罗东林[1]2006年在《GR及NF-κB在严重创伤休克大鼠肝损伤中的作用及其机理》文中进行了进一步梳理严重创伤失血性休克与多脏器功能衰竭的关系十分密切,肝脏在多脏器功能衰竭的发生中起着重要作用。创伤性休克后,肝细胞的损害和功能改变,必然导致机体对应激调节功能的改变。因此,研究创伤休克后肝功能不全的发病机理具有重要意义。如果能够在肝功能损害出现之前进行及时、有效、正确的调控,就可以在很大程度上防止严重创伤后肝功能不全、甚至全身继发性损害和严重并发症的发生。GC(Glucocorticoid, GC)效应是机体最为重要的应激反应之一, GC与其GR(Glucocorticoid receptor, GR)结合后,可引起广泛的生物学效应,如抗炎、抗过敏、抗休克。GR是GC效应发挥的关键环节。研究发现,严重创伤可以引起机体GR的表达和功能发生改变;HSP在严重创伤后机体组织器官、细胞的抗损伤方面发挥重要作用, HSP(Heat shock protein, HSP)是GR的一种重要的伴侣蛋白,影响着GR活性和功能;NF-κB(Nuclear factor-kappa B, NF-κB )可诱导多种与免疫和炎症相关的细胞因子和其它相关基因的转录和表达,进而对严重创伤后组织器官造成损害。在免疫应答和炎症反应的调控中, GR和NF-κB是一对功能上起着完全相反作用的转录调节因子,GR可抑制NF-κB诱导的免疫和炎症相关基因的表达,发挥免疫抑制和抗炎功能。然而,在严重创伤休克时,GR、HSP、NF-κB在肝组织中的变化,以及与创伤后肝脏继发性损害与抗损害的关系,它们是否参与了创伤性休克的发生、发展,在创伤休克后肝功能不全发病机理中的作用如何,以及相互关系方面的研究报道较少。本实验通过双侧股骨骨折伴失血性休克实验模型,从肝组织细胞受体水平,观察GR、HSP70及NF-κB的变化,并以阻断GR、抑制NF-κB以及地塞米松对其影响为切入点,深入研究了它们之间的相互作用,初步阐明严重创伤休克时,GR与NF-κB在肝组织细胞抗损伤与损伤中的作用及其机制,为严重创伤休克后肝功能不全的发生机理提供了实验依据。主要实验方法:1.建立了大鼠双侧股骨骨折伴失血性休克致严重创伤性休克模型;建立了阻断GR致严重创伤休克模型;建立了抑制NF-κB致严重创伤休克模型。2.通过免疫印迹(Western blot)方法检测了创伤休克后肝组织胞浆GR、HSP70、
李臻琰[2]2011年在《脑红蛋白及热休克蛋白60在脑挫裂伤病理过程中的作用研究》文中研究指明研究背景脑挫裂伤是常见的神经外科疾病,是当今威胁人类生命的主要疾病之一。在医学不断进步的今天,脑挫裂伤的致残、致死率却一直居高不下,至今仍没有一项十分有效的治疗方法。因此,从脑挫裂伤发病机制出发,研究其致病因子对于临床实践十分重要。脑红蛋白(Neuroglobin, Ngb)是新近发现的一种主要位于神经元内、能够可逆性结合氧的球蛋白,它是一个新的内源性神经保护因子。目前研究表明,Ngb对脑缺血缺氧具有保护作用。热休克蛋白60(Heat Shock Protein60, HSP60)主要定位于细胞线粒体内,生理状态下,HSP60协助细胞多肽或蛋白质正确转位、折迭和装配,当受到不良刺激时,HSP60的表达明显增加,维持细胞内必需蛋白质的空间构象,从而保护细胞生命活动,确保细胞生存。为了探究Ngb及HSP60在脑挫裂伤的病理过程中所起的作用,我们做了一些研究。本课题共分为叁个部分：第一章脑挫裂伤患者脑组织及血中白细胞差异蛋白质组的表达；第二章Ngb及HSP60在脑挫裂伤患者脑组织中的表达；第叁章Ngb及HSP60在脑挫裂伤患者血清中的表达。第一章脑挫裂伤患者脑组织及血中白细胞差异蛋白质组的表达目的：通过双向凝胶电泳技术建立脑挫裂伤组和正常对照组分辨率高、重复性好的脑组织及血中白细胞蛋白质表达图谱,寻找差异表达的蛋白质点,探讨其功能和作用。方法：分别采集10例脑挫裂伤患者和10例正常脑组织及血液标本,应用淋巴细胞分离液分离白细胞,再运用二维凝胶电泳技术提取脑组织及白细胞的蛋白质,用PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,MADLI-TOF和生物信息学技术对其进行鉴定和分析。结果：通过PDQuest7.0分析软件进行点检测,分别获得脑组织及白细胞的蛋白质点数,在脑组织部分：正常组为(764+28)个,脑挫裂伤组(753±19)个。通过和正常对照组进行比较,可发现：脑挫裂伤组中表达上调的蛋白质点有15个,表达下调的蛋白质点有16个。经过与蛋白质数据库比较及质谱技术分析,取9个差异蛋白点进行了鉴定。结果显示,在9个蛋白质点中有7个蛋白质点得到鉴定,它们为硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx),泛素羟基端水解酶L1(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase isozyme L1, UCH-L1),脑红蛋白(Neuroglobin, Ngb), NSFL1辅助因子p47(NSFL1cofactor p47),微管蛋白α链(Microtubulin alpha chain),二氢嘧啶酶相关蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2),突触小体膜联合25K蛋白(Synaptosomal associated25K protein)。在白细胞部分：正常组为(572±18)个,脑挫裂伤组(518±16)个。与正常组比较分析,脑挫裂伤组中表达上调的蛋白质点有21个,表达下调的蛋白质点有17个。经过与蛋白质数据库比较及质谱技术分析,取9个差异蛋白点进行了鉴定。结果显示,在9个蛋白质点中有6个蛋白质点得到鉴定,它们为钙网织蛋白前体(Calreticulin precursor)、热休克蛋白60(Heat Shock Protein60, HSP60)、钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase)、脂酰辅酶A脱氢酶(Fatty acyl-coa dehydrogenase)、谷氨酸脱氢酶前体(Glutamate dehydrogenase precursor)和醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)。结论：1、通过双向凝胶电泳技术初步建立了脑挫裂伤组及正常对照组脑组织及白细胞蛋白质组表达图谱；2、经过凝胶图像分析,脑挫裂伤组及正常对照组脑组织及白细胞二维凝胶电泳图谱的表达具有明显差异；3、经过与蛋白质数据库比较及质谱技术分析,鉴定出的差异蛋白质有可能通过细胞分裂、细胞信号传导、蛋白质降解通路、氧化还原反应等参与脑挫裂伤的病理过程,其中Ngb及HSP60在脑挫裂伤的病理过程可能起着重要作用。第二章脑红蛋白及热休克蛋白60在脑挫裂伤患者脑组织中的表达目的：应用免疫组织化学方法检测脑挫裂伤患者组及正常对照组脑组织中Ngb及Hsp60的表达,研究Ngb及Hsp60在脑挫裂伤患者组及正常对照组的表达差异,评价Ngb及Hsp60在脑挫裂伤的病理过程的作用。方法：采用SP法,按照北京中杉金桥生物技术有限公司提供的SP试剂盒说明书进行。本研究切取10例成年脑挫裂伤患者(受伤部位均为右额叶)额叶皮层组织标本,以10例成年脑室肿瘤患者行肿瘤切除术取得的正常额叶皮层组织标本为正常对照。然后按照SP试剂盒说明书进行切片、脱蜡及水化、漂洗及蒸馏水洗涤、微波修复、加入一、二抗孵育、光镜下观察、苏木素衬染、树胶封片、光镜下观察切片染色情况并拍照。结果：1.免疫组化检测结果显示Ngb表达定位于胞浆内,胞浆内浅棕色物质即为Ngb检测阳性。在正常脑组织中Ngb呈弱阳性表达,脑挫裂伤灶脑组织呈阳性表达；而挫裂伤灶周围接近正常的脑组织中Ngb表达呈强阳性,与正常对照组比较有显着性统计学意义(P<0.05)。2.免疫组化检测结果显示HSP60表达定位于胞浆内,胞浆内浅棕色物质即为HSP60检测阳性。在正常脑组织中HSP60呈阳性表达,在脑挫裂伤灶脑组织呈阳性表达,而脑挫裂伤灶周围接近正常的脑组织中HSP60表达呈强阳性,与正常对照组比较有显着性统计学意义(P<0.05)。结论：脑挫裂伤灶周围接近正常的脑组织Ngb及HSP60表达呈强阳性,提示Ngb及HSP60在脑挫裂伤病理过程中发挥了重要作用。第叁章脑红蛋白及热休克蛋白60在脑挫裂伤患者血清中的表达目的：应用免疫印迹方法检测脑挫裂伤患者组及正常对照组血清中Ngb及HSP60的表达,研究Ngb及HSP60在脑挫裂伤患者组及正常对照组血清中的表达差异,评价Ngb及HSP60在脑挫裂伤的病理过程的作用。方法：参照《现代细胞分子生物学技术》操作。10例脑挫裂伤患者血清均为脑外伤后未经手术治疗患者的血清,正常人血清由年龄和性别匹配的10例志愿者提供。血清样本稀释10倍后,测定蛋白质的浓度,再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移至PVDF膜上,以一抗、二抗孵育,用ECL试剂发光及显影,并以胶中非目的蛋白质条带作为上样量对照。再经扫描获取图像,用图像分析软件确定其灰度值,分析特异蛋白的表达水平。结果：1.在正常人血清中Ngb呈低表达；脑挫裂伤后3小时血清中Ngb表达升高,在12小时后Ngb达到峰值,其后表达逐渐下降,72小时后Ngb表达恢复至正常。脑挫裂伤后6h及12h Ngb表达与对照组比较有显着性统计学差异(P<0.05).2.在正常人血清中HSP60呈低表达；脑挫裂伤后3小时血清中HSP60表达升高,直到72小时后才到峰值。脑挫裂伤后24h、48h及72h HSP60表达与对照组比较有显着性统计学差异(P<0.05)。结论：本章实验结果显示,经免疫印迹检测脑挫裂伤患者血清中Ngb及HSP60的表达增强,与正常对照组比较差异有显着统计学意义,提示Ngb及HSP60在脑挫裂伤病理过程中发挥了重要作用。综上所述,本研究结论如下：本系列研究通过蛋白质组学及免疫组化、免疫印迹手段研究脑挫裂伤后人脑组织及血清中蛋白质表达,得出如下结论：通过蛋白质组学和免疫组化、免疫印迹方法的研究,证明了Ngb和HSP60在脑挫裂伤病理生理过程中发挥着重要作用,Ngb和HSP60可以作为脑挫裂伤血液中的分子标志物；其机制值得进一步深入探讨。
王波, 胡丹[3]2009年在《糖尿病与非糖尿病急性创伤患者热休克蛋白72不同表达对预后的影响》文中指出目的:研究糖尿病和非糖尿病急性创伤患者应激早期各时段热休克蛋白72(HSP72)编码基因的表达和对预后的影响。方法:随机选取收入ICU的A-PACHEIll评分≥18分的患者38例,分为糖尿病组和非糖尿病组,分离创伤后0~1 d、2~6 d、7~14 d的中性粒细胞,RT-PCR方法检测HSP72m RNA含量,比较各组间的变化,记录患者2个月存活率,研究HSP72增高与预后的关系。结果:HSP72在急性应激后表达明显增强,表达高峰在2~6 d,非糖尿病患者组较糖尿病组,HSP72的表达水平明显增高,且存活率较高。结论:HSP72的基因水平检测可以作为判断重症患者预后的客观指标。
商宏伟[4]2005年在《大鼠体外循环后肠粘膜屏障功能障碍及谷氨酰胺保护作用机制研究》文中进行了进一步梳理背景与目的 体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)对机体是一种全身性的强刺激,能引起机体产生应激反应。应激引起的过度的炎症反应造成组织损害、多器官功能障碍(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),是心脏外科术后死亡的主要原因。CPB过程中器官保护是心血管外科基础临床研究热点之一。一直以来,人们对CPB所致的心、脑、肺、肾等重要器官的研究较多,也比较深入,而其对肠屏障功能影响及其机制缺乏深入系统研究。肠道是应激反应的中心器官和重要靶器官之一。因此研究CPB过程中肠屏障损伤的发生机制及探讨相应的保护措施具有极其重要的临床意义。 肠屏障功能目前认为包括四个方面:物理屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障。黏膜上皮细胞(intestine epithelial cell,IEC)是肠屏障功能的核心。以往认为肠上皮细胞坏死是创伤后造成肠粘膜结构破坏、屏障功能受损的细胞学基础,但是最近研究表明细胞凋亡在维持肠粘膜细胞稳态中起重要作用。但是肠粘膜细胞凋亡与肠屏障功能改变的关系还未确定。目前各领域对肠屏障功能的研究多集中肠上皮细胞本身,而对细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的研究则很少涉及。IEC基底膜主要由层粘连蛋白(laminin,LN)和Ⅳ型胶原组成,基底膜之下是间质性ECM,富含有Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维结合蛋白以及多种蛋白多糖。ECM在维持肠粘膜正常的结构和功能中起重要作用。和所有细胞一样,IEC不仅引起基质的反应,也能合成和降解基质。粘膜损伤之后的愈合和重构中ECM可能起着关键作用,屏障功能损害时ECM组成以及相关酶活性是否发生变化,值得深入研究。ECM构成的变化主要与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及其特异性组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)活性有关。正常情况下,肠粘膜组织MMPs/TIMPs系统处于动态平衡状态,参与ECM正常代谢和更新。研究表明,创伤、炎症反应和恶性肿瘤等病理状况下,MMPs和TIMPs之间的这种平衡将被打破,引起ECM的结构和组成的改变。研究表明CPB可以诱导MMP-9的合成和释放,导致血清中MMP-9水平升高,并提出MMP-9释放增加和活性增强可能引起术后早期组织稳态的改变。因此推测CPB过程中肠源性MMPs/TIMPs系统变化可能在IEC凋亡和肠屏障功能障碍的病理发生中起到重要作
王鹤[5]2007年在《热休克蛋白70系列对应激性溃疡的保护作用》文中研究说明目的：研究热休克蛋白70(Heat shock protein 70，HSP70)表达是否随应激性胃黏膜溃疡病程的进展而变化，同时探讨HSP70表达水平与病人预后的相关性。方法：收集30例收入ICU的APACHEⅢ评分大于18分的应激性溃疡出血患者(根据病情轻重分为1、2、3期)及30例择期手术术前患者的胃液及外周血，采用TRIzol一步法提取胃黏膜脱落细胞及外周血白细胞总RNA,然后采用半定量RT-PCR检测HSP70的转录；采用免疫组化技术检测外周血白细胞HSP70的表达，同时记录病人2个月存活率。结果：①应激性溃疡病人各期的HSP70表达明显高于对照组(血0.5160±0.2737，胃液0.5890±0.3211)的表达(P＜0.05)，应激性溃疡病人2期(血1.0490±0.2807，胃液1.1079±0.4397)HSP70表达显着高于1期(血0.7019±0.2347，胃液0.8617±0.3634)和3期(血0.6801±0.2559，胃液0.8507±0.3688)(P＜0.05)，而1期和3期之间无统计学差异(P＞0.05)；②存活组与死亡组比较，HSP 70表达水平较高，2期期间比较有显着性差异(F=7.878，P＜0.01)，3期期间比较也有差异(F=4.260，P＜0.05)，1期期间比较无统计学意义(F=2.874，P＞0.05)。③高评分组与低评分组比较，叁期期内均无统计学差异(1期内F=0.155，P＞0.05；2期内F=0.025，P＞0.05；3期内F=0.243，P＞0.05)。结论：①应激性溃疡时患者外周血细胞和胃液脱落细胞均可检测到HSP70的表达，HSP70表达的高峰期在溃疡最严重时期；②存活组胃液脱落细胞及外周血细胞HSP70的水平较死亡组的明显增高，应激后HSP70表达的增强，预示病人存活的可能性大。
孙晓川[6]2004年在《弥漫性轴索损伤的实验研究和影像学研究》文中进行了进一步梳理目的：1. 对轴索损伤后轴突超微结构的变化进行观察，并探讨其病理学意义；2. 观察轴索损伤后相应神经元及少支胶质细胞HSP70表达的变化及热应激对其表达的影响，探讨HSP70的神经保护作用。方法：实验研究分为两部分：一、实验性轴索损伤的超微结构研究。15只雄性Wistar大鼠被分为对照组（3只）和实验组（12只），实验组大鼠右侧视神经受牵拉致伤，分别于伤后2小时、4小时、24小时和7天各处死动物3只。电镜下观察视神经轴索超微结构的变化。二、热应激对轴索损伤保护作用的实验研究。57只健康雄性Wistar大鼠随机分为4组：正常对照组（A组）3只、单纯视神经牵拉伤组（B组）18只、单纯热应激处理组（C组）18只、热应激预处理牵拉伤组（D组）18只。对B组动物右侧视神经施予牵拉，热应激处理应用于C组动物，D组动物热应激预处理24小时后再对右侧视神经施予牵拉，B、C、D组分别在4h、8h、16h、1d、3d、5d各处死动物3只。利用光镜对视神经、视网膜节细胞、视神经少突胶质细胞进行形态学观察，采用SABC法进行免疫组化染色，检测节细胞及少突胶质细胞HSP70表达的光密度值（OD值），对结果行t检验分析组间差异。
孙志刚[7]2009年在《热休克蛋白70在手术创伤中表达及作用的实验研究》文中研究表明目的:检测大鼠不同程度手术创伤中血淋巴细胞HSP70(Heat ShockProtein,HSP70)的表达水平,研究HSP70与手术创伤及创伤致内环境改变之间的关系,探讨HSP70在手术创伤及内环境稳态中的作用。方法:1.动物模型建立:雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为四组:(1)对照组(G0组):大鼠不作任何手术处理;(2)实验组分别为:①轻度创伤组(G1组):大鼠肝脏左外叶切除组;②中度创伤组(G2组):大鼠肝脏左外叶和右叶切除组;③重度创伤组(G3组):大鼠肝脏左外叶、右叶和乳头叶切除组;每组20只,在5个时间点进行分批处理大白鼠(每时间点均为20只),每组大鼠在同样的环境中饲养,不同组间及时间点间大鼠体重、年龄无差异。2.指标检测:分别采取对照组和手术各组术前12h、术后2h、12h、24h、48h血液标本,用流式细胞仪检测血淋巴细胞HSP70水平,用血气分析仪检测动脉血PH、HCO_3~-及BE值,全自动生化仪检测血K~+、Na~+及Ca~(2+)浓度。结果:(1)采用SD大鼠肝叶切除术成功建立不同程度手术创伤模型,轻度创伤组大鼠存活率为97.5%,中度创伤组存活率为95.0%,重度创伤组存活率为91.3%,组间差异比较无显着性意义(P＞0.05),为研究手术创伤对机体影响建立动物模型。(2)手术创伤后外周血淋巴细胞HSP70的含量随着时间逐渐上升,术后12h达高峰(P＜0.05),后逐渐下降,至48h仍高于正常水平;不同程度手术创伤组术后HSP70表达量随创伤程度增加而升高(P＜0.05),提示HSP70可以作为判断手术创伤程度的指标之一。(3)在不同程度手术创伤组术后的内环境变化,叁组不同创伤组术后K~+都迅速下降,至2h达最低水平,后逐渐上升恢复至正常水平,不同组间K~+变化,在术后2h点各组间表达随创伤程度增加而明显下降(P＜0.05),其余各时间点组间无明显差异(P＞0.05)。叁组不同创伤组术后Na~+和渗透压变化,术后逐渐下降,至12h达最低水平,后逐渐上升至术前水平;不同组间Na~+变化,在术后12h点各组间表达随创伤程度增加而下降更明显(P＜0.05),其余各时间点组间无明显差异(P＞0.05)。重度创伤组PH在术后2h降低较明显,且稍低于正常范围,与其余组间有差异(P＜0.05),其余各组及时间点基本在正常范围,且组间无明显差异(P＞0.05)。重度创伤组术后2hBE及HCO_3~-稍低于正常范围,但与其余组间无明显差异(P＞0.05),其余组BE及HCO_3~-基本维持在正常水平。(4)在不同创伤组HSP70与K~+之间的关系,在中度及重度组手术后的变化具有正相关(P＜0.05);不同组间在术后2h具有高度相关r=-0.728,(P=0.000),术后12h及24h中度相关,具有统计学意义。在HSP70与渗透压之间的关系,叁组术后的变化均有中度负相关,具有统计学意义(P＜0.05);不同组间在术后12h及24h具有高度负相关(P＜0.05),术后2h及48h有中度负相关(P＜0.05)。结论:1.在不同程度手术创伤后,血淋巴细胞HSP70即表达,且随创伤程度增加而升高,可将血淋巴细胞HSP70作为判断创伤程度的指标之一。2.手术创伤后大鼠内环境指标随着HSP70升高逐渐恢复至正常稳态水平,提示HSP70对内环境稳态起着重要的作用。3.在手术创伤中,随着创伤程度的增大过程,HSP70与内环境指标成负相关。提示HSP70和内环境指标在手术创伤中是伴随着创伤程度而变化的,推测HSP70可能作为内环境稳态的预警指标,需进一步研究以明确。
曹东[8]2017年在《急性肝损伤大鼠肝组织HSP60的变化及意义》文中指出目的:观察大鼠急性肝损伤过程中热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)的变化及其与肝损伤的相关性。方法:126只清洁级SD大鼠,随机分为空白组(n=42)、非肝损伤组(n=42)和肝损伤组(n=42)。空白组不作任何处理;非肝损伤组大鼠进行左腿大腿骨折处理,肝损伤组用改良型BIM-Ⅳ(biological impact machine-Ⅳ)生物撞击机撞击诱导急性肝损伤。各组处理后于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d取血液检测丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)水平;之后杀鼠取肝,苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝组织病理变化;免疫组化染色检测HSP60蛋白表达。结果:(1)空白组与非肝损伤组在上述各时间段的ALT、AST表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与空白组及非肝损伤组相比,肝损伤组于6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d血清ALT、AST含量显着增高(P<0.05),且在6 h显着升高[(104.17±4.07)U/L,(271.00±15.84)U/L],12 h达到顶峰[(424.50±10.84)U/L,(787.70±32.68)U/L],之后不断下降,在3 d时恢复正常;(2)HE染色示,肝损伤组肝小叶结构排列紊乱,气球样变明显,在12 h最为明显;(3)免疫组化HSP60染色,肝损伤组织在6h开始显着高于空白组和非肝损伤组,12 h达到顶峰,1~3 d持续高于空白组和非肝损伤组,5 d时恢复正常水平;(4)HSP60蛋白表达与血清中ALT(r=0.9064,P<0.05)、AST(r=0.9294,P<0.05)表达呈正相关。结论:大鼠急性肝损伤过程中HSP60的表达量有明显的动态变化规律,与大鼠肝脏损伤程度变化一致。
阳晶晶[9]2013年在《针灸预处理诱导热休克蛋白表达对兔心肌缺血再灌注损伤延迟保护作用的研究》文中进行了进一步梳理目的：通过建立兔心肌缺血再灌注损伤模型,应用组织形态学、生化及分子生物学等方法,观察针灸预处理对内源性保护性物质NO、NOS、腺苷、HSPS等表达的影响,探讨针灸预处理启动内源性保护物质与缺血再灌注损伤延迟保护作用的关系；比较电针、艾灸两种预处理手段对HSPs家族的诱导表达是否一致；为针灸“治未病”及“胸胁内关谋”理论在临床的应用提供实验依据。方法：将32只新西兰大耳白兔随机分为4组,A假手术组、B缺血再灌注组、C电针预处理组和D艾灸预处理组。采用结扎左冠状动脉前降支40min再灌注60min的方法,建立心肌缺血再灌注损伤模型。A组于末次捆绑结束48h后开胸,穿线静置40分钟,拔线,继续静置60分钟,之后取材；B组于末次捆绑结束后48小时行缺血再灌注后取材；C组和D组分别在针／灸预处理之后48h再行缺血再灌注。采用高效液相色谱法测定血清腺苷含量；ELISA法检测血清NO、NOS的含量免疫组化学方法检测HSPs的表达；HE染色观察左心室缺血区细胞形态学变化；电镜观察左心室缺血区组织超微结构的变化。结果：1.HE染色观察MIRI兔左心室心肌缺血区心肌细胞形态学,假手术组基本正常,示心肌细胞胞浆饱满,肌纤维排列整齐,间质无增生,无炎细胞浸润；缺血再灌注模型组病变最严重,心肌细胞排列紊乱,横纹不清晰,炎细胞侵润,肌纤维坏死、溶解；电针预处理组与艾灸预处理结果组明显优于缺血再灌注组,横纹较清晰,间质可见轻微血管扩张,少量炎细胞浸润。2.电镜观察MIRI兔左心室心肌缺血区组织超微结构的变化,假手术组心肌纤维大多正常,肌丝分布均匀,排列整齐,仅少数肌纤维间水肿,线粒体丰富,结构正常；缺血再灌注模型组病变重,肌纤维萎缩、结构模糊,排列紊乱,肌丝溶解、坏死,间质水肿,线粒体水肿、空泡化,小血管扩张；电针预处理组肌丝束间水肿,部分肌丝溶解、稀疏,可见肌丝束断裂,线粒体结构正常；艾灸预处理组区域性肌丝溶解、变稀,或出现不规则收缩带,但线粒体正常。与模型组比较,电针预处理组与艾灸预处理组心肌超微结构病变程度较轻,心肌纤维排列较规整,坏死、溶解范围较局限,线粒体结构较正常,提示针灸“内关”预处理可以减轻MIRI时心肌超微结构的病变。3.各组兔血清中腺苷含量的比较：缺血再灌注组血清腺苷的含量较假手术组相比明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；电针组与艾灸组血清腺苷的含量较缺血再灌注模型组相比均明显升高,具有显着的统计学差异(P<0.01),而电针组与艾灸组两组间无明显差异(P>0.05)。4.各组兔血清中NO、NOS值的比较：缺血再灌注组血清NO、NOS的含量较假手术组相比明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；电针组与艾灸组血清NO、NOS的含量较缺血再灌注模型组相比均明显升高,具有显着的统计学差异(P<0.01),而电针组与艾灸组两组间无明显差异(P>0.05)。5.各组兔心肌组织HSPs表达的比较：(1)与假手术组相比较,电针预处理组与艾灸预处理组HSP27、70、90均明显升高(P<0.01),模型组中HSP27、70、90的含量有升高的趋势,说明HSP27、70、90的含量除了有应激因素外,针灸预处理“内关”穴可以增强HSP27、70、90的表达。(2)与模型组相比,艾灸预处理组的HSP27、70、90的含量明显升高(P<0.01),电针预处理组的HSP27含量明显升高(P<0.01),电针预处理组的HSP70、90的含量升高(P<0.05),提示了针灸预处理“内关”穴增强HSPs表达明显优于因手术刺激而致应激性的HSPs含量增加。(3)与电针预处理组相比,艾灸预处理组的HSP27、70、90的含量升高(P<0.05)。结论：1.电针预处理与艾灸预处理对MIRI兔心肌组织具有延迟保护效应,可以减轻兔心肌组织形态学破坏。2.电针预处理与艾灸预处理可以增加MIRI兔血清中内源性保护物质NO、NOS及腺苷的释放,诱导心肌保护蛋白HSPs的表达。3.艾灸预处理增强热休克蛋白表达的能力优于电针预处理,表明热休克蛋白的表达可能对热刺激更为敏感。
戴四发[10]2012年在《谷氨酰胺和γ-氨基丁酸对肉鸡抗热应激和肉品质的影响及机理探讨》文中研究说明本文通过体内试验研究了循环热应激(30-34℃)对肉鸡生长性能、屠宰性能、胴体性状、血清生化指标、肌肉品质、骨骼肌中G1n和GABA代谢、HSP70、AMPK信号通路相关指标的影响及外源性Gln和GABA的添加效果和互作效应,探讨了可能存在的机理,分析了骨骼肌部分指标与肌肉品质间的相关性。并进一步通过体外试验探讨了热应激条件下家禽骨骼肌细胞HSP70、AMPK问的调控关系及外源性Gln、GABA的干预作用,为氨基酸用于家禽抗热应激提供理论基础。1.体内试验：按照2因素2水平(2×2)加正对照组(PC组)的实验设计进行。选择健康的10日龄(d)健康AA公鸡360只,在适温条件下,常规饲养至21d时随机分为5组(每组6重复,每重复12只)。其中,四个热应激组(2×2)在22-42d进行循环热应激处理(每日9：00-14：00,温度从30℃升至34℃,14：00-18：00温度从34℃降至30℃,其他时间平均23℃左右),在基础日粮中分别添加Gln(0、5g/kg)和GABA (0、100mg/kg)。PC组在适温条件饲养(约23℃),饲喂基础日粮。于28、35、42d进行生长性能分析,并分别从各重复组抽取3只接近平均体重的样鸡用于屠宰性能、胴体品质、血清生化指标、肌肉品质、骨骼肌中Gin和GABA代谢、HSP70、AMPK信号通路相关组分的分析,对部分指标与肌肉品质之间的相关性进行分析,结果如下：1.1循环热应激降低了22-42d肉鸡增重(WG)和采食量(FI),42d时的屠体重(CW)、半净膛重(HEW)、全净膛重(EW)、胸肌重(BMW)、胸肌率(BMY)、腿肌重(LMW)、腹脂重(AFW)、腹脂率(AFY)、肌间脂肪宽(IFW)、皮下脂肪厚(SFT)；增加了肉鸡料重比(F/G)和腿肌率(LMY)。日粮添加5g/kg Gln增加了22-42d热应激肉鸡WG、FI、CW、HEW、EW、BMW、BMY、LMW、AFW、AFY、 IFW、SFT;降低了F/G,对LMY有降低趋势。日粮添加100mg/kg GABA增加了22-42d热应激肉鸡WG、FI、EW、BMW、BMY、AFW、AFY、SFT;对CW、HEW、IFW有增加趋势。两种氨基酸在影响循环热应激肉鸡WG、FI、F/G、EW、EY、BMW、 BMY、AFW、AFY、IFW和SFT方面存在协同效应。在影响生产性能方面,Gln的作用具有较好的持续性,GABA在第1周时作用较强,随后明显减弱。1.2循环热应激降低了28d、35d、42d肉鸡血清TP、葡萄糖、甘油叁酯、Gin、Glu、T4、Ins水平、ALP活性,22d、35d血清GABA水平；增加了22d、35d、42d肉鸡血清CS、GN水平、GOT、GPT、LDH、CK、NOS活性。日粮添加5g/kg Gln增加了22d、35d、42d热应激肉鸡血清TP、Gln、Ins水平,降低了血清甘油叁酯、CS、GN水平、GOT、CK、NOS活性。日粮添加100mg/kg GABA增加了22d、35d、42d热应激肉鸡血清TP、Gln、GABA、T3水平、ALP活性,对甘油叁酯、Gln、T4、 CS、Ins、GN水平、GOT、GPT、LDH、CK、NOS活性的影响存在明显的时间特异性。两种氨基酸在影响循环热应激肉鸡血清TP、甘油叁酯、GABA、Gln、T3、T4、 Ins、GN水平、ALP、LDH和CK活性方面存在明显的协同效应,在影响转氨酶(GOT、 GPT)和NOS方面仅在第1周时较显着。1.3循环热应激增加了28、35、42d肉鸡胸肌pH、L*、水分、CP、CF、CA、 TL、F、MFDS,腿肌pH、L*、CA, DL、SF、MFDS;降低了肉鸡胸肌DL、CLMFDM,腿肌a*、b*、CP、CF、CL、TL、CL、MFDM。日粮添加5g/kg Gln降低了胸肌L*、SF、MFDS,腿肌L*、DL、SF、MFDS,增加了胸肌CP、CF、CA、TL、 DL、MFDM,腿肌a*、CP、CF、水分、CL、MFDM.日粮添加100mg/kg GABA降低了胸肌pH、TL、SF、腿肌pH、DL、SF,增加了胸肌a*、水分、CP、CF,腿肌a*、CF。两种氨基酸在影响循环热应激肉鸡胸肌pH、b*、水分、CP、WHC、TL、SF,腿肌pH、L*、a*、水分、CP、WHC、TL、SF方面存在明显的协同效应。此外,通过日粮Gln和GABA可以提高肌肉在冷藏过程中的色泽稳定性。1.4循环热应激降低了28d、35d、42d肉鸡胸肌、腿肌的Gln、Glu、GABA含量、Glnase、GAD活性,增加了胸肌、腿肌的GS、GABA-T活性。日粮添加5g/kg Gln增加了胸肌的Gln、Glu含量、Glnase、GAD活性,腿肌的Gln、Glu、GABA含量、GAD活性；降低了胸肌、腿肌的GS活性,对胸肌的GABA含量、GABA-T活性、腿肌的Glnase、GABA-T活性有不同程度的影响。日粮添加100mg/kg GABA增加了胸肌的Gln、Glu含量、Glnase、GAD活性,腿肌Gln含量、GAD活性；降低了胸肌的GABA-T活性、腿肌的GS活性。两种氨基酸对循环热应激肉鸡胸肌、腿肌的Gln、 GABA含量、Glnase、GS、GABA-T活性的影响存在明显的协同效应。42d肉鸡胸肌、腿肌的Gln、GABA含量、Glnase、GS活性与L*、CP、CF、CL、MFDS和MFDM间存在显着的相关性。1.5循环热应激降低了28d、35d、42d肉鸡胸肌、腿肌糖原、葡萄糖、乳酸含量,增加了胸肌、腿肌的AMP/ATP、AMPK含量、AMPK活性、HSP70含量、AMPKa2mRNA、HSP70mRNA表达量。日粮添加5g/kg Gln增加了胸肌、腿肌的HSP70含量、HSP70mRNA表达量、胸肌的葡萄糖、腿肌的糖原；降低了胸肌、腿肌的AMP/ATP、 AMPK含量、AMPK活性。日粮添加100mg/kg GABA增加胸肌的糖原、葡萄糖、腿肌的葡萄糖、乳酸,降低了胸肌、腿肌的AMP/ATP、AMPK活性、腿肌的HSP70含量、HSP70mRNA表达量。两种氨基酸对循环热应激肉鸡胸肌的葡萄糖、乳酸、腿肌的糖原、乳酸、胸肌和腿肌的AMP/ATP、AMPK活性、HSP70mRNA表达量存在明显的协同效应。42d肉鸡胸肌和腿肌的糖原、葡萄糖、乳酸与水分、CP、CF, AMP/ATP. AMPK含量、AMPK活性与L*、水分、CP、CF、WHC、DL、CL、MFDS和MFDM间,HSP70含量与WHC、TL、DL间存在较为显着的相关性。2.体外试验：研究热应激影响家禽骨骼肌细胞HSP70、AMPK的调控关系及外源性Gln. GABA的干预作用。以1-2×106个/mL密度的成肌细胞进行试验。处理后置于37℃水浴中进行3h修复,收集细胞供分析。2.1热应激条件下HSP70表达与AMPK活性变化时差性分析共5组,每组6重复,基础培养基培养3h后进行热应激处理(42℃和45℃,0-120min)。结果表明：热应激提高了细胞的HSP70表达量和AMPK活性,以45℃处理的提高速度更快,程度更大,且以AMPK活性的变化速度快于HSP70表达量的变化。2.2HSP70表达与AMPK活性问的调控关系分析(1)QD抑制HSP70表达试验：共7组,每组6重复。用添加浓度为0-50umol/L的QD的基础培养基预培养3h,进行42℃和45℃、30min的热应激处理。结果表明：QD对HSP70表达的抑制作用存在明显的温度特异性,仅45℃时表现显着。同时,45℃时的AMPK活性具有不同程度的增加,显示HSP70能在一定程度上抑制/AMPK活性。(2)AICAR激活AMPK试验：共7组,每组6重复。用添加浓度为0-0.5mmol/L的AICAR的基础培养基培养3h处理。结果表明：AICAR能有效激活适温条件下的骨骼肌细胞AMPK活性,但对HSP70的表达量无影响。2.3Gln、GABA对细胞HSP70与AMPK的影响各取5组,每组6重复。在基础培养基中分别添加0-20mmol/L Gln和0-0.8mmol/L GABA预培3h后,进行45℃,30mmin热应激处理。结果表明：Gln能有效增加热应激条件下骨骼肌细胞的HSP70表达量,同时抑制AMPK活性的增加。GABA能在一定程度上抑制AMPK活性的增加,但对HSP70表达量无影响。2.4Gln、GABA对极端热应激骨骼肌细胞成活率的影响各取3组,每组6重复。分别用添加0、10、20mmol/L Gln和0、0.4、0.8mmol/L GABA的基础培养基预孵3h后,采用48℃高温处理3h、6h,分析细胞成活率。结果表明：添加10、20mmol/L Gln提高了热应激处理3h、6h后的骨骼肌细胞成活率；添加0.4、0.8mmol/L GABA对细胞成活率无明显影响。根据研究结果可以得出结论：(1)本研究采用的30-34℃循环热应激对22-42d肉鸡生长性能、胴体性状、血清主要代谢物、激素和代谢酶等生化指标产生了显着的负面影响,也显示了机体对热应激的适应性。日粮添加5g/kg Gin、100mg/kg GABA能有效缓解循环热应激对上述指标带来的负面作用,同时表现出了明显的协同效应和时间特异性。(2)从物质代谢角度分析,循环热应激显着影响了血清和骨骼肌中的Gln、Glu、 GABA水平,以及叁种氨基酸间的代谢酶。通过日粮添加5g/kg Gln、100mg/kg GABA可以有效改善循环热应激条件下肉鸡骨骼肌中Gln、GABA的代谢状况,同时表现出了一定的协同效应和骨骼肌组织差异性。(3)循环热应激明显造成了肉鸡机体的低能量状态,激活了骨骼肌中AMPK信号通路,促进了骨骼肌中HSP70转录和表达。通过日粮添加5g/kg Gln、100mg/kg GABA可以改善机体的能量状况,抑制骨骼肌AMPK信号通路,且表现出了一定的协同效应。同时说明,Gin的这种积极作用可能在一定程度上与促进HSP70表达有关,而GABA的改善作用与HSP70无关,可能与其神经系统和生理调控方面功能有关。(4)循环热应激对胸肌、腿肌的化学组成和肉品质指标产生了显着的负面影响。通过日粮中添加5g/kg Gln、100mg/kg GABA对于缓解热应激对这些指标带来的负面影响具有积极作用,其中的机制与骨骼肌中Gin代谢变化、(?)AMPK信号通路激活状况、HSP70表达量的变化有密切关系,且表现出了一定的协同效应和骨骼肌组织差异性。(5)通过体外骨骼肌细胞试验证明,热应激能激活肌细胞AMPK信号通路,促进HSP70的表达。热应激细胞中HSP70的表达可在一定程度上抑制AMPK信号通路的激活,起到保护细胞作用。在适温条件下细胞中AMPK的激活并不能导致HSP70表达量的变化。同时证明,外源性Gln、GABA均能抑制热应激骨骼肌细胞AMPK信号通路,但仅有Gln能有效保护热应激细胞,其作用与促进HSP70表达密切相关。
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[10]. 谷氨酰胺和γ-氨基丁酸对肉鸡抗热应激和肉品质的影响及机理探讨[D]. 戴四发. 南京农业大学. 2012
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