]。
再灌注24h后，参照Longa[8]的方法进行5分制神经功能缺陷评分（Neurologic deficit scores，NDS）。随后，每组随机取5只，用水合氯醛深麻醉后迅速断头取脑，放入-20℃冰箱内速冻20min，将小脑、低位脑干及嗅球去除，并将脑组织由前向后切成厚2mm的冠状切片，完全浸入1%2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）溶液中，放入37℃温箱中避光孵育30min，放入4%多聚甲醛固定24小时。用数码相机（Canon，日本）照相，照片输入计算机（其中白色部分为梗死区，红色部分为正常脑组织），采用图像处理软件（Imagepro plus 6.0），根据公式v=t×（Al+…+An）计算脑梗死容积（其中t为脑片厚度，A为梗死面积），即脑梗死容积%=脑梗死灶总容积/全脑总容积×100%。各组余下的5只大鼠，麻醉后进行灌注取脑，将脑置于4%多聚甲醛后固定24小时。在脑组织视交叉及其后4mm处做冠状切片，取下中间组织修整以便进行组织脱水包埋。用切片机行连续冠状切片（厚度5μm）。置37℃温箱中过夜烤干，用于HE染色及Nissl染色。
统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计学分析。神经功能缺陷评分组间采用Kruskal-Wallis秩和检验比较，用中位数（最小值~最大值）表示，其余实验计量数据以均数±标准差（ ±s）表示，正态分布的计量数据方差齐时，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD及SNK-q检验；方差不齐时，组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果：
NDS评分 Sham组NDS评分为0；与I/R组大鼠NDS评分相比，NRIPoC组大鼠NDS评分中位数下降，但二者无显著性差异（P>0.05），见表1。
讨论
远端缺血处理是近年来脑保护研究中的热点。Ren等在大鼠局灶性脑缺血模型中采用有创的方法证实了肢体远端缺血预处理及远端缺血后处理具有脑保护作用，而新近的研究表明无创远端肢体缺血预处理同样具有脑保护作用。在此基础上，本文采用MCAO建立局灶性脑缺血再灌注模型，利用无创血压袖带对模型实施无创远端肢体缺血后处理，再灌注24小时后采用Longa法进行神经功能学评分，TTC法观察脑梗死面积及形态学方法来研究无创远端肢体缺血后处理是否具有脑保护作用。
研究结果显示，NRIPoC组较于IR组脑梗死容积百分比显著减少，缺血侧皮层半影区存活的神经元数显著增加，且半影区神经细胞层次较为清楚，形态较为完整，间质水肿减轻，表明无创远端肢体缺血后处理对缺血再灌注大脑具有保护作用[4]。值得注意的是，NDS评分中，IR组和NRIPoC组未见显著差别，可能与我们所做的样本数偏少或者与采用的神经功能缺陷评分标准分的过于简单有关。
关于远端缺血后处理的作用机制目前尚不清楚，一般认为是一个器官的缺血和再灌的过程中释放了某些生化递质到循环中，或者是激活了某些神经通路，释放了一些具有保护作用的递质，从而实现对远端器官的保护。从远端缺血预处理机制的初步研究中发现，腺苷、NO、TNF-α、阿片类药物、缓激肽、蛋白激酶C（PKC）、降钙素基因相关肽（CGRP）、环加氧酶、KATP通路、辣椒素、热休克蛋白（HSP）、去甲肾上腺素等物质可在应激后释放，并通过神经及体液途径对器官产生保护作用[5]。Lim等的研究表明在经远端肢体缺血预处理的小鼠模型中，切除股神经和坐骨神经中的任何一根神经，保护作用被部分阻断。Breivik等证实心肌经缺血预处理，冠状动脉中含有一种疏水性的心肌保护因子，且通过PI3K/AKt通路实现心肌保护作用。但这些仅为远端缺血预处理中的初步研究，尚未完全阐明远端缺血预处理的作用机制，更不能说明远端缺血后处理脑保护的原理。
本文虽首次证实了无创远端肢体缺血后处理具有脑保护作用，但这种保护强度与有创性远端肢体后处理相比或者与无创远端肢体缺血预处理相比有无差异，甚至与原位缺血处理相比较，其保护作用是否有所减弱，则需要进一步的研究，同时无创远端肢体缺血后处理的远期效果亦需要进一步观察。
综上所述，本研究证实了无创性肢体远端缺血后处理能够通过减轻局灶性脑缺血再灌注损伤，减少脑梗死面积，降低神经细胞的凋亡而起到脑保护作用，但这种作用的机制及远期效果还需要更深入的研究。
参考文献：
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[5]梁永会，陈平，韩继媛.缺血后处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的作用[J].临床急诊杂志.2012，6（02）：441-442.
论文作者:李玲1通讯作者,李琼灿1,王云姣2,莫雪莹2
论文发表刊物:《航空军医》2016年第1期供稿
论文发表时间:2016/4/13
标签：远端论文; 肢体论文; 动脉论文; 后处理论文; 大鼠论文; 作用论文; 脑中论文; 《航空军医》2016年第1期供稿论文;