1南阳医学高等专科学校第一附属医院 河南南阳 473058；2河南科技大学第一附属医院 河南洛阳 471000
【摘 要】目的：采用RT-PCR技术及免疫组化技术，检测VEGF-C在肺癌及其癌旁肺组织中核酸水平及蛋白水平是否表达及其表达水平，比较其在肺癌组织和癌旁组织中表达水平的差异，分析其与病理类型、分化程度和临床分期的相关性，探讨其在肺癌发生发展中是否起着一定作用，以及是否可作为肺癌早期诊断的标志物。方法：收集手术切除的肺癌及癌旁肺组织标本50例，其中肺鳞癌21例、腺癌23例和大细胞癌6例；中-高分化组28例，低分化组22例：临床I期1 6例，II期10例，III期l 9例，IV期5例。将癌组织和癌旁组织分别用RT-PCR和免疫组化的技术检测VEGF-C在核酸及蛋白水平的表达情况，凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和光密度值，数据统计采用t检验、方差分析及秩和检验，处理均用SPSS 11.5软件包完成。
结果：四种病理类型的肺癌及其癌旁肺组织中，VEGF-C的在核酸及蛋白水平上的表达一致。在核酸和蛋白水平中均检测到VEGF-C的的表达，且肺癌组织中的表达水平均明显高于癌旁肺组织。VEGF-C的免疫组化结果中：转移癌组织>癌组织>癌旁组织>正常组织。与正常肺组织相比，癌旁组织、癌组织和癌转移组织中VEGF-C的mRNA相对表达量分别增加了6.5倍（P<0.05）、7.3倍（P<0.01）和8.9倍（P<0.01）。结论：VEGF-C在肺鳞癌、腺癌、小细胞癌、大细胞癌及其癌旁肺组织中核酸水平及蛋白水平均有表达，且在蛋白水平和核酸水平的表达一致。VEGF-C在肺癌组织中的表达水平明显高于癌旁肺组织。其表达与肺癌分化程度及临床分期有关。结果提示转录因子表达可能与肺癌的发生、发展有关。VEGF-C的表达将可能作为肺癌早期诊断的新的有价值的分子标记物，并协助判断肺癌的发生和发展，提供新的生物靶点可能。
【关键词】非小细胞肺癌；VEGF-C 表达
2.1 标本收集：标本来源于南阳医学高等专科学校附属第一、第二医院手术切除的肺癌和癌旁组织共50例，其中鳞癌21例、腺癌23例和大细胞癌6例。标本于液氮中保存，后转入-80℃冰箱保存。
3.1.3 试剂
RNA提取试剂
Trizol 试剂：
Micro Scale RNA Isolation Kit
qRT-PCR试剂
UnivesaL cDNA synthesis Kit
SYBR Green master mix
MiRNA-21及U6引物
TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0：
3.1.4 主要仪器
超低温冰箱
二氧化碳恒温孵箱
超净工作台
倒置相差显微镜 便携式高温高压消毒锅
DK-8D型恒温水浴箱
5810R高速冷冻离心机
紫外分光光度计
Real time PCR仪
WD-9413B凝胶成像分析仪
3.2 实验方法
3.2.1 组织中VEGF的PCR方法：
实时荧光定量PCR
引物设计
轻轻吸打，混匀，50℃温度下，孵育，时间为50分钟。反应结束后，以85°保温，时间为5分钟。
qRT-PCR扩增
2.5.1仪器及分析方法
用罗氏公司的7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对量分析。
3.2.2VEGFP-CR方法
1. 提取总RNA
2. qRT-PCR检测VEGF和PDCD4 mRNA
（1）DNase 消化
（7）计算检测结果：
计算相对表达量，使用 PCR 反应曲线得到Ct 值（threshold cycle number，阈值循环数）计算，同时cel-miR-39作为VEGF的内参照。
3.3 统计学分析
用SPSS 17.0统计软件，进行统计分析。两组VEGF表达的差异采用单因素方差分析，VEGF与膀胱癌组临床病理的多样本量比较采用U检验，生存分析采用COX回归模型。
第3章 结果
3.1 VEGF血免疫组化阳性判定和计数
在免疫组化染色的切片上：VEGF呈现棕黄色颗粒，主要分布于肿瘤细胞核内，也可表达与胞浆。根据染色强度和范围，在此基础上，参照Garcia评分标准[10]，对各组中染色情况评分。综合染色强度和阳性细胞数。按着色强度分无、弱、中、强分别记为0～3分；按阳性细胞比例数将0记为无阳性细胞，<25％记为1分，26％～50％为2分，>50％为3分，两者相加后分3级：0～2分为（一），3～4分为（+），≥5分为（++）。每张切片选择有代表性的区域，在400倍视野下计数，共计5个视野，取其平均值，避免随意性。
3.2免疫组化表达情况
VEGF呈现棕黄色染色颗粒分布于相邻肺癌细胞之间的胞核膜上，在同一阳性切片中，不同区域的肺癌细胞染色强度不一致，有的只呈部分区域的肺癌细胞着色（图2-1，2）。在正常肺组织中的支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞均呈阳性表达（图2-1）。转移癌与非转移癌相比差异具有统计学意义（P<0.05），转移癌组织>癌组织>癌旁组织>正常组织
3.4 VEGFmRNA表达水平
在50个患者中，VEGFmRNA的表达量与组织学类型，临床分期，肿瘤细胞分化和淋巴结转移呈正相关。与正常肺组织相比，癌旁组织、癌组织和癌转移组织中 VEGF mRNA相对表达量分别增加了2.1倍（P<0.05）、4.5倍（P<0.05）和7.1倍（P<0.01）。临床分期结果显示，与正常组织相比，I~II期和III~V期 VEGF mRNA水平分别增加了1.9倍（P<0．05）和5.3倍（P<0．01）。病理分型结果显示，与正常组织相比，低分化类别和高、中分化类别 VEGF表达水平分别增加了3.2倍（P<0.05）和6.8倍（P<0.01）。组织分类结果显示，与正常组织相比，鳞癌、腺癌和大细胞癌 VEGFmRNA表达水平分别增加2.1倍（P<0.05）、7.9倍（P<0.01）和2.0倍（P<0.05）。
第4章 讨论
肺癌是目前全世界范围内发病率及死亡率均居于首位的恶性肿瘤，其临床表现多样，目前又缺乏早期诊断的肿瘤标记物，肺癌的早期诊断尚有相当大的困难[1]。目前研究证明，肿瘤细胞和未分化的胚胎细胞在很多方面有相似之处，尤其是两种类型的细胞都具有无限增殖、自我更新的能力，并具有侵袭性。这些相似性提示一些胚胎干细胞因子可能在肿瘤里重复表达或者重复激活[2]。
本研究发现，VEGF在肺癌组织中的表达显著显高于其癌旁组织，VEGF蛋白表达强度随着与肿瘤的病理学分级增高而增加，提示 VEGF具有作为很多肿瘤的预后分子标记物的潜在作用。有很多研究表明，VEGF作为早期胚胎发育和维持胚胎干细胞特征所必须的转录因子，可见于腺上皮肉瘤病变和胰腺侵袭性导管癌；还参与中枢神经系统、呼吸道、泌尿生殖系统等多种肿瘤的发展[3]。 迸一步的研究发现 VEGF表达会导致肿瘤转移能力及恶化程度增加，与多种肿瘤不良预后相关[4]。我们的研究亦发现癌组织 VEGF表达明显高于肺癌癌旁，而正常组织表达水平极低，表明 VEGF可能参与了肺癌的发生、发展过程。目前关于 VEGF在肺癌组织中的表达与肺癌发生、发展的关系研究虽未见相关报道，VEGF在早期胚胎发生、神经分化和晶状体发育等多种重要的发育事件中都起着关键的作用[5]。 VEGF表达在胚胎的全能干细胞和其他早期的多潜能细胞中，在胚胎发生中，VEGF基因表现出多样的动态的表达模式，这与其在各种发育事件中起着重要作用是一致的[6]；国内外对 VEGF的研究主要对象细胞系以细胞系为主，在实体瘤方面研究则很少[7]。小细胞肺癌患者血清，检测到 VEGF的阳性表达，且与阳性患者的生存时间相关，可作为患者预后的标志。
此外，研究结果显示，肺鳞癌 VEGFmRNA表达水平高于肺腺癌，提示 VEGF可能区分肿瘤鳞状细胞癌和腺癌中发挥重要作用。相同研究已有报道，应用免疫组织化学检测 VEGF表达于94％的肺鳞癌，21％的肺腺癌。在肺的发育过程中，VEGF表达于主支气管而促进上皮细胞的发育，而在支气管及下级支气管中无表达，而鳞状细胞癌长发生于主支气管，腺癌发生于支气管，因此是否 VEGF的表达可以区分鳞状细胞癌和腺癌，结果显示在RNA和蛋白水平，其在鳞状细胞癌表达大大高于腺癌，因此其推测，VEGF的表达可以用来区分鳞状细胞癌和腺癌。免疫组织化学检测了 VEGF在消化道鳞状细胞癌和腺癌中的表达，96％的食管鳞状细胞癌阳性表达，而腺癌中只为13％；在肛管鳞状细胞癌中阳性为100％，而腺癌中为17％，综上所述，VEGF在何种肿瘤中高表达，说明 VEGF在这些肿瘤的发生中起了一定作用。
总之，VEGF在肿瘤中的作用已经确定，但是在不同肿瘤中表达情况不一样，在胃癌和绒毛膜癌中起表达相对减低，而在其他肿瘤其表达相对对增高，肺鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌中位 VEGF基因的高表达，那么在其它肿瘤中机制是什么?目前的研究显示 VEGF在分子信号通路中可能属于WNT通路，但其与WNT通路中分子的相互关系有待进一步研究。
参考文献：
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[3] 赵庆生，冷飞燕，郑伟，等．干细胞因子 VEGF 在肺癌中 的表达及意义[J]．山东医药，2011，51（28）：12-14．
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[6] 李鹏飞，吕慧娜，韩立波．转录因子Oct4、 VEGF 在人肺癌中的表达及其临床意义[J]．山东医药，2012，52（20）：79-81．
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论文作者:李学兆1,王红岩2
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2016年9月第18期
论文发表时间:2017/1/9
标签：肺癌论文; 组织论文; 细胞论文; 腺癌论文; 肿瘤论文; 水平论文; 阳性论文; 《中国医学人文》(学术版)2016年9月第18期论文;