长沙医学院附属汉寿县人民医院 415900
【摘 要】目的：探讨溶血磷脂酸(LPA)受体4介导慢性胆汁性瘙痒的作用机制。方法：比较正常小鼠（A组）及胆总管结扎小鼠（B组）中LPA4受体的表达。LPA1-6的mRNA表达、LPA4的表达分别采用荧光定量PCR法、免疫印迹法，疼痛及瘙痒采用“面颊模型”法鉴定。结果：两组外周感觉神经元中，LPA1-6受体都有表达，其中LPA4受体表达最丰富，尤其是B组LPA4表达最显著。A组予面颊皮内注射LPA引起疼痛反应，而注射VPC31144(S)仅诱发瘙痒；两组小鼠面颊皮内注射VPC31144(S)引起搔抓反应，与剂量呈正相关。结论：慢性胆汁性瘙痒可能与LPA4受体的表达相关。
【关键词】LPA4受体；慢性胆汁性瘙痒
据资料显示[1]，慢性瘙痒症发病率约8~12%；尤其是较为顽固、难以忍受的瘙痒症，引起疲倦不适、失眠，甚至出现压抑、自杀倾向，对患者及其家人、社会产生重要影响。目前研究表明[1]，在背根神经节内发现特异表达的GRP阳性神经元可作为痒神经元。截止2010年，在众多学者努力下，对痒的致痒介质、传导通路、受体等研究获得一定成绩，但对顽固性瘙痒的致病机制仍处于探索中。明确慢性瘙痒疾病致病机制及有效防治成为临床医务工作亟待解决的重要问题之一。
溶血磷脂酸（LPA）是一种磷脂代谢产物，目前已发现6种受体亚型，分别为LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、LPA5、LPA6，均属于G蛋白偶联受体，可通过LPA4受体介导神经病理性疼痛；并且LPA可诱发慢性胆汁性瘙痒[2]。但LPA致痒机制不明确；本资料通过动物实验探讨LPA4受体与慢性胆汁性瘙痒的相关性，获得一定结果。现报道如下。
1、材料和方法
1.1主要材料
试剂：兔抗LPA1-6受体抗体来源上海士锋科技有限公司；FITC标记的驴抗兔IgG、TRITC标记的驴抗山羊IgG来源江苏科晶生物科技有限公司；18:1溶血磷脂酸购自MERCK公司。
实验动物及分组：实验动物均为健康雌性ICR小鼠，体重约30~35g，均购自长沙医学院实验动物中心。分组：不干预小鼠为A组，胆总管结扎小鼠为B组，方法参照[3]。
1.2 实时定量荧光PCR检测相关LPA的mRNA的表达
用TRIzol试剂从DRG组织提取相关mRNA，然后对mRNA定量、纯度进行鉴定（采用紫外分光光度仪）。参考文献[2]：从GenBank中检索小鼠β-actin、小鼠LPA1-6受体基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计引物。以参考文献[2]mRNA为模板，用RNA反转录试剂盒(江苏科晶生物科技有限公司)进行反转录： 42℃、60 min，72℃、10 min；合成cDNA在4℃保存[4]。取适量cDNA作为模板，进行PCR反应：94℃、5min，94℃、30s，56~62℃、30s，72℃环境下1 min；40个循环。最后对LPA1mRNA、LPA2mRNA、LPA3mRNA、LPA4mRNA、LPA5mRNA、LPA6mRNA的表达进行定量及计算。
1.3荧光显微镜下观察LPA4在DRG内痒神经元的表达
小鼠灌流后，取出L4、5背根神经节，用4%多聚甲醛固定5h；接着用蔗糖-PBS溶液浓度为20%、30%依次梯度脱水2d。接着冰冻、切片（厚度为10μm），修复、水浴10min（92.5℃），取出及冷却。接着漂洗（0.01mol/LPBS溶液，5min/次，共3次）。加二抗封闭血清，保存1h（室温封闭）；去除封闭血清，加GRP抗体(1:1000)及一抗LPA4受体抗体(1:1000)，孵育17h（4℃）。用0.01mol/LPBS溶液漂洗3次，每次5min。加入二抗：TRITC偶联驴抗山羊IgG(1:200)、FITC偶联驴抗兔IgG(1:100)，在二抗中加入Sigma后避光并在室温下孵育1h。封片，在荧光显微镜下观察分析[5]。
1.4痛和痒“面颊模型”实验
“面颊模型”操作参考文献[6]。实验前2d，乙醚快速麻醉小鼠，剃除面颊处5mm×8mm大小毛，然后放其笼中适应40min，第二天再适应40min；实验当天先在笼中适应40min，然后对小鼠基础行为观察并记录40min。接着按剂量30mg/kg对小鼠进行腹腔注射Ki16425，对小鼠行为观察并记录30min；在剃毛处（实验小鼠）皮内注射LPA(浓度为4mmol/L，剂量为25μL/只)后放回笼中，记录小鼠的擦拭和搔抓行为。痛、痒判断标准[6]：前肢擦拭面颊注射部位为痛，后爪搔抓面颊注射部位为痒；共观察40min，最后统计擦拭和搔抓的次数。
1.5统计学分析
对本资料中所有数据采用SPSS20.0软件进行统计分析，计量资料用（）表示，比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。检验标准α=0.05。
2、结果
2.1 比较LPA不同受体在DRG的表达 LPA1-6受体在正常小鼠DRG上均有表达，尤其是胆总管结扎后（A组）小鼠LPA4受体表达较多，LPA1、LPA2、LPA3、LPA5、LPA6另外5种亚型受体表达较少。见图1。
3、讨论
本资料显示，在小鼠外周感觉神经元中，LPA1-6受体都有表达，LPA4受体表达最丰富，尤其是胆总管结扎后小鼠LPA4受体表达量更多。戴丽丽等[2]研究表明在神经损伤早期阶段，可诱导LPA的产生，激活LPA4受体，促使机体产生神经病理性疼痛，提疼痛的发生与LPA4受体参与相关。LPA除对机体神经病理性疼痛发挥启动外，还可能参与瘙痒发病机制。牛建平等动物实验表明LPA可诱发瘙痒，其程度与剂量具有密切相关性；而对过敏性皮肤炎症瘙痒的小鼠予LPA4拮抗剂，搔抓行为明显减少，提示LPA4对过敏性皮炎缠身瘙痒作用。近来研究表明，胆汁淤积瘙痒的患者血清中LPA的活性升高，LPA水平与瘙痒程度呈正比。提示胆汁淤积性患者瘙痒致病与血清中LPA水平的变化密切相关。但LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、LPA5、LPA6中何种受体是慢性胆汁性瘙痒发病的主要因素仍在探索中。
研究发现DRG及三叉神经节内伤害性初级感觉神经元中相关痒神经元，能特异性表达MrgprA3和GRP，若小部分痒神经元兴奋则通过中枢产生痒觉；若促使痒神经元在内的多数伤害性感觉神经元兴奋，则通过中枢产生痛觉[8]。本研究提示，LPA4在胆总管结扎小鼠中表达最丰富，提示了LPA4慢性胆汁性瘙痒中产生重要作用；而正常小鼠皮内注射LPA，则产生疼痛行为，无瘙痒行为。同时，小鼠腹腔注射Ki16425（LPA4受体拮抗剂）后，LPA所诱发的疼痛信号被抑制，而出现显著搔抓行为，提示慢性胆汁性瘙痒与LPA4受体激活相关。其机制可能为：LPA激活LPA4后产生疼痛行为，当LPA4产生的疼痛信号被抑制后则出现瘙痒行为；可能与外周痛信号解除脊髓对痒信号的抑制后才出现搔抓行为。同时有研究指出：伤害性感觉神经元内可能存在痛和痒两种特异性信号通路，如LPA、组胺等可同时诱发疼痛及瘙痒。
总之，在正常情况下，小鼠外周感觉神经元中，LPA1-6受体都有表达，其中LPA4受体表达最丰富，而胆总管结扎后小鼠LPA4受体表达量更多。正常情况下，痒信号通路被LPA4介导的痛信号通路所抑制；当抑制LPA4受体介导的痛信号通路，痒神经元兴奋而产生搔抓反应。因此，慢性胆汁性瘙痒的作用机制可能与LPA4受体存在密切关系。
参考文献：
[1]叶亚平,李觅,吴颖星,等.溶血磷脂酸通过RhoA-YAP通路调控脂肪干细胞增殖的研究[J].骨科,2016,7(6):429-435.
[2]李亚萍,杨颖,党双锁.肝胆疾病引起瘙痒的机制、特点及治疗[J].皮肤科学通报, 2015(6):593-597.
[3]戴丽丽,王琦,王琼,等.溶血磷脂酸受体4在胆汁性瘙痒中的作用[J].解剖学杂志, 2016,39(2):196-199.
[4]李小好,杨波,尚桂莲,等溶血磷脂酸受体3介导溶血磷脂酸诱导的血管平滑肌细胞表型转化[J].中华老年心脑血管病杂志,2012,14(10):1082-1086.
[5]林川川,李铎,李佳文,等.溶血磷脂酸对细胞迁移的影响及相关分子机制[J].生物医学工程学杂志,2016(5):1005-1010.
[6]李田乐.心功能不全合并糖尿病大鼠模型建立及代谢组学研究[D].天津医科大学,2016.
项目编号：16C0167项目名称： 湖南省教育厅科学研究。
论文作者:刘建红,徐元月,张平,何羹尧,张晋维,丁辉勇
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2019年5期
论文发表时间:2019/7/26
标签：受体论文; 小鼠论文; 神经元论文; 胆汁论文; 磷脂论文; 面颊论文; 疼痛论文; 《中国结合医学杂志》2019年5期论文;