王小燕[1]2003年在《干细胞和胶原蛋白结构性质的AFM研究》文中研究说明运用原子力显微镜(AFM)和扫描电子显微镜(SEM)这两种技术对BALB/c小鼠胚胎干细胞的细胞膜表面进行了观测，同时运用透射电子显微镜(TEM)，通过制作超薄切片对BALB/c小鼠胚胎干细胞的内部结构进行观测，得到BALB/c小鼠胚胎干细胞的形态学特征。同时将叁种技术进行比较，结果显示各有所长，应将这种新的技术(AFM)与传统技术(SEM与TEM)综合利用，互相补充。 利用AFM观测正常的CD34~+造血干细胞，得到了单个造血干细胞以及膜表面超微结构的AFM图像，同时应用AFM测定正常人终末分化细胞红细胞的细胞膜表面超微结构，通过五个参数(Rp-v、Median height、Mean height、R_(rms)及R_a)定量比较造血干细胞与红细胞膜的特征，通过形态学的比较为进一步认识多能造血干细胞演变为终末血细胞的过程提供实验依据。 利用AFM研究不同种属Ⅰ型胶原蛋白聚集行为的差别，结果发现相同实验条件下同型胶原蛋白溶液中，胶原蛋白分子的聚合方式有所区别。来源不同，胶原蛋白分子聚集形成的胶原纤维在微观结构上有较大的差异，本实验结果对于胶原制品的开发及改善胶原制品的性能具有一定的参考意义。 以胶原蛋白为研究对象，对NSOM的成像条件进行摸索，通过对比实验说明探针的质量及定位系统对图像质量的影响。得到了自组装后胶原蛋白的不同扫描范围的透射模式近场光学像以及反射模式近场光学像。将NSOM技术与AFM技术进行了对比。
赵涛[2]2003年在《胶原蛋白自组装行为以及细胞形态的AFM研究》文中认为对原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)的成像技术进行了多方面探索；用AFM研究胶原蛋白分子在云母表面的吸附和自组装行为；对小鼠胚胎干细胞和人血红细胞进行AFM成像，观测单个细胞的形态以及细胞膜的微观结构；利用AFM得到了小鼠胚胎干细胞超薄切片的高分辨率图像，探索用AFM研究细胞内部结构，拓展其应用领域；天花粉蛋白(TCS)和红细胞的相互作用，利用AFM观察到天花粉蛋白(TCS)和红细胞相互作用前后红细胞膜超微结构的变化，据此讨论了二者的作用机理。 测量了四种AFM常用基片的表面粗糙度，探索并总结了用于AFM观测的生物样品的制备方法。结果发现，对于生物大分子(如胶原蛋白)，使用经MgCl2处理后的云母做基底，成像效果最好。对于细胞，使用普通玻片做基底，能使样品较好地固定，从而得到稳定的AFM图像。通过AFM针尖对胶原蛋白样品损伤作用的研究，探索用AFM研究生物大分子的成像技术。 利用AFM技术研究来自小牛皮肤的Ⅰ型胶原蛋白溶液在用镁离子处理过的云母表面的吸附和自组装行为。改变胶原蛋白溶液的浓度和pH值，研究不同条件下胶原蛋白分子的自组装行为，利用AFM的高分辨率，在纳米范围内直接观察胶原分子在云母表面的自组装的情况。 用AFM观测小鼠胚胎干细胞的超薄切片，得到了高分辨的小鼠胚胎干细胞内部超微结构的AFM图像。本实验结果表明，AFM技术如与超薄切片技术相结合，可对样品的内部结构进行研究，而不仅仅是一种表面成像工具。 对红细胞进行成像，观察到红细胞双面凹的典型特征，小范围扫描观察到了红细胞膜表面的超微结构，在此基础上研究了红细胞与天花粉蛋白作用后红细胞膜表面超微结构的变化，并对二者作用的机理进行了分析讨论。
朱杰[3]2010年在《心肌纤维与Ⅰ型胶原纤维的超微结构及生物力学特性研究》文中研究表明肌节周期性的收缩力可经由近邻的胞外基质和心肌纤维传导至整个心脏组织,从而迫使心脏壁收缩并将血液压出心室,是心脏搏动的原动力。肌纤维和胶原纤维超微结构及生物力学特性的病理性变化往往会影响纤维对外界刺激信号的应答,从而影响心脏搏动的规律性,造成心脏功能紊乱。而胶原蛋白纤维是肌内膜的主要成分,要深入研究心肌纤维的功能,还必须研究心肌外层的胶原纤维膜的超分子结构与力学特性,这些信息将有助于人们更好地了解胶原蛋白结构影响肌细胞-肌细胞、肌细胞-基质通讯的途径,以及胶原蛋白在心肌组织生长、发育、病变和修复/再生过程中所起的作用,为临床治疗提供科学依据。本研究以肌纤维和胶原纤维为主要研究对象,采用原子力显微镜高分辨成像和纳米压痕技术,研究了牛心心肌纤维、昆虫飞行肌纤维、鼠尾肌腱胶原蛋白纤维在不同生理状态的表面超微结构、压弹性和粘弹性,尝试找到肌纤维收缩过程中肌节长度、纤维直径等参数之间的关系;找到抗I型胶原蛋白抗体在胶原蛋白纤维上的结合位点并得到二者之间的特异性作用力;从而建立心肌纤维和胶原蛋白纤维的超微结构、力学特性和生理状态之间的内在联系。通过研究,获得了以下主要进展:(1)不同生理状态下,牛心肌纤维的肌节长度大致在1.22μm~1.33μm,其中松弛状态的肌节长度相对于僵直态有大约9%的增长,该结果提示,肌动蛋白和肌球蛋白会随着生理条件的变化而不断交替形成横桥,从而形成力学传导以应对外界环境的变化和信号刺激;与位置相关的压弹性曲线与AFM高度图的剖面曲线在外形上具有很高的相似性,相邻最大弹性系数点之间的距离与剖面分析得到的肌节长度非常接近,该结果显示了肌节的空间周期性和力学周期性的统一;源于AFM研究的肌纤维结构和弹性参数将会推动人们对生物结构、生物力学和生理功能之间关系的认识,为心脏疾病的基础研究和临床治疗提供更多的线索。(2)飞行肌肌原纤维在僵直态、松弛态和叁种活化态的肌节长度分别为:2.10±0.05μm(僵直态)、3.10±0.10μm(松弛态)、2.50±0.15μm(活化态, 2mM Ca2+)、2.60±0.25μm(活化态, 5mM Ca2+)和2.55±0.15μm(活化态, 10mM Ca2+),并得到得到5mM Ca2+浓度为合适的肌纤维活化浓度;另外,不论飞行肌纤维处于什么生理状态,A带的长度始终保持在1.50μm左右,而I带的长度则有较大的变化(0.7μm~1.6μm),该现象符合肌动蛋白纤维与肌球蛋白纤维在重迭区相对滑移的力学和空间结构模型。AFM高度图剖面分析的结果显示,不同生理状态下,肌原纤维内部肌动蛋白粗纤维之间的最小距离分别为53nm(松弛态)、58.5nm(僵直态)、56.7nm(活化态, 2mMCa2+)、54.8nm(活化态, 5mM Ca2+)和55.6nm(活化态, 10mM Ca2+),进而结合同根纤维的肌节长度变化建立了肌纤维的钙离子诱导等体积伸缩模型;根据沿肌球蛋白纤维纵向的剖面曲线分析图,找到了横桥在肌球蛋白纤维表面的位置及其周期性间距为37.5±0.5nm;另外,在同一生理状态下,肌原纤维的弹性系数和杨氏模量的大小关系满足:Z线>M线>重迭区>I带;同一肌节位置在不同活化态下的弹性系数和杨氏模量的大小关系基本满足:活化态(5mM Ca2+)>活化态(2mM Ca2+)>活化态(10mM Ca2+)。(3)固定在云母片上的胶原纤维在空气中自然干燥时,胶原纤维的D单元长度在干燥的过程中并无显着变化,基本稳定在66.67nm;而间隙带的深度则有一定的增加,从4.4nm逐渐增加到4.7nm,增幅达7%;变化最为明显的则是纤维的直径,从201nm降到了187nm,减幅达到7%,尽管如此,由于D单元长度并无变化,因而该方法(样品制备和空气中成像)依然适于研究胶原纤维的纵向精细结构。文中采用抗I型胶原蛋白抗体偶联金纳米颗粒对胶原蛋白纤维成功实现了定位标记,AFM研究发现,抗体作用时间不同的纤维样品表面上的金纳米颗粒分布密度有较大差别。抗体作用时间越长,金颗粒的密度越大;其中,抗体作用时间等于2h的金纳米颗粒密度与厂家提供的标准结合密度很接近,但从实际的AFM图像质量可知,抗体作用时间为1h的金颗粒密度更适合做抗体结合位置的统计分析。以抗体作用时间为1h的样品作为研究对像的实验结果显示,与抗体结合的金颗粒主要分布在胶原纤维的重迭区,显示出抗I型胶原蛋白抗体对胶原纤维重迭区的结合特异性。(4)用未加修饰的探针对抗体结合时间不同的胶原纤维样品进行了成像,分别得到了高分辨的高度图和低分辨的摩擦图,二者分别从结构细节和总体力学特性上反映出抗体在胶原纤维上的结合位点主要集中在重迭区。而未加修饰探针的单点力学测量结果显示,胶原纤维表面结合的抗体对肌原纤维压弹性的测量几乎没有影响;但对于粘附力的收集结果却有显着的影响,特别是在重迭区,随着抗体结合时间的增加,探针与胶原纤维间的粘附力相对于探针与天然纤维样品之间的粘附力分别增加了17.8%、48.9%和82.2%,而间隙带的粘附力则保持相对稳定,说明抗体主要分布在重迭区,与前述高度图和摩擦图的结果保持一致。最后,本论文重点研究了抗体与胶原蛋白的结合力。主要用抗I型胶原蛋白抗体对探针进行了修饰,并用修饰过的探针进行探针-天然胶原纤维间的粘附力(结合力)测量,统计结果显示,单个抗I型胶原蛋白抗体与胶原纤维重迭区的结合力约等于250pN。
陈敏[4]2016年在《生物支架材料的表面化学特性对细胞生物学行为的影响》文中认为组织工程通过细胞与支架材料及可溶性因子的结合,旨在调控细胞生物学行为,重塑组织结构和功能,为组织/器官修复再生提供了有效策略。细胞在支架材料中的粘附、增殖、表达与目标组织相关的特异性功能等行为决定了最终组织工程产品的成功与否。在体内,细胞所处的微环境在调控细胞行为和组织维持/修复中发挥着重要作用,而微环境的主要组成之一就是细胞外基质。因此,构建组织工程支架材料及其表面化学特性,以模拟胞外基质特性并获得合适的细胞响应,成为组织工程研究的关键内容之一。本质上来讲,胞外基质的表面化学特性包涵两方面：其一,化学成分自身所决定的性质,如亲/疏水性、电荷特性和表面自由能等；其二,化学组份的浓度及时空分布。为了获得特定的生物材料表面化学特性,将天然的胞外基质组分或简单的化学基团引入材料表面是最为行之有效的途径和手段。本文选用聚己内酯(poly(ε-caprolactone), PCL)和聚甲基丙烯酸羟乙酯(poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA)这两种在组织工程中有着广泛应用的合成聚合物作为基底材料,分别通过引入简单化学基团和共价结合Ⅰ型胶原,并辅以一系列体外细胞培养实验,以探讨材料的表面化学特性对细胞生物学行为的影响,为未来设计和制备特定的组织工程支架材料、调控细胞生物学行为并构建更具功能的工程化组织提供科学指导。其中,通过在PCL分子中引入简单化学基团,成功构建了具有不同表面化学性质的PCL衍生聚合物薄膜,考察了间充质干细胞在该系列表面的粘附、增殖和多向分化等行为,并对比了软骨细胞表型维持、传代软骨细胞再分化以及间充质干细胞的成软骨分化对表面化学性质的特异需求。对于生物惰性的PHEMA材料,本文则采用胶原修饰的方法获得了具有不同胶原密度的材料表面,并考察了间充质干细胞的粘附、增殖和多向分化行为与该化学成分密度的相关性。首先,本文采用开环共聚法合成了一系列接有化学侧基(氨基、甲基、羧基、羟基和羰基)的PCL衍生物(分别简称为PCL-NH2、PCL-CH3、PCL-COOH、PCL-OH和PCL-C=O),并在玻片表面旋涂形成薄膜。通过对薄膜表面润湿性、表面微观形貌和血清蛋白吸附的检测,发现亲水基团(包括-NH2、-COOH、-OH和-C=O)的修饰能够降低PCL基材的疏水性,而-CH3的修饰无此影响；含有化学侧基的聚合物在成膜过程中会形成岛状拓扑结构,并提高了薄膜表面的粗糙度；薄膜表面的血清蛋白吸附能力也与其亲/疏水性呈现一定的线性相关。然后,本文将人羊膜来源的间充质干细胞(hAMSCs)接种于该系列PCL薄膜表面,考察了这些具有不同化学性质的表面对细胞粘附、增殖和多向分化等生物学行为的影响。研究发现,与未经修饰的PCL相比,PCL-NH2、PCL-COOH、PCL-OH和PCL-C=O表面促进了hAMSCs的粘附,具体表现在细胞铺展面积、焦点黏着斑和胞外基质蛋白分泌的增加,而其中的PCL-NH2和PCL-COOH薄膜表面还促进了细胞的增殖。hAMSCs在薄膜材料表面的分化行为也与基团修饰引起的表面化学特性改变相关,PCL-NH2表面支持较好的成骨分化,PCL和PCL-CH3有利于成脂肪分化,而成软骨分化则在PCL-CH3和PCL-COOH薄膜表面更为显着。以上述接有化学侧基的PCL衍生聚合物薄膜为基础,本文进一步考察了兔骨髓来源的间充质干细胞(rBMSCs)、原代兔关节软骨细胞(第一代,P1, rACs)和传代兔关节软骨细胞(P3和P5 rACs)的体外成软骨能力。研究结果显示,接有亲水性基团的薄膜表面(PCL-NH2、PCL-COOH、PCL-OH和PCL-C=O)能够促进这些细胞的粘附和增殖；在P1 rACs的长期培养(21天)过程中,GAG/DNA值在PCL-COOH表面最高,而细胞在PCL和PCL-CH3表面出现了明显的去分化现象,不但GAG/DNA值较低,而且细胞形态也从圆形向成纤维细胞样转变；P3 rACs在成软骨诱导培养基中能够重获软骨表型,而rBMSCs和P5 rACs则在细胞粘附相对较弱的PCL和PCL-CH3表面才表现出较好的成软骨分化效果,但分化水平仍远低于再分化的P3 rACs。这些结果说明,间充质干细胞的分化趋向和细胞种类对材料的表面化学特性都具有特殊的需求,因此,根据特定的细胞来源和组织类型来设计和制备合适的材料及其表面化学特性,才能成功构建特定的工程化组织。最后,本文利用1,1羰二咪唑(CDI)作为中间交联剂和不同浓度的Ⅰ型胶原溶液在PHEMA材料表面构建出一系列具有不同胶原密度的表面,并考察了人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSCs)对材料表面胶原密度的响应。对材料表面进行物化表征的结果表明,CDI处理降低了PHEMA表面的粗糙度和亲水性,经过胶原的修饰后,虽然粗糙度和表面形貌没有明显变化,但是材料表面的亲水性却随着表面胶原的增多而升高。细胞培养实验发现,PHEMA表面不具备细胞生长的条件,而CDI处理和胶原的修饰则显着促进了细胞的粘附,且随表面胶原的增多,细胞铺展面积和增殖均呈现上升趋势。高密度的胶原有利于hBMSCs勺成骨分化,而无胶原或低密度的胶原则促进了细胞向脂肪细胞和软骨细胞的分化。但是,软骨特异性胞外基质的累积还因细胞来源而异,无胶原或胶原少的表面有利于绵羊膝关节软骨细胞(oACs)累积更多的粘多糖,而软骨诱导培养后的hBMSCs则与此相反。综上所述,本文通过成功构建具有不同表面化学特征的PCL和PHEMA,利用包括间充质干细胞和软骨细胞在内的细胞,开展了对细胞的粘附、增殖、多向分化以及功能维持等细胞行为的研究,探究了细胞对基材表面化学特性的响应,发现基材表面化学性质和化学信号的浓度对细胞行为均有调节作用,并揭示了不同细胞种类对材料表面化学性质的响应具有特异性。
田冶[5]2008年在《表面功能化聚乳酸膜的构建及其细胞相容性评价》文中研究说明组织工程的核心内容之一是构建细胞与支架材料的复合体,而细胞在材料上的粘附、增殖、分化等行为主要依赖于材料的表面物理化学性质,因此不同表面性质材料的制备及其与细胞之间的相互作用就成为目前国内外研究的热点。由于材料制备方法及表面改性技术的限制,目前大多数关于材料不同表面性质对细胞行为影响的研究仍以相对较易实现功能化,但在组织工程领域应用并不广泛的材料为基底,如聚苯乙烯(PS)、石英等,而以常用的生物材料例如聚乳酸(PLA)为基底进行的研究则较少报道,而后者恰恰对组织工程的研究与开发更具有实际意义。为了探讨常用组织工程支架材料表面与细胞的相互作用,本研究以目前组织工程领域常用的PLA为基质,考察了表面具有不同物理化学性质的PLA膜对细胞生物学性能的影响,为今后研制生物相容性良好的PLA材料与细胞的复合支架探索一些理论基础和实际技能。为了较系统的研究材料表面与细胞之间的相互作用,本研究构建了一系列表面形态和化学组成功能化的PLA膜。首先是在单模微波有机合成仪中,采用有别于传统减压封管热聚合的微波聚合方式,在常压氮气保护下合成了分子量约为4.86×10~4和10.47×10~4的PLA。其次,以此为原料,采用SNS(Solvent-Non-Solvent)技术构建了微孔孔径介于1μm—20μm的PLA膜和PS膜,并以多孔PS膜为模板,制备了表面具有微岛结构的PLA膜,微孔孔径的大小以及孔密度可通过改变溶液的浓度、非溶剂组成、环境温度和溶剂的挥发速率等方法进行控制。最后采用光氧化接枝法,以过氧化氢为光氧化剂,在紫外光辐照下成功的将丙烯酸(AA)、丙烯酰胺(AAm)、丙烯酸羟乙酯(HEA)等亲水性单体接枝到PLA膜表面,从而在PLA膜表面引入了羧基、酰胺基以及羟基等基团,接触角测定显示这些极性基团的引入改善了PLA膜的亲水性,提高了材料的表面自由能。作为骨组织工程支架材料,不仅材料与骨细胞的相互作用非常重要,而且材料表面性质对矿化性能及胶原蛋白吸附的影响也非常关键,因此本论文首先系统的研究了材料表面性质对生物矿化及胶原蛋白吸附性能的影响。对PLA膜的诱导矿化性能的研究结果显示纯PLA膜表面由于缺少成核位点而不利于矿化产物的形成,小分子量的PLA由于其表面羧基密度大于高分子量的PLA而矿化沉积的产物相对较多;对于物理形貌功能化的表面,具有1μm微岛结构的PLA膜上有大量的结晶性矿化物产生,显示此结构的表面有利于促进矿化产物的沉积,而另外叁种形貌的表面均未见到有明显的结晶性矿化产物形成,其中又以20μm微孔结构的表面沉积的钙磷盐最少;对比不同基团功能化的表面,所引入的叁种极性基团由于带有负电荷,因此能够诱导大量的结晶性钙磷产物形成,X射线衍射(XRD)显示此产物为具有一定结晶性的羟基磷灰石(HA)。采用石英晶体微天平(QCM)技术探讨了PLA膜的分子量及表面基团对胶原蛋白吸附的影响。研究结果显示胶原蛋白的吸附基本符合Langmuir等温吸附方程,胶原蛋白在引入功能化基团的表面能够更快的达到吸附平衡,并有较强的吸附力;对比叁种功能化基团表面,胶原蛋白在羧基化表面的PLA膜上的吸附量最大;原子力显微镜(AFM)观察显示在小分子量PLA上吸附的胶原蛋白较少,呈弯曲状,而在较大分子量PLA上的胶原吸附量则相对较多,部分胶原蛋白形态呈直线形;在基团功能化表面,胶原蛋白在羧基化表面呈密集的网状分布,显示羧基化的表面有利于胶原蛋白的吸附。对成骨细胞在不同PLA膜表面的相容性评价显示,低分子量的PLA比高分子量PLA更有利于细胞粘附,但因前者的降解速率过快,对细胞的长期生长不利;表面具有微孔及微岛结构的PLA膜有利于细胞的粘附与铺展,但对细胞的增殖性能贡献不大。虽然细胞有贴壁的特性,但对直径小于20μm的微孔及微岛结构,细胞伪足均不会沿着孔壁及岛壁贴附生长,而是在微孔及微岛上方铺展;而对于不同表面基团的PLA膜,不论是细胞的粘附与铺展还是细胞的增殖性能都得到一定程度的改善,其中又以引入酰胺基的PLA膜的细胞相容性最好。最后,本研究还创新性的探讨了不同性质PLA膜对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化性能的影响。结果显示在诱导剂的存在下,BMSCs在纯PLA膜上均能够正常的向成骨细胞分化,而对于不同形貌的PLA膜,1μm微岛结构的表面对BMSCs分化性能的影响与纯PLA膜相似,而另外叁种形貌则不同程度的对BMSCs朝成骨细胞分化产生抑制作用;更值得注意的是,在PLA膜表面引入酰胺基不仅能够促进BMSCs的诱导分化,甚至在无诱导剂的作用下,其自身也具有一定的诱导BMSCs分化为成骨细胞的功能。
林曼萍[6]2017年在《蛋白—材料界面力及其对细胞响应力学刺激的调控作用》文中研究表明种子细胞和支架材料是器官制造和组织工程策略中的两个核心组成部分。支架力学性质和支架拉伸应变为种子细胞提供的力学微环境显着影响细胞行为和组织/器官形成。细胞在材料表面粘附后会产生细胞牵拉力(CTF);细胞通过CTF向材料的传递去感知和度量材料的力学性质。机械拉伸引起材料应变;材料应变通过向细胞传递去调控细胞行为。因此,CTF和材料应变的传递对细胞感知并响应力学微环境至关重要。蛋白吸附是种子细胞粘附到材料表面之前发生的首要事件。因此,材料表面吸附的蛋白质层是细胞与材料相互作用的桥梁。我们认为,细胞-蛋白界面、蛋白层和蛋白-材料界面构成了一个完整的力传递系统。尽管已有大量研究关注细胞-蛋白界面对力传递和细胞行为的影响,却鲜有人关注蛋白-材料界面作用力(F_(ad))的贡献。解析F_(ad)对力传递和细胞行为的调控作用,对更深入理解细胞响应力学微环境的机制和指导组织再生支架的优化设计有重要意义。据此,本文在构建了定量检测F_(ad)的测试平台和调控F_(ad)大小的材料平台的基础之上,以纤连蛋白(FN)为模型蛋白、成骨细胞为模型细胞,探究了F_(ad)大小调控细胞行为的有效性,并进一步以大鼠间充质干细胞(rMSCs)为模型细胞,系统研究了F_(ad)对细胞牵引力(CTF)和基底拉伸应变传递的影响以及对细胞响应基底力学性质和拉伸应变的影响。主要研究内容和结论如下:(1)构建基于平行板流动腔/微球技术的F_(ad)定量检测平台利用双官能团偶联剂Sulfo-SMPB分别将FN和牛血清白蛋白(BSA)共价固定至氨基化聚苯乙烯微球表面,形成蛋白固定化微球。结合平行板流动腔系统,对吸附在平行板流动腔底部玻片的蛋白固定化微球逐步施加流体剪切力,获得使50%微球脱吸附的临界流体剪切力τ_(50%)。进一步通过球/面粘附模型计算出单个蛋白质分子与载玻片表面的作用力F_(ad)。测试结果显示,蛋白与玻片表面的F_(ad)大小与文献报道结果相似,表明利用该方法能有效地检测F_(ad)大小。(2)构建基于SAMs技术调控F_(ad)大小的材料平台利用硅烷化反应在玻片表面构建携带-OH、-CH_3和-NH_2的SAMs(自组装单分子层)表面,静态水接触角和X射线光电子能谱(XPS)分析表明各化学基团已成功修饰到玻片表面。通过平行板流动腔/微球技术定量测量FN和BSA在各SAMs表面上的F_(ad)大小。结果显示,FN和BSA的F_(ad)大小都依赖于表面化学基团,依次为NH_2-SAMs(25.6±7.5 pN)>CH_3-SAMs(14.1±4.1 pN)>>OH-SAMs(1.5±0.4 pN)和NH_2-SAMs(6.5±4.9 pN)>CH_3-SAMs(4.7±3.6 pN)>>OH-SAMs(1.1±0.8 pN),表明通过SAMs技术可有效调控蛋白质与基底的F_(ad)大小,为后续实验奠定了基础。(3)验证F_(ad)对细胞行为的调控作用鉴于表面化学可通过影响吸附蛋白的构象(表面活性位点)来影响细胞行为,本研究以FN为模型蛋白、成骨细胞为模型细胞,同时考察了各SAMs表面上FN表面活性位点和F_(ad)对成骨细胞的影响。采用FN单克隆抗体(HFN7.1)检测FN表面活性位点,以黏着斑的表达和组装来表征细胞粘附强弱和CTF大小。结果表明,成骨细胞初期粘附(2小时)的CTF大小主要受FN表面活性位点调控,而后期粘附(12小时)则主要受到F_(ad)影响。F_(ad)通过影响CTF对FN的重构和脱附程度来调控细胞的后期粘附,并影响内源性FN的纤维自组装,证明基于SAMs技术调控的F_(ad)大小可影响细胞后期粘附行为,可用于后续F_(ad)对力传递影响的相关研究。(4)F_(ad)对CTF传递以及干细胞响应基底力学性质的影响首先利用SAMs技术在硬(E~2200 kPa,无明显应力松驰)和软(E~1 kPa,有快速应力松驰)聚二甲基硅氧烷(PDMS)基底上构建了携带-OH或-NH_2的表面。F_(ad)检测结果表明,其F_(ad)大小与基底力学性质无关,只与表面化学相关:NH_2-SAMs(35±11 pN和31±10 pN)>>OH-SAMs(3.5±1.1 pN和3.0±1.0 pN),分别记为F_(med)和F_(min)。进一步地,在软、硬PDMS表面共价固定FN以形成F_(ad)极大(F_(max))的表面。然后以rMSCs为模型细胞,分别以吸附FN的重构/脱附情况和基底的变形情况来表征CTF向FN蛋白层和基底的传递情况。研究发现,F_(min)表面的FN不能抵抗CTF牵拉而发生显着重构和脱附,导致CTF不能被传递至基底,使rMSCs不能感知基底力学性质而只能感受蛋白层的弱力学反馈,从而在软、硬基底表面都趋于向成脂细胞分化;相反,F_(med)和F_(med)表面的FN可以耐受CTF牵拉而使CTF可有效传递至基底,rMSCs可以感知基底力学性质,从而在软、硬基底表面都趋于向成骨细胞分化。rMSCs在软的强F_(ad)表面也趋于向成骨分化可能与软基底应力松驰的促成骨分化有关,但有待进一步验证。上述结果证明,F_(ad)调控CTF向基底的传递,进而调控干细胞对基底力学性质的感知和响应。(5)F_(ad)对基底拉伸应变传递和干细胞行为影响的初探在硬(E~2200 kPa,无明显应力松驰)PDMS基底上构建了F_(min)、F_(med)和F_(max)表面。将rMSCs在预吸附了FN的各基底上粘附12小时后利用细胞力学拉伸仪对其施加24小时周期性单轴拉伸应变(0.2 Hz,10%振幅)。同时,对未接种细胞的基底施加相同的拉伸,以观察基底应变本身对吸附FN的影响。研究发现,基底应变可以传递至蛋白层,但单纯的基底应变不影响吸附的FN层。在F_(min)表面上,FN不能抵抗CTF牵拉而发生大面积脱附并减弱细胞骨架和黏着斑形成,且基底拉伸应变更进一步促进了CTF对FN的脱附从而阻碍了拉伸应变向细胞的传递,细胞难以感受基底拉伸应变,细胞排列取向性较弱;而在F_(med)和F_(max)表面上,FN可以耐受CTF牵拉,细胞骨架和黏着斑增强,使拉伸应变可向细胞有效传递,细胞响应基底拉伸应变而趋于垂直于拉伸方向排列。上述结果证明,F_(ad)通过调控CTF对吸附蛋白质层的重构/脱附程度以及黏着斑的形成,决定基底拉伸应变向细胞的传递效应,并最终影响细胞对拉伸应变的感知和响应。综上所述,本论文成功构建了F_(ad)的定量检测平台和调控平台,证实F_(ad)通过调控CTF对吸附蛋白质的重构/脱附程度来影响CTF和基底拉伸应变的传递,并最终调控细胞对基底力学性质和拉伸应变的感知和响应。本论文在细胞-蛋白-材料系统的界面研究中引入了“蛋白-材料界面力”,这为生物界面研究提供了一个新的研究视角,也丰富了生物力学的研究内容,所获得的基于F_(ad)的力传递调控新机制为设计制造有效的组织再生支架提供了全新的思路。
陈茜[7]2011年在《HAMSC分化过程的生物力学特性及纳米金对血管生成抑制作用的研究》文中研究说明本学位论文主要分为两大部分：(1)应用原子力显微镜(Atomic Force Microscopy, AFM)研究人羊膜间充质干细胞成脂、成骨分化过程中力学性能的变化；(2)AFM力谱研究纳米金对血管内皮细胞的抑制作用。第一部分：羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)是一种再生医学的重要资源,具有高度自我更新能力和多向分化潜能。利用原子力显微镜(AFM)、激光共聚焦显微镜(LSCM)、流式细胞术等手段来研究人羊膜间充质干细胞成骨分化前后力学特性的变化,发现随着分化的进行,排列紧密的骨架纤维逐渐变疏。分化前hAMSCs的杨氏模量为3.97±0.53 kPa,而成骨细胞为1.52±0.63 kPa,细胞杨氏模量的减小可能是由于细胞骨架变疏引起的。此外,利用AFM观察细胞表面超微结构,发现成骨细胞的表面覆盖着矿化颗粒,细胞表面颗粒高度分布在200-400 nm之间,而hAMSCs表面颗粒则主要分布在100-200 nm之间。同时,当间充质干细胞分化为脂肪细胞时,其细胞的粘弹力增大,硬度减小。第二部分：纳米金能够特异性地阻断血管内皮因子(vascular endothelial growth factor165 (VEGF165, VEGF165)与其受体(VEGFR-2)的结合,从而具有抑制血管生成和抗肿瘤的作用。本实验主要应用原子力显微镜的力谱来研究纳米金对VEGF165-VEGFR-2之间作用力的影响。在细胞水平,当将纳米金加到人脐静脉内皮细胞的细胞培养液中培养24h后,其胞间连丝较无纳米金作用细胞相比明显变疏。在分子水平上,VEGF165与VEGFR-2之间的相互作用力为119.35±44.3 pN。当在细胞培养液中加入VEGF 165溶液时,VEGF 165与VEGFR-2之间作用减小至31.6±11.0 pN,从而证明VEGF165与VEGFR之间是特异性的相互作用力。然而,当将纳米金与VEGF165共同孵育后再加入到细胞培养液中后,VEGF165与VEGFR-2之间的作用力又增加至108.3±38.1 pN。以上结果从动力学的角度揭示了纳米金抑制血管生成作用的机制为：纳米金通过结合VEGF165上的肝素位点,从而阻止VEGF165与其受体的结合而具有抑制血管生成的作用。
熊志苗[8]2017年在《基材表面特性调控细胞行为及脱细胞基质的研究》文中提出在细胞生物学基础研究和医学应用中,体外细胞培养是核心环节。细胞培养一般会应用到基质材料,而目前的细胞培养基材并不能完全满足细胞培养对多参数的综合需求,探索并建立新的方法手段是发展生物基材的必经之路。为此,本文通过对材料表面进行化学、力学和拓扑结构等方面的构筑,系统考察细胞对生物基材特性的生物学响应。主要包括以几个方面的研究:首先,用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)作为基底材料,采用胎牛血清孵育、胶原沉积和等离子体处理3种修饰方法,同时变化PDMS的硬度,考察牛关节软骨细胞(Bovine articular cartilages,bAC)的生物学行为。结果表明,3种修饰均能显着改善细胞在PDMS表面的粘附和增殖,且等离子体处理的效果最好;材料硬度也对bAC有所影响,但程度上要次于表面修饰的效果。其次,利用静电纺丝技术制备取向或无序的聚己内醋(Poly(ε-caprolactone),PCL)纤维薄膜,并以旋涂法制备PCL平面薄膜作为对照,考察兔骨髓来源的间充质干细胞(Rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells,rMSC)、人成纤维细胞(Human fibroblasts,HF)和bAC的生物学行为。结果发现,3种PCL薄膜都能很好的支持3种细胞的粘附、增殖及基质分泌,改变细胞形态以及基质结构,特别是取向纤维能够引导细胞和基质的规则排列。此外,基因表达也会受到材料表面拓扑结构的影响,其中rMSC和HF的纤连蛋白和Ⅰ型胶原蛋白在电纺纤维上的基因表达下调,而rAC的相关基因表达在不同PCL薄膜上也有所差异。最后,将培养在3种PCL薄膜上的3种细胞通过脱细胞处理,获得9种脱细胞基质(Decellularized extracellular matrix,dECM)修饰的 PCL 薄膜(dECM/PCL),对其组成和结构进行详细表征;并接种培养rMSC考察其生物活性。结果表明,薄膜表面拓扑结构(平面、无序纤维和取向纤维)不仅能够改变细胞形态与排列,还能影响其分泌的基质分子的排列,并且这种排列方式在经过脱细胞处理后仍然得到一定的维持,基质成份在脱细胞处理后有部分流失。dECM/PCL能够显着促进rMSC的粘附、增殖及基质分泌,并且来源于不同细胞的dECM的效果存在差异。综上,本文通过探究细胞对基材表面特性(包括PDMS和PCL)的响应,揭示了不同种类细胞响应的特异性,特别是在dECM上的体现,为将来设计和制备生物基材优化细胞培养微环境奠定基础。
冯建涛[9]2014年在《肿瘤相关生物界面的微尺度构建—功能—力学耦合研究》文中研究指明肿瘤相关的医学功能生物界面既包括体内肿瘤细胞或组织与肿瘤微环境的界面，也包括体外条件下肿瘤细胞与人工材料所形成的二维或叁维界面。该界面的分子生物学组分以及生物力学性质在肿瘤的发生发展过程中均起到了关键作用。目前对肿瘤相关界面的研究多集中在分子生物学机制的探讨上，而对刚度、形貌等生物力学因素的研究却处于初级阶段。因此本论文结合生物力药理学以及“微尺度构建-功能-力学耦合”机制，聚焦了肿瘤相关的医学功能生物界面的力学性质，并探讨其在宫颈癌早期诊断、抗肿瘤药物药理学以及抗肿瘤药物载体设计中的应用。研究中，我们利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚丙烯酰胺水凝胶（PAAG）与聚己内酯（PCL）等高分子材料对医学功能生物界面的力学性质进行了仿生制备。借用原子力显微镜-激光共聚焦联合表征系统以及环境扫描电子显微镜，我们对肿瘤相关生物界面的力学特性及其功能进行了表征与分析。结果发现，第一，正常形貌宫颈鳞状上皮细胞的刚度（MNSCs）与它所处宫颈内上皮瘤变组织的病变程度相关，病变程度越大，MNSCs刚度值越小，因此刚度可以作为癌症早期诊断的新指标。第二，肿瘤细胞所处生物界面的刚度不仅作为单一因素促进了肿瘤细胞的增殖，而且还与抗肿瘤药物具有联合的药理学效应，界面刚度越大，其药物敏感性就越大。经验证，生物界面的刚度增加，促使肿瘤细胞的磷酸化粘着斑蛋白激酶FAK397表达增加，细胞周期加快，最终导致了刚度较大界面上化疗药物的细胞毒性增强。第叁，我们发现形貌对肿瘤细胞的行为也有重要的影响。增加仿花粉微球表面网孔的尺寸，可以促进微球对宫颈癌细胞的粘附，提示我们可以通过控制抗肿瘤药物载体的表面形貌，从而实现对肿瘤细胞的形貌特异性粘附。上述肿瘤相关生物界面的力学相关参数如刚度、形貌的研究表明，不仅在肿瘤的早期诊断过程中可以利用界面的力学特性，而且在抗肿瘤药物筛选、临床化疗以及抗肿瘤药物载体设计过程中也必须充分重视肿瘤相关界面的生物力学因素发挥的关键作用。因此，对肿瘤相关生物界面生物力药理学的探索以及“微尺度构建-功能-力学耦合”机制的研究将为肿瘤的发病机制以及诊疗活动提供新的思路和方法。
曹长海[10]2013年在《短肽自组装水凝胶及其在细胞培养方面应用的研究》文中研究表明水凝胶是以水为分散介质的凝胶，由于它的孔结构和叁维网状结构能够提供好的渗透性和机械支撑，因此在药物运输、组织工程等生物医学方面有着广泛的应用。水凝胶可以通过一些小分子自组装的方式得到，而肽分子无疑是一种较为理想的选择。肽分子的自组装现象广泛存于自然界中，通过自组装，肽分子可以形成不同功能的蛋白质分子，在生物进化及维持生物物种的多样性方面起着重要的作用。通过合理地设计调控肽分子的分子结构及改变相应的外界环境，肽分子通过疏水作用、氢键、静电作用、π-π堆积等非共价力可以自组装形成形态结构和功能特异的自组装体，其中较为重要的一种宏观表现就是水凝胶。肽分子的结构单元为氨基酸，自然界中常见的氨基酸有20种，通过设计不同肽序列可得到多种具有特殊功能的水凝胶材料，此外，肽分子自组装水凝胶还有着良好的生物相容性，在体内可降解，代谢终产物无毒，在材料科学、生物医药及临床医学等领域都有广阔的应用前景，近些年来，已经成为科学界的研究热点。本课题在实验室已有研究基础之上，对Ac-I3K-NH2分子进行了修饰，设计合成了叁个不同系列的短肽分子，分别考察了氧化还原作用、pH、酶催化作用对所设计肽分子自组装成水凝胶的影响，并对所成水凝胶的性能进行了表征，分别考察了其在药物运输、组织工程及凝血方面的应用，具体的研究如下：(1)氧化还原作用下的成胶：Ac-I3K-NH2可以自组装成长纤维，并且在10mM的浓度下可以形成弱的水凝胶，在Ac-I3K-NH2分子基础之上，引入半胱氨酸残基Cys和甘氨酸残基Gly，设计合成了Ac-I3CGK-NH2分子，CD、FTIR及AFM、TEM说明半胱氨酸的引入并没有使分子在二级结构和自组装形貌上发生改变，依旧是β折叠的二级结构和纳米纤维的自组装体。然而，半胱氨酸上的巯基可以被氧化形成二硫键，使纳米纤维间发生化学交联，从而促进形成水凝胶，实验发现Ac-I3CGK-NH2在0.5mM的低浓度时就可以形成水凝胶，流变学实验证明Ac-I3CGK-NH2水凝胶的强度可以由环境氧化还原性调控。为了验证巯基在自组装成胶中的作用，实验中将半胱氨酸残基替换为甲硫氨酸，设计合成了对比分子Ac-I3MGK-NH2，分子中巯基被甲基化，无法氧化形成二硫键，实验证明Ac-I3MGK-NH2在相同的条件下无法成胶。此外，还设计合成了Ac-I3CCGK-NH2，Ac-I3KGCG-NH2两个分子，考察了巯基数量及位置对肽分子自组装成胶时间的影响。(2) pH诱导下的成胶：由于Ac-I3K-NH2中赖氨酸侧链含有伯胺基团，其对pH敏感，在不同的pH下，有着不同的带电荷情况，在此基础上，将丝氨酸和甘氨酸引入到分子序列中，设计合成了肽分子Ac-I3SGK-NH2。与Ac-I3K-NH2相比，此分子在8mM pH为8.6-10的范围里可以形成较为透明的水凝胶，而Ac-I3K-NH2只能形成较为浑浊的粘稠液体。通过pH滴定的方法，发现赖氨酸侧链上的伯胺基的pKa有一个偏移，从10.53减少至8，从而确定了在不同范围内Ac-I3SGK-NH2的带电情况。CD发现8mM的Ac-I3SGK-NH2在pH=9情况下比pH=3的情况下更加容易形成β折叠的二级结构，AFM和TEM结果表明两种pH下Ac-I3SGK-NH2的自组装形貌均为纳米纤维，pH=9时纤维的混乱度明显地增加。同时还设计了对比分子Ac-I3AGK-NH2、Ac-I3TGK-NH2，证明了分子亲疏水性之间的平衡对自组装成胶的影响。通过流变学实验证明，Ac-I3SGK-NH2水凝胶具有很好的机械性能和破坏恢复性能，基于该特性进一步研究了其在药物释放和组织工程方面的应用。同时还将赖氨酸残基换为同样对pH敏感的谷氨酸和组氨酸，设计合成了Ac-I3SGE-NH2和Ac-I3SGH-NH2，在8mM的浓度下，发现在合适的pH下，两种肽分子同样可以形成水凝胶，从而得到规律的存在，为以后的分子设计提供了思路。(3)酶催化下的成胶：谷氨酰胺转移酶可以催化转酰基反应，从而使多肽之间发生共价交联。利用这种酶的特点，在Ac-I3K-NH2的基础上，将谷氨酰胺残基和甘氨酸残基引入，设计合成了Ac-I3QGK-NH2，考察了谷氨酰胺转移酶对Ac-I3QGK-NH2分子自组装成胶的促进作用。质谱分析说明在酶的存在下，Ac-I3QGK-NH2分子发生了交联，以二聚体的形式存在。流变学实验说明在酶的催化作用下，Ac-I3QGK-NH2肽分子所成胶的强度明显增加。考虑到哺乳动物的血液中含有谷氨酰胺转氨酶，故而论文进一步研究了Ac-I3QGK-NH2所成胶在凝血方面的应用，发现Ac-I3QGK-NH2对血小板有很好的粘附凝聚作用。血浆氨氧化酶可以将伯胺转化为醛，从而使醛与伯胺反应生成西弗碱，促使多肽之间发生共价交联，利用这种酶的特点，考察了血浆氨氧化酶对Ac-I3SGK-NH2分子自组装成胶的促进作用，并进一步研究了Ac-I3SGK-NH2所成胶在细胞支架材料方面的应用。
参考文献：
[1]. 干细胞和胶原蛋白结构性质的AFM研究[D]. 王小燕. 暨南大学. 2003
[2]. 胶原蛋白自组装行为以及细胞形态的AFM研究[D]. 赵涛. 暨南大学. 2003
[3]. 心肌纤维与Ⅰ型胶原纤维的超微结构及生物力学特性研究[D]. 朱杰. 西北农林科技大学. 2010
[4]. 生物支架材料的表面化学特性对细胞生物学行为的影响[D]. 陈敏. 华东理工大学. 2016
[5]. 表面功能化聚乳酸膜的构建及其细胞相容性评价[D]. 田冶. 暨南大学. 2008
[6]. 蛋白—材料界面力及其对细胞响应力学刺激的调控作用[D]. 林曼萍. 重庆大学. 2017
[7]. HAMSC分化过程的生物力学特性及纳米金对血管生成抑制作用的研究[D]. 陈茜. 暨南大学. 2011
[8]. 基材表面特性调控细胞行为及脱细胞基质的研究[D]. 熊志苗. 华东理工大学. 2017
[9]. 肿瘤相关生物界面的微尺度构建—功能—力学耦合研究[D]. 冯建涛. 清华大学. 2014
[10]. 短肽自组装水凝胶及其在细胞培养方面应用的研究[D]. 曹长海. 中国石油大学（华东）. 2013
标签：生物学论文; 细胞分化论文; 化学吸附论文; 干细胞论文; 生物技术论文; 力学论文; pcl论文; pla论文;