董永恒[1]2004年在《EDAG相互作用蛋白THAP11 对NF-κB活性的抑制》文中指出EDAG基因是本实验室分离克隆的一种与造血细胞增殖分化密切相关的新基因。EDAG基因是从4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST库中分离到的一种新基因片段，mRNA长约2.2 kb,经筛选人胎肝 cDNA文库获1.9kb片段，命名为红系分化相关基因（erythroid differentiation-associated gene，EDAG）。序列分析推测该基因编码484 个氨基酸组成的蛋白质，且在体外实验得到证实，该蛋白定位于染色体9q22。前期研究表明，EDAG特异表达于造血组织与胚胎组织，并在白血病细胞中高表达。利用反义核酸技术抑制EDAG表达后，可以抑制白血病细胞的增殖能力以及诱导剂所诱导的分化能力。在细胞因子依赖的细胞株中高表达EDAG 可使细胞对细胞因子的依赖性降低，并表现出较强的抗凋亡能力。分子机制的研究表明，EDAG可以通过某些途径活化转录因子 NF-kappaB，使其入核并激活其下游基因如c-myc，Bcl-2 及Bcl-xL等凋亡相关蛋白的表达。酵母双杂交体系是一种采用分子遗传学手段、通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。为深入研究EDAG基因激活NF-κB的机制，本研究以EDAG为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统从人骨髓cDNA文库中筛选其相互作用蛋白，希望得到一些参与EDAG调控NF-kappaB通路的相互作用蛋白。本实验分以下几个方面进行研究：1．诱饵蛋白pGBKT7-EDAG的构建和鉴定为了筛选EDAG的相互作用蛋白,本研究用PstⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶对PMD-EDAG和pGBKT7载体进行酶切,将EDAG片段插入到pGBKT7载体中,获得诱饵蛋白pGBKT7-EDAG。2．人骨髓文库中EDAG相互作用蛋白的筛选利用酵母双杂交方法以1.0kb的EDAG作为诱饵蛋白，筛选在人骨髓细胞中能与EDAG有相互作用的蛋白，这些与EDAG有结合作用的蛋白可能是EDAG的特异性底物或者是在细胞内调节或介导EDAG功能的一些重要介导分子。通过对人骨髓文库的筛选，一共得到57个阳性克隆。发现几个重要的候选基因，他们编码的蛋白分别是：THAP11、ABP-280、IL8等。其中THAP11重复出现10次，本文对THAP-11的功能进
高飞[2]2005年在《泛素样蛋白NEDD8对乳腺癌相关蛋白3(BCA3)的修饰及BCA3对NFκB活性的抑制》文中研究指明蛋白质的泛素样修饰对蛋白质功能调控有重要意义。NEDD8(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated)是近年发现的一种泛素样小分子蛋白。NEDD8修饰系统对细胞增殖、发育有重要作用,但NEDD8的靶蛋白目前仅发现P53、Mdm2、pVHL和Cullin家族。寻找更多的 NEDD8靶蛋白成为目前研究的热点。NEDD8修饰是可逆的,NEDD8特异的蛋白酶,SENP8,可以把NEDD8从它的靶蛋白上水解去除。本研究以SENP8为诱饵,利用酵母双杂交技术,并通过 GST-pull down实验和在体免疫沉淀发现SENP8和乳腺癌相关蛋白3(breast cancer associated protein 3,BCA3)相互作用。在此基础上我们发现,NEDD8确实可以修饰BCA3,而SENP8可以逆转BCA3 的NEDD8修饰;NEDD8修饰是非特异地发生于BCA3的11个lysine上的;BCA3的NEDD8修饰发生于染色质。进一步研究显示,BCA3可以作为NF kB的共抑制者(co-repressor),抑制TNF α诱导的NF kB激活,并且BCA3的这一活性是依赖于NEDD8修饰的。BCA3的活性还依赖于第叁类脱乙酰酶SIRT。本研究确认了一个新的NEDD8靶蛋白BCA3, 提示NEDD8修饰可能在转录调控中扮演着重要角色。
李长燕[3]2005年在《一种新型造血相关转录调节因子EDAG的功能及作用机制研究》文中提出EDAG是我们实验室自行分离克隆的一种特异表达于造血组织和细胞的新基因。前期研究表明EDAG可促进造血细胞的增殖并抑制分化,并且具有转化活性,提示其可能参与造血发育调控及白血病的发生。本研究对EDAG功能进行了深入研究。首先,EDAG在IL-3依赖细胞株Ba/F3中的过表达,可使细胞在IL-3撤除条件下存活增多,细胞抗凋亡能力增强并伴随多种抗凋亡相关蛋白表达的上调;其中NF-κB的活化是EDAG促使细胞抗凋亡能力增强的主要原因,P13K通路参与了EDAG对NF-κB的活化过程。其次,利用CD11a启动子制备了EDAG特异表达于造血细胞的转基因小鼠,并对小鼠的表型进行了全面分析。发现EDAG在小鼠造血细胞中的过表达影响了多种类型造血细胞的发育与分化,主要表现为:小鼠髓系造血增强,出现骨髓增生性疾病特征:T、B淋巴细胞发育受阻;造血干细胞数量增多,分化能力下降;DC细胞比例增多等。分析还发现转基因小鼠骨髓细胞中多种造血相关基因的表达发生改变。该结果表明EDAG是造血调控过程中的关键调节分子。利用酵母及哺乳动物系统发现EDAG具有转录激活活性,EDAG相互作用蛋白THAP11及蛋白激酶C(PKC)激活剂PMA对EDAG的转录活性具有明显的增强作用。基于THAP11是一种DNA结合蛋白,我们认为EDAG/THAP11相互作用可能形成一种新型转录调节复合物,磷酸化修饰可能是其发挥转录调节活性的重要调节方式。 综合以上结果,我们认为:EDAG基因是一种新型转录调节因子,参与了造血细胞凋亡与造血系统发育的调控。
刘南英[4]2007年在《土鳖四逆散对大鼠纤维化肝脏NF-κB活性的抑制作用》文中进行了进一步梳理目的:采用四氯化碳(CCL4)诱导并维持大鼠肝纤维化模型。设立土鳖四逆散治疗组、秋水仙碱治疗组、模型对照组及空白组。从第五周起至第十二周,土鳖四逆散治疗组大鼠以土鳖四逆散液灌胃,秋水仙碱治疗组大鼠以秋水仙碱灌胃。第十二周未处死大鼠,取大鼠血液运用自动生化分析仪检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天氨酸氨基转移酶( AST)水平,以及用放射同位素检测大鼠血清透明质酸(HA)含量。另制作肝组织切片,光镜下观察肝组织病理学变化,免疫组化SP法检测核因子-κBp65蛋白活性。结果:1.土鳖四逆散可以显着降低四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天氨酸氨基转移酶水平(P<0.001)。2.四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型HA含量显着增加,用土鳖四逆散治疗后HA含量显着降低(P<0.001)。3.模型对照组大鼠肝脏损伤及其纤维化分级程度显着高于正常组大鼠,土鳖四逆散组大鼠肝损伤及其纤维化分级程度显着低于模型对照组大鼠(P<0.001)。4.模型对照组大鼠肝脏组织NF-κBp65蛋白的活性显着高于正常组大鼠额及土鳖四逆散组大鼠,土鳖四逆散显着抑制纤维化肝脏组织NF-κBp65蛋白的活性(P<0.001)。结论:1.土鳖四逆散具有良好的保肝作用,可明显的降低实验大鼠血清转氨酶水平。2.土鳖四逆散具有良好的抗肝纤维化作用,可明显的降低实验大鼠血清HA水平。3.土鳖四逆散可抑制实验大鼠肝脏内NF-κB的活性,是本方抗肝纤维化的重要作用机理之一。4.土鳖四逆散抗实验性大鼠肝纤维化的疗效优于秋水仙碱。
吴丽娟, 康格非[5]2004年在《锌指蛋白A20及其对炎症反应的调控》文中研究表明炎症反应是机体的一种正常免疫防御机制 ,一旦炎症反应超出了机体对炎症的调控阈 ,表现为临床常见的系统性炎症反应综合征 ,甚至发展成为多器官功能障碍综合征 ,是导致临床危重病例死亡的重要原因。失控性炎症反应主要由NF κB、AP 1等核转录因子过度活化以及他们之间的协同效应导致促炎因子大量释放所致。A2 0是一种Cys2 /Cys2型胞液锌指蛋白 ,炎症时体内所有组织细胞都能够诱导性表达 ,旨在限制NF κB和AP 1活性 ,是炎症反应的内源性调控蛋白和组织细胞保护性蛋白
徐诚望[6]2005年在《新型造血相关转录调节因子EDAG作用机制的初步研究》文中研究表明红系发育相关基因(erythoid develop associated gene,EDAG)是我们实验室自行分离克隆的一种特异表达于造血组织和细胞的新基因(中国专利申请号:01118268.8公开号:CN1388130A)。EDAG基因是从4月龄人胎肝组织与成年肝组织的差异表达基因EST库中分离到的一种新基因片段,经5′RACE获得其全长为2166bp的cDNA。该基因定位于染色体9q22,编码484个氨基酸组成的蛋白质,与小鼠Hemogen及大鼠RP59基因同源。研究表明,EDAG高表达在胚胎组织和造血组织中,具有恶性转化活性,与维持细胞的未分化状态有关。高表达EDAG可使Ba/F3细胞存活能力增强,并可通过活化NF-κB上调c-myc、Bcl-xl、Bcl-2等增强细胞抗凋亡能力。转基因小鼠的研究表明在小鼠造血细胞中过表达EDAG可导致造血干细胞增殖分化紊乱,突出表现在髓系造血增强,淋巴系造血抑制,并出现典型的髓系增生综合征,表明EDAG是一种参与造血发育与分化调控的重要基因。 目前EDAG调控细胞增殖、分化及凋亡的分子机制尚不明确。对EDAG蛋白的结构进行生物信息学分析发现,在其N端有一个典型的coiled-coiled结构域,此结构域多存在于单聚体蛋白中,且高度保守,通常介导蛋白与蛋白之间的相互作用。这提示我们EDAG很可能是通过与其他重要蛋白的相互作用发挥功能。 本研究制备了EDAG及THAP11多克隆抗体,检测了EDAG及THAP11的蛋白水平表达情况,发现EDAG与THAP11的表达有相似性,并通过共定位及Co-IP验证了二者的相互作用。初步探索THAP11对EDAG转录活性的影响,发现THAP11可增强EDAG的转录活性。通过荧光蛋白融合表达及Wesrtern blot分析可诱导表达EDAG稳定细胞系中EDAG的分布两种方法确定EDAG定位在细胞核中,为认识EDAG的作用机理提供思路。利用IP-MS方法检测到EDAG的相互作用蛋白HSP70,在K562细胞中验证二者的生理性相互作用,并初步探讨了HSP70对EDAG表达的影响。 EDAG及THAP11多克隆抗体的制备为EDAG及THAP11的功能研究提供重要工具;建立可诱导表达EDAG的稳定细胞系为EDAG功能的研究提供重要的细胞模型;验证THAP11及HSP70与EDAG的相互作用对于阐述EDAG调控造血的分子机制具有重要意义。
刘超[7]2017年在《EDAG/THAP11相互作用调控HSC功能的分子机制研究》文中指出造血干细胞(HSC,Hematopoietic stem cell)是血液系统各种成熟细胞的最初来源,其通过自我更新来维持HSC群体的稳定,通过定向分化产生各种造血祖细胞进而分化成各种成熟血细胞。自我更新与分化的平衡是长期维持造血功能所必须的,其调控是个复杂的过程。转录因子是调控造血干细胞功能的驱动力,转录因子往往通过蛋白质相互作用的方式发挥精确的转录调控作用。EDAG(Erythroid differentiation-associated gene)是一种造血组织特异表达并可调节造血干细胞增殖与分化的重要转录辅助因子,具有双重转录调节活性。对EDAG结构分析发现该蛋白虽然可调节多种基因的表达,但并不具备任何已知的DNA结合结构域,我们推测很可能是通过与其他转录因子相互作用,发挥转录调控作用。THAP11(Thanatos-associated protein11)是THAP家族中的一员,其是一种含有C2-CH锌指DNA结合结构域,能够识别一段15bp(ACTACNNT CCCAG)左右双链DNA序列的转录因子。已知THAP11在胚胎干细胞的存活及多能性维持中发挥重要作用,但在造血干细胞中的作用尚无报道。前期实验证明EDAG与THAP11具有相互作用。因此,我们提出EDAG是否与THAP11形成转录调控复合体,通过结合染色体特定位点,选择性调节基因表达,进而调控HSC功能。本研究中我们采用Ch IP-Seq技术分析了EDAG及THAP11在K562中染色体上的结合谱,整合两者结合谱,生物信息学分析EDAG与THAP11在染色体上共结合的位点。利用全基因组表达谱芯片确定EDAG与THAP11调控的靶基因群,明确两者共调控的靶基因,然后对调控的靶基因群进行分析与构建报告基因载体验证。分析EDAG与THAP11上调与下调的基因群,对这些基因群进行GO分类及信息挖掘,揭示EDAG/THAP11调控基因表达的模式。数据分析得到了EDAG与THAP11同时结合且受EDAG影响的基因71个,主要富集在翻译、细胞衰老、组蛋白修饰、蛋白去泛素化及氨基酸代谢等过程。同时发现EDAG与THAP11调控的靶基因中,线粒体功能相关基因高度富集。通过免疫荧光我们发现敲低EDAG影响CD34+线粒体形态,线粒体发生融合,线粒体含量降低。这些结果提示EDAG在维持造血干细胞线粒体稳定中发挥重要作用,但是否与THAP11共结合发挥作用还需进一步的实验证实。为了更深入的研究THAP11在造血中的作用,我们构建了Ronin(鼠源THAP11)条件性敲除小鼠。利用Vav-Cre工具小鼠在造血细胞中特异性敲除Ronin。首先我们对Ronin~（loxp/+）Vav-Cre~（Tg）小鼠进行了表型的初步探索,结果显示该小鼠中Ronin的RNA水平及骨髓和胸腺中蛋白水平均明显表达下调。血象分析表明红细胞及血红蛋白含量减少。骨髓红细胞发育迟缓,早期发育的红细胞(EryA)比例升高,晚期EryC比例下降。脾和骨髓LSK比例降低,胸腺T细胞发育受阻,外周血、脾脏、骨髓B细胞比例下降。这些结果初步表明THAP11很可能影响了多个谱系造血细胞的发育和分化。
王剑虹, 黄庆科, 陈民新[8]2004年在《抑制肝癌细胞的核转录因子活性增强阿霉素的抗癌作用》文中研究说明核转录因子(NF—κB)与肿瘤的发生和发展密切相关。在乳腺癌的研究中发现,阿霉素能够激活NF—κB的活性而抑制肿瘤细胞的凋亡,影响其抗癌疗效。阿霉素作为肝癌化疗方案的主要药物,在肝癌细胞中是否存在激活NF—κB活性的作用,
王罡琦[9]2014年在《硝基化油酸（OA-NO2）调节脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的表达及分子机制研究》文中指出硝基化脂肪酸是NO和NO2—与不饱和脂肪酸氧化还原反应的衍生物，包含两种重要的形式：硝基化油酸（OA-NO2）和硝基化亚油酸（LNO2）。硝基化脂肪酸作为抗炎症的调节因子，与肺上皮细胞血红素加氧酶1（HO-1）的激活、核因子κB（NFκB）的抑制、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）的激活以及核转录相关因子2/Kelch样ECH联合蛋白（Nrf2/Keap1）等多条信号通路相关，并且其含量在氧化压力和炎症反应条件下进一步增加，发挥对血管的保护作用。脂蛋白相关的磷脂酶A2（Lp-PLA2）是磷脂酶A2（PLA2）超家族的成员，又称作血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）。临床和流行病学研究表明，Lp-PLA2与心血管疾病和中风发生相关，可以作为预测心血管风险的生物标记物。本研究将探索OA-NO2对Lp-PLA2表达的调节作用，及其相关分子机制。以THP-1单核细胞被诱导转化形成的巨噬细胞的为研究对象。当THP-1单核细胞被诱导为巨噬细胞后，Lp-PLA2的表达量显着上升。先将OA-NO2预孵育THP-1细胞，然后用PMA诱导一定时间后检测Lp-PLA2的表达。结果表明，OA-NO2能显着下调Lp-PLA2mRNA和蛋白的表达，而且具有剂量和时间依赖性。但是在没有PMA诱导的情况下，OA-NO2对Lp-PLA2的表达没有显着的影响。油酸（OA）作为OA-NO2的本体，对Lp-PLA2的表达也没有影响。在高甘油叁酯症疾病模型Apo CIII转基因猪中，Lp-PLA2的表达量明显高于正常猪，OA-NO2可以抑制Apo CIII转基因猪外周血单核细胞中Lp-PLA2mRNA的表达，而对正常猪外周血单核细胞中Lp-PLA2的表达没有影响。OA-NO2能抑制THP-1细胞的增殖，并且随着时间的增加抑制越明显，而OA对THP-1细胞的增殖没有影响。通过对OA-NO2相关信号通路的研究发现，OA-NO2下调Lp-PLA2mRNA和蛋白的表达与其对p44/p42MAPK磷酸化的抑制有关。OA-NO2还能抑制p65NFκB的磷酸化和NFκB/DNA的结合活性，从而下调Lp-PLA2mRNA和蛋白的表达，而OA-NO2对NFκB途径的调节与IκB的调节无关。此外，我们还发现，OA-NO2作为NO供体以及PPARγ潜在受体，OA-NO2对Lp-PLA2表达的调节不依赖于NO的释放和PPARγ的激活。炎症和氧化压力在动脉粥样硬化的形成过程中起重要作用，OA-NO2能显着下调白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）和单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达，抑制Lp-PLA2的表达同样能抑制炎症因子的表达，所以OA-NO2对炎症因子的调节可能与对Lp-PLA2的调节相关。OA-NO2也能上调超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并且与Lp-PLA2的表达相关。因此，OA-NO2通过调节Lp-PLA2的表达对炎症因子和SOD活性产生影响。本研究揭示了OA-NO2对Lp-PLA2的调节作用及其调节的分子机制。OA-NO2在调节Lp-PLA2表达的过程中，对炎症因子有显着的抑制作用，并上调SOD活性，从而对心血管起到保护作用。
潘凤, 史源, 李华强, 赵锦宁, 唐仕芳[10]2003年在《新生鼠败血症时核因子-κB的表达》文中认为目的 探讨核因子 κB(NF κB)信号途径在新生鼠败血症中的作用 ,为临床寻求以NF κB为靶点的治疗手段提供实验依据。方法 新生 10d的Wistar大鼠 ,采用金黄色葡萄球菌 (简称金葡菌 )皮下注射的方法制作败血症模型。 (1)采用电泳迁移率改变分析 (EMSA)方法检测金葡菌败血症新生鼠肺、肝脏NF κB活性的表达水平 ;(2 )采用免疫组织化学方法检测金葡菌败血症新生鼠脾脏NF κBP6 5活化的表达水平 ;(3)检测抗氧化剂———吡咯二硫氨基甲酸酯 (PDTC)对金葡菌败血症新生鼠肺、肝脏NF κB活化以及脾脏NF κBP6 5活化的影响。结果 金葡菌败血症新生鼠肺脏NF κB活性1h开始有增强 ,3h达高峰 ,2 4h已无明显激活。肝脏NF κB在 1h也开始有激活 ,4h达高峰 ,2 4h无明显活化。脾脏NF κBP6 5活化阳性表达在细菌刺激后 1h ,细胞核内P6 5阳性细胞数 (12 0± 3 7)即明显增加 ;3h阳性细胞数 (5 1 4± 5 9)增加最明显 ;而在 2 4h阳性细胞数明显减少 (3 4± 1 4 ) ,与对照组比较差异无显着性。应用PDTC 5 0～ 2 0 0mg/kg对肺、肝脏NF κB活化及脾脏NF κBP6 5活化阳性表达均有抑制作用 ,且剂量越大 ,抑制作用越强。应用PDTC 2 0 0mg/kg ,对NF κB活性抑制作用最强。结论 新生鼠金葡菌败血症时肺、肝、脾脏NF κB均有明显
参考文献：
[1]. EDAG相互作用蛋白THAP11 对NF-κB活性的抑制[D]. 董永恒. 吉林大学. 2004
[2]. 泛素样蛋白NEDD8对乳腺癌相关蛋白3(BCA3)的修饰及BCA3对NFκB活性的抑制[C]. 高飞. 中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集. 2005
[3]. 一种新型造血相关转录调节因子EDAG的功能及作用机制研究[D]. 李长燕. 中国人民解放军军事医学科学院. 2005
[4]. 土鳖四逆散对大鼠纤维化肝脏NF-κB活性的抑制作用[D]. 刘南英. 南昌大学. 2007
[5]. 锌指蛋白A20及其对炎症反应的调控[J]. 吴丽娟, 康格非. 生命的化学. 2004
[6]. 新型造血相关转录调节因子EDAG作用机制的初步研究[D]. 徐诚望. 中国人民解放军军事医学科学院. 2005
[7]. EDAG/THAP11相互作用调控HSC功能的分子机制研究[D]. 刘超. 安徽医科大学. 2017
[8]. 抑制肝癌细胞的核转录因子活性增强阿霉素的抗癌作用[J]. 王剑虹, 黄庆科, 陈民新. 中华肝脏病杂志. 2004
[9]. 硝基化油酸（OA-NO2）调节脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的表达及分子机制研究[D]. 王罡琦. 吉林大学. 2014
[10]. 新生鼠败血症时核因子-κB的表达[J]. 潘凤, 史源, 李华强, 赵锦宁, 唐仕芳. 中华儿科杂志. 2003