黎玲[1]2003年在《外源野生型P16基因转染对膀胱癌细胞周期影响的初步研究》文中提出细胞周期调控在正常哺乳动物细胞的生长中具有关键作用。肿瘤细胞最基本的正常生物学行为改变就是对细胞周期的调节失去控制。现在一般认为具有活性的Cdk4-Cyclin D1复合物可以帮助细胞通过细胞周期中的限制点R，在越过这一点之后，细胞将会进入下一轮的复制。到目前为止获得的证据表明，Cdk4是促使细胞通过R点的“基本元件”。已经证明P16INK4a能够将细胞阻滞在G1期，但外源性的P16基因将如何影响Cdk4和Cyclin D1仍需进一步的研究。本实验对外源性野生型P16基因对癌细胞生长的影响作了研究。同时用免疫细胞化学和RT-PCR的方法检测了细胞中与细胞周期调节相关的P16，Cdk4, Cyclin D1和Rb基因在蛋白水平和转录水平的表达变化。所有这些结果都证明了外源野生型P16基因对癌细胞的细胞周期调节具有负面作用，能够阻遏细胞的恶性增殖。方法：采用pcDNA3质粒进行转染，该质粒含有野生型P16基因片段和新霉素抗性基因。转染后，用含有800μg/ml G418的培养基筛选，得到转染成功的细胞。用流式细胞仪分析细胞的细胞周期分布。与细胞周期调控相关的P16，Cdk4, Cyclin D1和Rb基因的蛋白表达通过免疫组化法检测，并用RT-PCR法分析这几种基因在转录水平的表达情况。结果：细胞生长分析显示，在外源野生型P16基因转染膀胱癌细胞以后，癌细胞的增殖受到了抑制。从免疫组化结果来看，未转染P16基因的EJ细胞核中Cdk4强烈表达，Cyclin D1和Rb也呈阳性染色，但P16基因着色很浅；转染P16基因的癌细胞核中，Cdk4, Cyclin D1和Rb基因的蛋白表达为阴性，而P16基因的蛋白表达在细胞核和细胞质中都显着的增加。RT-PCR结果表明，转染P16基因的细胞中P16基因的转录显着增加，而另外叁种基因，Cdk4, Cyclin D1和Rb基因的转录则显着减少。结论：实验结果显示，将外源的野生型P16基因转染到人膀胱癌细胞中，对细胞的增殖产生了抑制作用。细胞中表达增加的P16蛋白抑制了细胞核中Cdk4, Cyclin D1和Rb<WP=7>蛋白的表达，使细胞周期被阻滞在G0/G1期。因此，外源的P16基因导入对膀胱癌细胞的恶性增殖具有负面作用，在今后的肿瘤基因治疗研究中具有重要地位。
沈瑞林[2]2009年在《肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体联合丝裂霉素C治疗膀胱癌的实验研究》文中研究说明第一部分肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体以及联合丝裂霉素C对人膀胱癌细胞作用的体外实验目的检测肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(Tumor necrosis factor relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)对人膀胱癌细胞株体外生长的抑制作用和凋亡作用,以及TRAIL联合丝裂霉素C(MMC)治疗膀胱癌的协同作用。方法人膀胱癌细胞株T24、5637体外培养。将T24、5637膀胱癌细胞接种至96孔培养板,培养24h后分别加入浓度为1、10、100μg/L的TRAIL,0.1、1.0、10.0mg/L的MMC,不同浓度TRAIL和MMC作用24h,采用噻唑蓝比色(4,5-dimethy thiazoleor 2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法分别检测膀胱癌细胞的生存率,并将单独用TRAIL、MMC与TRAIL联合MMC对膀胱癌细胞株T24、5637的生长抑制情况进行比较;将T24及5637膀胱癌细胞接种至12孔板,培育24小时后加入不同浓度的TRAIL、MMC、TRAIL联合MMC并作用12h,用流式细胞术检测不同处理组膀胱癌细胞的凋亡率和死亡率,并将单独用TRAIL、MMC与TRAIL联合MMC组进行比较。结果TRAIL能有效抑制人膀胱癌细胞株T24、5637的生长。①MTT实验结果:1、10、100μg/L的TRAIL对膀胱癌T24细胞的抑制率分别为26.4%、29.3%和37.7%,与无药物组比较差异有显着性(P＜0.01)。叁种浓度的TRAIL对膀胱癌5637细胞的抑制率分别为13.7%、21.9%和59.1%,1μg/L TRAIL组与无药物组比较差异无显着性(P＞0.05),10、100μg/L TRAIL组与无药物组比较差异有显着性(P＜0.01)。10.0mg/LMMC对膀胱癌T24、5637细胞的抑制率分别为36.0%、26.7%;而100μg/L TRAIL联合10.0 mg/L MMC组对膀胱癌T24、5637细胞的抑制率分别达到58.4%、90.7%,联合用药有明显的协同作用,与单纯100μg/L TRAIL组、单纯10.0 mg/L MMC组相比差异有显着性(P＜0.05)。②流式细胞术检测结果:100μg/L TRAIL引起膀胱癌T24、5637细胞的凋亡,凋亡率分别为20.1%、47.5%,与无药物组1.9%、5.1%的凋亡率相比差异有显着性(P＜0.01);10.0mg/L MMC对膀胱癌T24、5637细胞的凋亡率分别为13.1%、18.1%;而100μg/L TRAIL联合10.0 mg/L MMC组对膀胱癌T24、5637细胞的凋亡率分别达到41.5%、61.5%,两者有明显的协同作用,与单纯100μg/L TRAIL组、单纯10.0 mg/L MMC组相比差异有显着性(P＜0.05)。结论在体外实验中,①TRAIL能有效地抑制人膀胱癌细胞株T24、5637的生长,诱导人膀胱癌细胞株T24、5637凋亡;②TRAIL联合MMC抑制人膀胱癌细胞株T24、5637生长和诱导人膀胱癌细胞株T24、5637凋亡具有协同作用。第二部分Ad-TRAIL以及联合MMC对膀胱癌作用的在体实验目的:建立人膀胱癌细胞株T24 BALB/c-nu小鼠皮下移植瘤模型;在体研究真核表达载体Ad-TRAIL转染T24膀胱癌组织的效果及其对膀胱癌的治疗作用,以及联合MMC治疗膀胱癌的协同作用。方法:①人膀胱癌细胞株T24体外培养。6周龄免疫缺陷小鼠(BALB/c-nu)共5只。在超净台内将小鼠右侧前肢根部背侧皮肤用75%酒精消毒后皮下接种0.2ml浓度为1×10~7个/ml的T24人膀胱癌细胞株悬液,等上述接种小鼠的肿瘤长至直径1cm大小时,处死小鼠,切取肿瘤。再切开肿瘤,取质地均匀处组织,切成2mm~3,10～15mg大小,分别移植至40只6周龄BALB/c-nu小鼠右前肢根部背侧皮下,每只小鼠移植1块。移植方法:先用75%酒精消毒移植处皮肤,切一0.4cm大小的皮肤切口,分离皮下组织,将组织块植入皮下,0号线缝合皮肤切口。继续按常规饲养小鼠并观察注射部位的变化。②上述BALB/c-nu小鼠模型40只,肿瘤长到0.4～0.6cm后随机分成四组,分别为单用MMC组(A组):腹腔注射0.1g/L MMC(10μl/g体重),连续注射7d;瘤内注射5×10~8pfu/ml Ad空载体0.1ml×3处,分别注射于肿瘤的4、8、12点,1次/2d,共3次;单用Ad-TRAIL组(B组):腹腔注射PBS(10μl/g体重)×7d,瘤内注射5×10~8pfu/mlAd-TRAIL 0.1ml×3处,1次/2d,共3次;联合Ad-TRAIL和MMC组(C组):瘤内注射Ad-TRAIL同B组,腹腔注射MMC同A组;对照组(D组):腹腔注射PBS(10μl/g体重)×7d,瘤内注射5×10~8pfu/ml Ad空载体0.1ml×3处,1次/2d,共3次。给药结束2周后脱颈处死荷瘤鼠,测量小鼠体重,所荷肿瘤的直径和重量。取出肿瘤制成常规病理切片观察。用RT-PCR和Western blot测量肿瘤组织内TRAIL mRNA及TRAIL蛋白的表达水平。结果:①第一批5只小鼠,有3只荷瘤模型建立成功,至细胞注射后50d,3只小鼠荷瘤直径达0.6～1.0cm,并经病理组织学证实;第二批40只小鼠肿瘤模型建立全部成功,成瘤率达100%,移植后4周所有小鼠肿瘤直径在0.4～0.6cm。②四组小鼠给药前体重及所荷肿瘤平均直径差异无统计学意义(P＞0.05);给药结束2周后,A、B、C组所荷肿瘤直径和重量均显着小于D组(P＜0.001),而C组又显着小于A、B组(P＜0.01),B组又显着小于A组(P＜0.001);A、C组体重均显着小于D组(P＜0.01),而B组和D组差异无统计学意义(P＞0.05);肿瘤组织病理切片镜下观察,组织坏死由多到少依次为C组、B组、A组和D组;B、C组肿瘤组织内均有TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表达,且两组间表达相对量差异无统计学意义(P＞0.05),而A、D组则无TRAIL mRNA和TRAIL蛋白的表达。结论:①成功构建裸鼠人膀胱癌细胞株T24皮下移植瘤模型;②在体实验中,Ad-TRAIL能成功转染T24膀胱癌组织且表达TRAIL蛋白;③TRAIL对T24人膀胱癌裸鼠移植瘤具有明显的抑制作用,且TRAIL联合MMC具有协同抗膀胱癌作用。
牛忠杰[3]2013年在《HepaCAM在膀胱尿路上皮癌中的表达及作用机制》文中指出目的探讨膀胱尿路上皮癌的临床病理特征,检测膀胱尿路上皮癌组织中hepaCAM、P53、P21、Ki-67四种抗体的表达情况,比较hepaCAM与P53、P21及Ki-67在膀胱尿路上皮癌中的表达相关性,进而初步探讨hepaCAM在膀胱癌发生发展中的作用及可能的机制。方法1.实验收集从2011年至2013年天津医科大学第二医院天津市泌尿外科研究所病理科收检的有完整临床资料且病理证实的存档蜡块104例膀胱尿路上皮癌,其中低级别尿路上皮癌62例,高级别尿路上皮癌42例,非浸润性膀胱癌68例,浸润性膀胱癌36例。另外,取54例正常膀胱粘膜组织作对照,每例标本均进行HE切片由有经验的病理医师核实病理诊断后,制作组织切片。2.采用免疫组织化学染色方法检测膀胱癌中hepaCAM表达情况,分析其临床病理意义,并初步探讨hepaCAM在肿瘤发生过程中的作用。检测膀胱癌中P53、P21、Ki-67蛋白的表达情况,比较hepaCAM与P53、P21、Ki-67表达的相关性。初步研究hepaCAM抑制细胞增殖的可能机制。结果1.hepaCAM蛋白在膀胱尿路上皮癌组织中低表达,而在正常粘膜组织中高表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。在不同病理分级、临床分期中hepaCAM的表达不同,随病理分级的升高而下降(P<0.05),临床分期非浸润性尿路上皮癌(Ta-T1组)高于浸润性尿路上皮癌(T2-T4组)(P<0.05)。hepaCAM蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤数目等临床特征均无相关关系(P>0.05)。2.P53的表达随膀胱癌病理分级、临床分期的升高而增加(P<0.05)；P21的表达随膀胱癌病理分级、临床分期的增加呈递减趋势(P<0.05)；Ki-67的表达随病理分级、临床分期的升高呈递增趋势(P<0.05)。从spearman等级相关分析来看,hepaCAM与P53的表达呈负相关(r=0.612,P<0.05), hepaCAM与P21呈正相关(r=0.472, P<0.05), hepaCAM与Ki-67呈负相关(r=-0.442,P<0.05)。结论1. hepaCAM蛋白在膀胱正常粘膜组织中高表达,而在膀胱尿路上皮癌中低表达,并且随肿瘤分期、分级的升高,表达量随之下降。hepaCAM表达的下调可能在膀胱尿路上皮癌发生发展过程中发挥一定的作用,可作为判断肿瘤发生的指标之一,可能作为治疗肿瘤的靶向指标。2.通过spearman相关分析,hepaCAM与Ki-67呈负相关,进一步验证了hepaCAM具有抑制细胞增殖的特性。heapCAM与P53呈负相关,与P21呈正相关,推测hepaCAM可能通过P53/P21途径来抑制细胞增殖。
瞿长宝[4]2009年在《Scopadulciol在Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的实验研究》文中指出膀胱癌是我国泌尿外科最常见的肿瘤之一,占全身恶性肿瘤发病率的第八位,其特点是术后复发率高,严重威胁着人类的健康和生命。目前膀胱癌的治疗以手术切除为主,放、化疗为辅,但其疗效并不确定,特别是对于大多数中晚期膀胱肿瘤,尤其伴有局部扩散或远处转移者,目前的治疗效果均不理想。随着分子生物学技术及基因工程的发展,肿瘤的分子生物学机制得到进一步的阐明,肿瘤的基因治疗技术也随之迅速发展,为膀胱癌的治疗提供了一种新的且具有希望的手段。肿瘤的基因治疗是指在基因水平上通过载体系统将治疗基因导入肿瘤及其相关组织并有效表达从而达到治疗目的。肿瘤的基因治疗根据治疗机理不同,目前可分为免疫基因治疗、纠正性基因治疗、自杀基因治疗、反义核酸治疗、耐药基因治疗、联合基因治疗等。其中自杀基因(suicide gene)治疗备受关注,是一种有效和具有临床应用潜力的治疗策略。自杀基因治疗是将编码某些特定酶的基因导入肿瘤细胞,这些酶可将无活性或低毒的药物前体转化为具有较强细胞毒性的药物,从而杀死肿瘤细胞。HSV-tk/GCV是研究最为深入的一种自杀基因系统,HSV-tk酶可将GCV磷酸化为GCV一磷酸,继而在哺乳动物细胞TK酶的催化下最终转化为GCV叁磷酸,抑制DNA聚合酶的活性,掺入DNA合成,产生细胞毒性。而且研究发现该方法还具有“旁观者效应”,即转染细胞可以杀死附近未转染细胞的特性,从而弥补转染效率低的缺陷,发挥更强大的治疗作用。肿瘤细胞的无限增殖是恶性实体瘤的主要特性。肿瘤的无限增殖能力主要靠端粒酶的激活来不断地维持端粒的长度而达到的。端粒酶在大多恶性肿瘤细胞中处于激活状态而在正常细胞中却没有活性或者活性很低,是目前所报道最为广谱的肿瘤生物分子标记。人端粒酶逆转录酶(human telomerase transcriptase,hTERT)是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位,它的表达调控在转录水平上。利用hTERT启动子来调控病毒携带的目的基因,理论上可以使病毒选择在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达目的基因。我们以往的实验证明,与GCV联合作用下,hTERT启动子控制下的HSV-tk基因的表达能特异地杀伤膀胱癌253J细胞,而对正常细胞MRC-5无明显杀伤作用,且具有明显的旁观者效应;异种动物移植253J细胞后,HSV-tk/GCV系统对体内膀胱肿瘤的生长也有明显的抑制作用;Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对肿瘤的杀伤及抑制作用随着GCV剂量的增加而增强。但由于GCV的细胞毒性较大,使其临床应用将受到一定限制。在此基础上,我们设立本课题研究,在构建出hTERT启动子调控的携带自杀基因HSV-tk的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk基础上,通过体外和体内实验,将Scopadulciol(SDC)与Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,对其选择性杀伤肿瘤细胞的效果进行评估,观察SDC对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统肿瘤杀伤作用的增强效应,并对其抗肿瘤机制进行初步探讨。本实验共分叁个部分。一、hTERT启动子调控的HSV-tk基因重组腺病毒载体的构建目的:构建一种受hTERT启动子调控的、腺病毒介导的自杀基因转移系统Ad-hTERT-HSV/tk。方法:利用DNA重组技术,首先构建一种携带hTERT启动子和HSV/tk基因的重组腺病毒质粒,然后在293细胞包装成携带受hTERT启动子调控HSV/tk基因表达的重组腺病毒ad-hTERT-HSV/tk。同时构建CMV启动子调控的、携带自杀基因HSV/tk的重组腺病毒Ad-CMV-HSV/tk以及携带报告基因EGFP的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP作为对照。应用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取腺病毒DNA,对该4种病毒进行PCR鉴定。腺病毒的扩增及纯化采用293细胞及氯化铯纯化常规方法,病毒滴度测定采用TCID50法。结果:成功构建了4种重组腺病毒Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-EGFP和Ad-hTERT-EGFP,按需要在293细胞内扩增后以氯化铯密度梯度离心法进行纯化,TCID50法测得病毒滴度分别为4×1010pfu/ml,1×1011pfu/ml,1.2×1011pfu/ml和3.7×1010pfu/ml。二、Scopadulciol对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统杀伤253J细胞增效作用的体外试验研究目的:我们将SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,通过体外实验观察该系统对膀胱癌253J细胞的杀伤作用,深一步研究SDC对重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统在杀伤膀胱癌细胞中的增效作用。方法:(1)细胞培养:膀胱癌细胞253J培养取含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640培养基;人正常肺成纤维细胞株MRC-5取MEM培养基;置5%CO2孵箱中,饱和湿度及37℃培养。(2)观察SDC对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统体外杀伤膀胱癌细胞的增效作用:将253J以及MRC-5细胞分别接种于24孔板中,每孔3×104个细胞,将两种细胞分为6组,即Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC组、Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组、单纯Ad-hTERT-HSV-tk组、GCV+SDC组、单纯GCV组、单纯SDC组,空白对照以PBS替代。各组分别加入或不加入上述重组腺病毒(MQI=100),5%CO2孵箱37℃培养90分钟,更换完全培养液,24小时后分别加入5%血清培养液含GCV100μmol/L,含SDC0.1μmol或5%血清培养液含GCV100μmol/L或含SDC0.1μmol ,37℃,5%CO2孵箱培养,每种情况均重复3孔,继续培养48小时,四唑盐比色试验法(MTT)测定细胞生长存活率。(3)SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用:将生长良好的膀胱癌细胞253J以及正常的成纤维细胞MRC-5分别按1×104个细胞/孔接种于96孔板;培养24h后,按MOI=100加入Ad-hTERT-HSV-tk,每30min轻摇一次;24h后分别加入5%血清培养液含GCV(0、1、10、100、1000μmol/L),含SDC(0、0.04或0.1μmol), 37℃5%CO2孵箱培养;每3d换一次上述培养液,6d后,四唑盐比色试验法(MTT)测定细胞存活率,分别比较不同浓度的GCV、SDC杀伤效果的差异。(4)体外旁杀伤效应观察:将Ad-hTERT-HSV-tk按MOI=100转染253J细胞;24h后将上述肿瘤细胞和未转染Ad-hTERT-HSV-tk的肿瘤细胞以不同比例混合培养,共分5组(0、30%、50%、70%、100%);在5组253J肿瘤细胞培养液中分别加入GCV使其浓度为100μmol/L或浓度为100μmol/L的GCV联合应用SDC0.04μmol,空白对照组未按相同转染比例混合后以PBS替代GCV和SDC,每种情况重复3孔;6d后分别进行MTT测定细胞存活率,比较杀伤效果。结果:(1)重组腺病毒对253J和MRC-5细胞的转染效率倒置荧光显微镜下观察显示,加入重组腺病毒Ad-hTERT-EGFP,MRC-5细胞未见明显荧光表达。而Ad-hTERT-EGFP对253J细胞的转染率随重组腺病毒的MOI增高而增加,当MOI为0时,无荧光表达;MOI为1时,仅少数细胞有荧光(7.5%);MOI为10时,40.7%的253J细胞EGFP表达阳性;MOI=100时,88.3%的253J细胞EGFP表达阳性;MOI=1000时,所有细胞均出现荧光。提示Ad-hTERT-EGFP对两细胞的转染率有明显差异。(2)SDC对HSV-TK激酶作用的GCV在膀胱肿瘤基因治疗中的增效作用:Ad-hTERT-HSV-tk+GCV+SDC组253J细胞存活率明显低于MRC-5细胞(P<0.001);Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组253J细胞存活率亦低于MRC-5细胞(P<0.001);单纯Ad-hTERT-HSV-tk组、GCV+SDC组、单纯GCV组、单纯SDC组,对两种细胞株均无明显的杀伤作用。Ad-hTERT-HSV-tk + GCV + SDC组253J细胞存活率明显低于Ad-hTERT-HSV-tk+GCV组(P<0.01)。(3)SDC对不同配伍浓度的Ad-hTERT-HSV-tk和GCV对膀胱肿瘤细胞体外旁杀伤效应:以MQI=100的Ad-hTERT-HSV-tk感染253J细胞后,不同浓度的GCV联合应用不同剂量SDC,作用于253J细胞,结果显示,GCV联合应用SDC后,253J细胞的存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示Ad-hTERT-HSV-tk+GCV对253J细胞的杀伤作用随着GCV浓度的增加而逐渐增强的基础上,联合应用SDC后,对253J细胞的杀伤作用有明显增强作用。(4)体外旁杀伤效应的观察:tk阳性的253J细胞所占比例分别为0、30%、50%、70%、100%的几组253J细胞,经GCV和/或SDC作用后,结果提示,丙氧鸟苷在杀死tk阳性253J细胞的同时,也可以杀死与其共同培养的tk阴性253J细胞,随着tk阳性253J细胞比例的增加,混合细胞的存活数量明显减少(P<0.05);其联合应用SDC后,杀伤作用又有明显增强。叁、Scopadulciol对Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的体内实验研究目的:我们将SDC与我们构建的具有肿瘤特异性的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统联合应用,通过体内实验观察该系统对膀胱癌253J细胞的杀伤作用及抑制肿瘤生长作用,深一步研究SDC对重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统在杀伤膀胱癌细胞中的增效作用。方法:(1)裸鼠膀胱癌模型的建立及分组:将膀胱癌细胞用无菌生理盐水配成1×107细胞/ml的细胞悬液。在小鼠右前肢腋窝皮下注入0.2m1细胞悬液。观察小鼠肿瘤生长情况,当肿瘤生长至直径约为6mm和/或体积为100mm3时,将荷瘤裸鼠随机分为4组,每组4只, A组为Ad-hTERT-HSV/tk+GCV+SDC组;B组为Ad-hTERT-HSV/tk+GCV组;C组为Ad-hTERT-HSV/tk+SDC组;D组为对照组,裸鼠体内每天仅注射PBS。(2)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC治疗肿瘤的疗效观察:肿瘤生长抑制的观察:自注射药物开始,每7天用圆规和游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤的体积,描绘肿瘤的生长曲线,共观察6周。观察结束后处死裸鼠,解剖观察瘤体的大体形态,取对照组和治疗组的肿瘤组织称重。按(1-治疗组重量/对照组重量)×100%计算肿瘤生长抑制率。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC对荷瘤裸鼠膀胱癌的生长抑制的影响:BALB/C裸鼠皮下接种253J细胞2周后,可见所有的裸鼠均有肿瘤生长,成瘤率为100%,肿瘤直径约0.5cm-0.6cm。选用瘤体大小一致的裸鼠分组实验,可见C、D各组裸鼠肿瘤生长迅速,瘤的体积无显着性差异(p>0.05),根据肿瘤的体内生长曲线,C、D各组的肿瘤均呈持续快速生长,生长曲线大致相同(p>0.05);B组肿瘤生长受到明显抑制,与C、D两组相比,具有显着性差异(P<0.01);A组抑制肿瘤作用明显,随着治疗进展,肿瘤生长呈停滞或缩小趋势,与B组相比具有显着性差异(P<0.01),与C、D两组相比差异显着性更为明显(P<0.001)。结论1、本研究成功构建了分别由hTERT启动子和CMV启动子调控的携带HSV-tk基因和EGFP基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV/tk、Ad-CMV-HSV/tk、Ad-hTERT-EGFP和Ad-CMV-EGFP。对其进行纯化、扩增后具有较高滴度。2、通过体外实验证明,联合应用GCV情况下,hTERT启动子控制下HSV-tk基因的表达能特异地杀伤膀胱癌细胞253J,在此基础上,该系统联合应用SDC后,Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系统对膀胱癌细胞253J的杀伤作用又有了明显的增强。3、通过体内实验证明,联合应用SDC后,Ad-hTERT-HSV/tk/GCV系统对膀胱癌细胞253J的杀伤作用及对肿瘤生长的抑制作用也有明显的增强。
乔宝民[5]2003年在《PTEN基因过表达对移行上皮癌细胞系生物学行为的影响及膀胱癌组织PTEN基因突变的研究》文中认为膀胱癌为泌尿系统最常见的肿瘤，在西方是第5位常见的肿瘤，占所有癌症患者的4％，在癌症致死的患者中占2％。据估计，在2000年美国有31200人诊断为膀胱癌，12200人死于此病。膀胱癌的复发性和浸润性是影响治疗预后的主要原因。 随着分子生物学的发展及其在肿瘤中的应用，现认为肿瘤发生机制主要是原癌基因的激活和抑癌基因的失活导致细胞增殖失控及凋亡缺陷，所以，肿瘤被视为一种基因疾病。纠正肿瘤细胞中异常基因的行为，抑制癌基因的过度表达，增强抑癌基因的功能，将从分子水平治疗肿瘤。 近年来的研究表明，膀胱癌有染色体的遗传学改变，等位基因缺失常见于4p，8p，9p，9q，10q，11p和17p等，已经确认p53和p16为抑癌基因。最近，在肿瘤中同源性缺失的10q23.3位基因被克隆出来，被命名为PTEN。这个基因具有如下特点：1．在多种高分级癌中有突变。2．具有磷酸酶活性，与张力蛋白同源。3．在上皮细胞内富含且能被TGF-β调控。研究发现，PTEN在多种肿瘤中有突变和缺失，包括恶性黑色素瘤、脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌和头颈肿瘤等。PTEN被认为是一种新的抑癌基因，它具有双特异磷酸酶活性，能使作用底物的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸去磷酸化，调控细胞内信号传导通路。PTEN能够调控很多细胞的生长、粘附、迁移、浸润和凋亡等。PTEN在膀胱癌的研究目前刚刚开始，国外仅有PTEN在膀胱癌突变的报道，国内还无人涉及。 天津医科大学博士学位抢文 本课题用外源性野生型PTEN(wT一PTEN)、突变型pTEN(DN一PTEN)质粒对膀肤癌细胞系EJ进行转染，达到基因治疗的目的，初步研究了PTEN基因对膀肤肿瘤细胞生物学的影响，并将基因治疗与化学治疗联合治疗肿瘤，探讨了其临床应用价值。通过检测膀肤肿瘤组织中PTEN第5外显子、第8外显子的突变，证明了PTEN突变在膀肤癌中不是一个常见事件。通过检测膀耽肿瘤组织中PTEN、Bcl一2的表达，研究了PTEN、Bcl一2在膀肤癌的表达特点。本课题的完成，较为系统地研究了PTEN基因在膀胧癌细胞的独特作用，为以PTEN进行膀肤癌的基因治疗奠定了基础。第一部分WT一PTEN对膀肤癌细胞生物学行为影响的研究 实验采用含有磷酸酶活性的wT一PTEN一cDNA质粒PsvEGFP一PTEN、磷酸酶灭活的pTEN突变体psvEGFp一C124A质粒及psvEGFP空载质粒，这叁种质粒均没有抗生素抗性。另一个质粒为p一IRSE一Ve以or空载质粒含Amp和Hyg抗性。这四个质粒经过体外扩增并纯化，用脂质体转染法，利用脂质体LipofeetAMIN分别将p一IRSE一Veetor与psvEGFp一pTEN、psvEGFp一C124A、PSvEGFP共转染人膀肤癌细胞系EJ中，经Hyg筛选出有绿色荧光的阳性细胞克隆，将其命名为EJ一psvEGFp一pTEN(WT一pl’EN)、EJ一psvEGFP一e一24A(DN一PTEN)、EJ一psvEGFp(VEC)。通过免疫组化检测细胞浆pTEN蛋白的免疫原性和Westcm blot方法检测细胞克隆的PTEN蛋白水平，发现EJ一psvEGFP一PTEN、EJ一psvEGFp一C124A增加了pTEN蛋白水平表达，EJ一psvEGFp没有变化，证明psvEGFp一pTEN、psvEGFp一C124A质粒在EJ细胞内有效表达。 通过观察EJ一psvEGFp一pTEN、EJ一psvEGFP一C 1 24A、EJ一psvEGFp和EJ细胞的生长情况，发现转染wT一PTEN的EJ一psvEGFP一PTEN的生长速度减慢，第6天时，下降了42.7%(P<0.01)，而转染突变体和空载体的细胞和对照组EJ细胞生长速率无明显差别(均P>0.05)。以MTT法检测细胞增殖率，发现 天津医科大学博士学位论文第2天开始转染外源性WT一PTEN基因的细胞克隆生存活力明显低于对照空载体组、EJ和EJ一psvEGFp一C124A组(均p<0.01)，EJ一psvEGFp一C一24A组增殖活力没有减低。第6天wT一PTEN组的细胞克隆生存活力下降了40.11% (与转染空载组相比)。说明PTEN能够减慢肿瘤细胞的生长速度。 通过流式细胞仪检测细胞周期时相结果显示，wT一PTEN基因转染的EJ一psvEGFp一pTEN细胞GO/GI比例高于EJ一psvEGFp一C124A、EJ一psvEoFP和EJ细胞，而S期细胞比例低于其它细胞。WT一PTEN表达载体抑制EJ细胞增殖的作用表现为，引起GI*S期阻滞，细胞停滞于GI期，从而抑制细胞的生长，显示了较好的抗肿瘤作用。WT一PTEN抑制细胞生长的作用机制，可能与对PI3玲Akt信号转导通路有关。 在光学显微镜下观察到EJ一psvEGFP一PTEN(与Ej细胞相比)细胞体积变小，细胞大小比较一致，异型性低。在透射电镜下，EJ一psvEGFP一PTEN组细胞可看到明确的凋亡及凋亡小体。EJ一psvEGFP一C124A组细胞可以看到浸润力强的癌细胞，看不到核DNA溶解及使癌细胞凋亡的作用。EJ一psvEGFP组与EJ组癌细胞形态上类似，均看不到核DAN溶解及细胞凋亡。表明wT一PTEN质粒转染EJ后，细胞核DNA受到破坏、溶解，增加了癌细胞凋亡，显然有明显抗癌作用。 Boyden ehamber体外浸润实验结果显示:EJ一psvEGFp一pTEN组细胞穿过Matrigel胶的细胞数少于EJ一psvEGFp一C 1 24A、EJ一psvEGFp、EJ的细胞数 (均P<0
严辉[6]2010年在《GKLF基因对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的实验研究》文中研究指明第一部分GKLF、IKLF在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及意义目的:研究胃癌组织和胃癌细胞株中GKLF、IKLF的表达及临床意义。方法:采用荧光实时定量PCR法检测胃癌组织和胃癌细胞株中GKLF mRNA、IKLF mRNA的表达,免疫组织化学法(IHC)检测胃癌组织及其远端正常胃组织中GKLF、IKLF蛋白的表达,Western blot和免疫细胞化学法(ICC)检测人正常胃上皮细胞株GES-1及胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、HGC-27中GKLF、IKLF蛋白的表达。结果:胃癌组织中GKLF mRNA的相对表达量明显低于远端正常胃组织、IKLF mRNA的相对表达量明显高于远端正常胃组织(P <0.05)、胃癌组织中GKLF mRNA、IKLF mRNA的表达水平与组织分化程度无关,GKLF蛋白总阳性率显着低于远端正常胃组织、IKLF蛋白总阳性率显着高于远端正常胃组织(P <0.05),GKLF、IKLF蛋白表达与胃癌患者的年龄、性别、分化程度、Lauren分型无关,与淋巴结是否有转移及pTNM分期有关(P <0.05);胃癌细胞株中GKLF mRNA和蛋白的相对表达量低于人正常胃上皮细胞株GES-1、IKLF mRNA和蛋白的相对表达量则高于细胞株GES-1(P <0.05)。结论:胃癌组织和胃癌细胞株中存在GKLF低表达、IKLF高表达,GKLF、IKLF在胃癌发生、发展中起一定的作用,检测GKLF、IKLF的表达有助于判断胃癌患者病情程度和预后。第二部分重组质粒pcDNA3.1-GKLF的转染及稳定细胞株的建立目的:建立高表达GKLF的稳定转染细胞株,以进一步观察其对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为的影响。方法:用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1-GKLF转染人胃癌细胞株SGC-7901,通过G418筛选,建立稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株,用荧光实时定量PCR法、Western blot和ICC法检测GKLF mRNA和蛋白的表达。结果:建立了稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株,成功地表达目的基因。结论:成功建立稳定转染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF细胞株,为下一步探讨GKLF基因对胃癌生物学行为影响的体内外实验研究奠定基础。第叁部分GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的体外实验研究目的:体外观察外源性GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901增殖活性和侵袭力的影响,探讨GKLF在胃癌中的作用机制。方法:应用MTT法(四甲基偶氮唑蓝比色法)、流式细胞仪、克隆形成实验和体外细胞侵袭实验分别研究GKLF基因转染前、后人胃癌细胞株SGC-7901增殖和侵袭活性的变化。RT-PCR法、Western blot法分别检测GKLF基因转染前、后人胃癌细胞株SGC-7901中细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Ki-67、E-钙粘附分子(E-cadherin) mRNA和蛋白的表达。结果:与SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组相比,SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组细胞生长速度减慢、细胞出现G0/G1期部分阻滞、克隆形成率低、细胞侵袭力明显减弱(P < 0.05)。SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组细胞Cyclin D1、Ki-67、E-cadherin mRNA和蛋白的表达水平均低于SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组(P <0.05)。结论:GKLF基因可能通过下调Cyclin D1、Ki-67、E-cadherin的表达,而使人胃癌细胞株SGC-7901的增殖活性和侵袭力降低。第四部分GKLF基因转染对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为影响的体内实验研究目的:体内观察外源性GKLF基因转染对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长、转移的影响,并探讨GKLF在胃癌中的作用机制,从而为胃癌的基因治疗提供新的思路。方法:选用36只BALB/C-nu/nu裸鼠进行体内实验,分两批进行。每批裸鼠18只,各随机分为叁组,每组分别注射等量的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF、SGC7901-pcDNA3.1和SGC-7901细胞(2×107个/200μl/只)。第一批,将细胞注射于每只裸鼠右胁腹前肢皮下,接种6周后处死裸鼠,观察肿瘤生长状况、成瘤潜伏期,IHC法检测裸鼠皮下移植瘤组织内GKLF、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表达情况,测定皮下移植瘤组织中MVD值;同时用B超观察皮下移植瘤大小、血流信号及腹腔内转移情况。第二批,将细胞经尾静脉接种于裸鼠,接种6周后处死裸鼠,显微镜下观察有无肺转移。结果:与SGC-7901组和SGC7901-pcDNA3.1组相比,SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组成瘤潜伏期延长、皮下移植瘤体积和瘤重较小(P <0.05),皮下移植瘤组织内GKLF蛋白表达升高、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表达均降低,微血管密度(MVD)值降低。B超显示:SGC7901-pcDNA3.1-GKLF组皮下移植瘤较小,血流信号I级。所有裸鼠均未见肺、腹腔转移。结论:GKLF基因可能通过下调Ki-67、E-cadherin、VEGF的表达,从而抑制肿瘤的生长,减少肿瘤中新生血管的生成,以GKLF为靶点的基因治疗有潜在的临床应用前景。
佚名[7]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中研究说明14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
蔡智[8]2013年在《RASSF1A基因转染对骨肉瘤细胞株MG63细胞增殖、凋亡的作用研究》文中研究表明目的：RASSF1A是一种新型候选抑癌基因,其抑癌作用见于人类多数肿瘤中。本研究探讨抑癌候选基因RASSF1A转染对骨肉瘤细胞株MG-63细胞增殖、凋亡的作用,进一步证实该基因的抑癌作用及作用机制,为新型基因替代疗法运用于临床提供实验基础与理论依据。方法：1.构建pCDNA3.1(+)-RASSF1A并鉴定,将空质粒载体及含RASSF1A基因的重组载体运用“脂质体转染法”转染到骨肉瘤MG-63细胞株中。2. western-blot检测基因转染组、空质粒组及空细胞组叁者中RASSF1A蛋白的表达水平。3.在基因转染后的24h,48h,72h,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分别检测基因转染组、空质粒组及空细胞组叁者细胞的增殖情况。4.在基因转染后的24h,48h,72h,原位末端标记法(TUNEL)检测基因转染组、空质粒组及空细胞组叁者细胞的凋亡情况。结果：1. RASSF1A基因可在骨肉瘤细胞株MG63中成功转染,pCDNA3.1(+)-RASSF1A在骨肉瘤细胞MG63中构建成功。2.导入RASSF1A基因后,骨肉瘤细胞株MG63中出现RASSF1A蛋白表达现象,而对照组未出现蛋白表达,证实骨肉瘤细胞中存在RASSF1A的表达缺失。3.RASSF1A基因转染后肿瘤细胞株生长增殖过程明显受到抑制,细胞增殖生长速度明显降低,与空质粒组及空细胞组相比有统计学意义(p<0.05)。4.RASSF1A基因转染后肿瘤细胞株出现凋亡细胞增加,细胞凋亡指数明显高于空质粒与空细胞组,差异具有显着统计学意义(p<0.05)。结论：RASSF1A真核表达载体可在骨肉瘤细胞株MG-63中成功转染,肿瘤细胞株中存在RASSF1A表达缺失现象,RASSF1A基因转染后可发挥抑癌作用,其作用机制可能与抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡有关。图10副,表8个,参考文献26篇。
苏涛[9]2005年在《hTERT启动子诱导TRAIL基因靶向表达治疗涎腺肿瘤的实验研究》文中研究说明肿瘤基因治疗是近年来的研究热点,其中通过转基因恢复肿瘤细胞的凋亡程序是一项有意义的策略,但基因治疗缺乏靶向性在一定程度上限制了其在临床上的应用。端粒酶作为肿瘤治疗的新靶点,在85%以上的人肿瘤细胞和永生化细胞具有高活性,其最主要的成分——人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子能有效地诱导抗肿瘤基因在肿瘤细胞中高效、靶向表达。我们在国内外首次应用免疫组织化学技术对涎腺肿瘤——腺样囊性癌的端粒酶表达情况进行研究,证实其高表达端粒酶活性,然后利用含有hTERT 启动子的真核表达质粒载体pACTERT-TRAIL 和腺病毒载体AdTERT-TRAIL 转染腺样囊性癌细胞株SACC-83 细胞,证明hTERT 启动子确能在SACC-83 细胞中靶向表达促凋亡基因——TRAIL 基因,并诱导肿瘤细胞凋亡,同时还能消除促凋亡基因对正常细胞的毒性。这对我们下一步进行动物体内抑瘤实验,及研究对其他涎腺肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础。
袁晓奕[10]2009年在《LRIG3基因在膀胱尿路上皮癌中的表达及重组腺病毒载体rAd-LRIG3感染T24细胞的实验研究》文中进行了进一步梳理近年来研究发现，LRIGs基因家族在多种肿瘤中具有抑癌作用，其可能的机制是下调EGFR的表达，从而抑制EGF对人体肿瘤所带来的促细胞增殖、侵袭等作用。但其在膀胱癌中的作用报道甚少，本研究检测了LRIG3基因及蛋白在膀胱癌中的表达，并将其重组腺病毒质粒感染人膀胱癌T24细胞系，观察了LRIG3对T24细胞生长、凋亡及迁移的影响等，分叁个部分简述如下。第一部分LRIG3蛋白及基因在膀胱肿瘤中的表达及意义目的：了解LRIG3蛋白及基因在膀胱肿瘤和正常膀胱组织中的表达及其与膀胱肿瘤不同分级、分期之间的关系。方法：采用免疫组化SP法和逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)法检测64例膀胱尿路上皮癌组织和12例正常膀胱粘膜中LRIG3蛋白及mRNA的表达情况，并结合临床资料进行分析。结果：膀胱癌组织中LRIG3蛋白和mRNA的表达水平显着低于正常膀胱黏膜组织；且分级和分期越高，LRIG3蛋白和mRNA的表达水平越低。结论：LRIG3基因在膀胱癌中存在表达缺失和低表达，提示LRIG3基因在膀胱癌的发生发展中可能具有抑癌基因的作用，有可能成为肿瘤基因治疗的又一靶点。第二部分LRIG3基因特异性腺病毒表达载体的构建与鉴定目的：构建并鉴定含有LRIG3基因的腺病毒表达载体rAd-LRIG3，并感染人膀胱癌细胞T24，为后期检测LRIG3对膀胱癌生物学行为的影响提供靶细胞。方法：通过质粒提取、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术，从感受态大肠杆菌DH5α菌株中提取并大量制备pLRIG3-EGFP真核表达质粒，然后对其行限制性内切酶酶切、凝胶电泳法进行鉴定。测序正确后，利用腺病毒载体系统Adeno-X构建重组腺病毒质粒pAd-LRIG3，酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒，鉴定正确后，将pAd-LRIG3转染至HEK293细胞，包装成复制缺陷型腺病毒质粒rAd-LRIG3。大量扩增rAd-LRIG3，测病毒滴度。实验分为叁组：实验组(T24-LRIG3组，感染rAd-LRIG3)、对照组(T24组，未感染腺病毒质粒)和感染空载体组(T24-HK组，感染rAd-HK)。感染48小时后，应用RT-PCR及Western-Blotting鉴定该质粒在细胞中是否得到表达。结果：酶切分析、测序鉴定表明rAd-LRIG3构建成功；RT-PCR及W-B分析表明，T24-LRIG3组中LRIG3mRNA及蛋白的表达水平较T24-HK组和T24组明显升高，差异有显着性(P＜0．05)。结论：携带有LRIG3基因的重组腺病毒构建成功；建立了rAd-LRIG3感染人膀胱癌细胞T24的长期稳定细胞系。可能为寻找膀胱癌的有效基因治疗途径奠定基础。第叁部分LRIG3基因对膀胱癌细胞T24生物学行为的影响目的：研究LRIG3基因对膀胱癌细胞T24生物学行为的影响。以判断LRIG3基因在膀胱癌的发生和进展方面是否具有作用；进而说明LRIG3基因是否是膀胱癌病因学中的一个抑癌基因。方法：利用重组腺病毒质粒rAd-LRIG3感染膀胱癌细胞T24，得到稳定细胞株T24-LRIG3，细胞计数并绘制细胞生长曲线；Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况；细胞迁移实验观察感染后细胞侵袭能力的变化。实验分为叁组：实验组(T24-LRIG3组，感染rAd-LRIG3)、对照组(T24组，未感染腺病毒质粒)和感染空载体组(T24-HK组，感染rAd-HK)。结果：MTT法观察显示，感染rAd-LRIG3后细胞生长增殖速度较未感染组和空载体感染组明显减慢；Hoechst33258染色及透射电镜显示部分细胞呈现凋亡形态学改变；流式细胞仪定量检测表明感染LRIG3基因后，T24细胞出现较为明显的凋亡峰；细胞迁移力显着低于未转染组和空载体转染组。结论：LRIG3基因能有效抑制膀胱癌细胞的生长增殖和迁移，并诱导细胞的凋亡，是膀胱癌病因学中的一个抑癌基因。将来可望为膀胱癌的基因治疗提供新方法。
参考文献：
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[4]. Scopadulciol在Ad-hTERT-HSV-TK/GCV系统对膀胱癌治疗中增效作用的实验研究[D]. 瞿长宝. 河北医科大学. 2009
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[8]. RASSF1A基因转染对骨肉瘤细胞株MG63细胞增殖、凋亡的作用研究[D]. 蔡智. 中南大学. 2013
[9]. hTERT启动子诱导TRAIL基因靶向表达治疗涎腺肿瘤的实验研究[D]. 苏涛. 吉林大学. 2005
[10]. LRIG3基因在膀胱尿路上皮癌中的表达及重组腺病毒载体rAd-LRIG3感染T24细胞的实验研究[D]. 袁晓奕. 华中科技大学. 2009
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