严子才[1]2000年在《兔腹主动脉局部痉挛模型建立及发病机制的探讨》文中进行了进一步梳理研究背景：体内存在两种血管痉挛性疾病，即冠状动脉痉挛的变异型心绞痛和肢端动脉痉挛的雷诺综合征，这两类疾病的发病原因和发病机制不明。对于变异型心绞痛，其冠状动脉痉挛多发生于动脉粥样硬化处，但也见于造影正常的冠状动脉，研究证实，造影正常的血管很多处于动脉粥样硬化的早期阶段；与劳力性心绞痛相比，变异型心绞痛除存在其它动脉粥样硬化危险因素外，最具差别的危险因素是吸烟；所有的动脉粥样硬化危险因素都可以导致血管内皮功能失调，即内皮依赖性血管舒张受损，而冠状动脉痉挛的诱发特征亦与此相联系。 研究目的：（1）建立在体兔腹主动脉局部痉挛模型，它将具有CAS的类似特点；（2）通过As危险因素与血管痉挛之间的内在联系，说明CAS的发病机理可能是在血管EDF基础上对各种刺激的高收缩性反应；（3）通过血管运动反应以及血清胆固醇浓度的改变，探讨影响血管痉挛的因素。 方法：新西兰白兔共24只，雄性9只，雌性15只，体重2.40～3.50（2.83±0.30）kg。于L_(3～4)腰椎水平的腹主动脉行球囊内皮剥脱，剥脱后动脉内分别注入麦角新碱0.2mg，组织胺（20μg/kg），L-NMMA100μmol，NTG（10μg/kg），两种药物注射的时间间隔为15～20min，1～3min后分别造影。结扎股动脉，缝合切口，送动物房给予相应的饲料喂养。1 组兔子给予2％胆固醇饮食喂养8周，2组兔子给予0.4％胆固醇饮食喂养8周，3组兔子给予0.4％胆固醇饮食喂养8周，然后给予普通饮食继续喂养8周，三组兔子分别再次实验，过程同上。每次实验均留血样本作血脂分析，最后一次实验取剥脱及对照段血管作组织学检查。注射药物前后的血管运动反应通过造影测量。 结果：（1）实验前后兔子体重变化不大，8或16周后剥脱及对照部位血管直径有所减小，但相差不显著；（2）1组血清胆固醇水平明显高于2、3二组（p＜0.001），3组血清胆固醇水平与2组相差显著（p＜0.05）；（3）在内皮剥脱8或16周后，内皮剥脱部位血管轻度狭窄，组织学证实为As改变，而非剥脱部位则改变轻微或没有改变：（4）Hist和Erg在内皮剥脱 第一车医大学97级硕士学位论文 部位诱发出明显的血管痉挛，而在非剥脱部位则诱发出轻度的血管收缩 …＜0刀01），并且 HISt引起比 Efg更大程度的血管痉挛b＜0刀1）；乃）疼痛 刺激小可诱发出血管痉挛，且痉挛程度比药物诱发的程度大；…）痉挛时 问短暂，持续约5叫0分钟，可重复诱发；门）三组兔子的血管内膜厚度 相差不显著，说明血管痉挛程度与血管内膜厚度无关系，而与血清胆固 醇水平有关；仰痉挛局部与0周相比对L－NMMA的缩血管反应减弱了 …＜0刀01卜 而对 NTG的舒血管反应增强了…＜0刀of卜 结论：＊）通过球囊内皮剥脱和胆固醇饮食，本实验成功建立了在体 兔腹主动脉局部痉挛模型，该模型具有CAS的类似特点；（2）血管痉挛 的实质是，在As危险因素的作用下，血管发生EDF，并产生一定程度 的损害如 AS改变，由此产生对生理性和药理性刺激的局部高收缩性反 应；m终止AS危险因素的继续作用以及改善内皮功能将对血管痉挛治 疗产生有利的影响。
刘毅[2]2009年在《树突状细胞在兔动脉粥样硬化模型中作用的研究》文中研究表明冠心病(coronary heart disease,CHD)是进入二十世纪以来,人类健康和生命的最大威胁。但是,其发病机制尚不明确,成为阻碍其治疗的重大障碍;针对其发病机制的研究,一直是心脏医学的热点。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的病理病变基础。在其发展过程中,经历脂纹、脂斑、纤维斑块、粥样硬化斑块等进展时期;通过对临床发病致死病例的尸体解剖,人们最初认识AS斑块,是终末期溃疡样的动脉内膜瘤样增生;进而在非冠心病死亡的年轻病例的动脉血管壁上检测到起始阶段脂纹和脂斑的存在;最后通过对AS实验动物和临床病理的进一步观察,人们得出AS具有缓慢和逐渐进展的特点。近年来临床观察发现,冠心病终末期具有加速进展的临床表现,表现为发病突然、风险度高等特点。如果救治不及时,死亡率和致残率明显升高。分析其病理改变发现以易损斑块为主要特征,斑块不稳定到破裂,发展迅速并引起瀑布样血栓形成,导致疾病的快速和剧烈进展。人们再次认识到冠心病终末期具有加速演变和剧烈进展的特点,将这一类加速进展阶段的末期情况归纳为急性冠脉综合症(acute coronary syndrome,ACS)。冠心病在发病和进展时期的隐蔽性大,而进入终末期的致死率和致残率明显升高,对人们生活和工作构成极大的损害。如何早期发现、早期防治以及有效的减少其发病率和致残率,是医学界的热点问题。为了更好的解决这些临床问题,对其的发病机制和进展期恶化因素的研究成为高度关注的核心。因为AS的病变过程漫长,而终末期又具有进展迅速的特点。人们发现其发病过程与创伤、肿瘤和炎症及自身免疫性疾病都具有一定的相似点,使得对AS的发病和进展机制有了种种不同的推测,类创伤、类肿瘤以及类炎症和自身免疫性疾病等等。然而,如果是创伤修复,为何越修复越进展;如果是肿瘤,为何越生长细胞调亡反而增多;如果是慢性炎症和自身免疫性疾病,又没有公认的明确的抗原来源。各种学说都在解释AS的发生发展过程中都遇到一定的困难。如何寻找突破口,最终阐明AS发病机制成为困扰各个学说的主要问题。近期,人们对ACS患者体内活化免疫细胞和细胞因子的检测以及对AS各个时期病变中活化免疫细胞检测中,发现冠心病终末期患者不仅仅在斑块病变局部可以检测到大量活化T淋巴细胞和单核细胞,其外周血中也可以检测到前炎症因子的高水平表达,提示在AS的终末阶段,出现全身炎症反应增强的表现,又根据活化T淋巴细胞的出现,使得人们对炎症和免疫参与疾病发展的关注逐渐升温。针对ACS患者外周血和病变组织中活化T淋巴细胞亚组、分型、受体及黏附附因子等方面的研究都发现病变局部有大量活化T淋巴细胞存在,并出现亚组分型和蛋白表达各方面的差异。斑块内T淋巴细胞活化的根源在那里,使得人们自然注意到作为诱导T淋巴细胞活化的主要抗原呈递细胞——树突状细胞(dendritic cells,DCs)的存在。斑块内是否存在作为抗原提成的DCs;DCs的来源如何:DCs是否为成熟状态,其功能状况怎样;DCs是否吞噬抗原并将抗原肽刺激信号提呈给初始T淋巴细胞,而诱导T淋巴细胞增殖和活化等等问题,成为关注的热点。作为DCs的研究,因为DCs在体内各组织中存在细胞量少,在外周血中DCs占有核细胞的比例低于1%,在正常血管壁内DCs更难以检测,这些给DCs的研究带来一定的困难。部分学者通过培养外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)来源的DCs,在体外获得一定数量的DCs,并对来源于AS不同阶段患者的DCs成熟状态及免疫功能作比较,发现ACS患者PBMC来源的DCs高表达CD80、CD86和CD83等共刺激分子和黏附分子,表现为成熟状态,并且具有较强的活化T淋巴细胞的能力。提示ACS患者体内可能存在诱导DCs活化的物质,使得DCs表现为成熟阶段。而应用氧化低密度脂蛋白(oxidatedlow density lipoprotein,oxLDL)、尼古丁和热休克蛋白(heat shock protein,HSP)等AS相关物质都能在体外诱导DCs成熟,并具有一定的免疫活性。但是,对于DCs的研究如果始终停留在对可能诱导AS的抗原刺激物对DC活化作用的检测,或者对ACS患者PBMC体外培养DCs成熟标准的检测,则对AS的形成和发展机制无进一步的深入。为了突破目前研究的局限性,进一步证实DCs确实参与了AS的进展,并在ACS患者不稳定斑块的形成中起到启动和活化T淋巴细胞,而使得炎症反应增强的作用。根据DCs在体内经历从骨髓干细胞发育成DCs前体细胞,到经过血液迁徙到抗原位点,未成熟细胞通过吞噬抗原,并提呈抗原成为成熟细胞,后再迁徙到淋巴结T细胞区激活初始T淋巴细胞增殖全过程的情况。我们设想可以通过选择合适的AS动物模型,分析AS动物模型中典型斑块与炎症的关系,进而分析斑块局部炎症与DCs分布与功能变化情况,以验证外周血DCs分布情况从侧面反应其迁徙到血管壁内的状况,并通过体外实验观察AS的可能危险因素对DCs成熟及免疫活化的影响。如果实验动物体内存在诱导DCs活化的因素,进而导致斑块内DCs聚集和活化,吞噬可能存在的抗原物质而活化,其血管壁内的DCs分布必然会上升,诱导炎症反应增强,从而使得斑块活化及不稳定。因此,本实验研究从选择合适动脉硬化动物模型出发,以期在合适的动脉斑块中检测炎症及DCs成熟状况,并检测AS动物模型中可能存在的危险因素与DCs成熟的关系,探讨DCs在易损斑块形成过程中的作用,为冠心病免疫发病机制的阐明奠定一定实验基础。本课题分为三个部分,首先以兔腹主动脉粥样硬化模型为研究对象,应用病理切片、血管造影及体外超声检测斑块成膜情况,分析其斑块性质,建立研究模型基础;从建立的AS实验动物出发,应用流式细胞技术和免疫组织化学观察DCs在血液、血管组织、脾脏和肝脏及淋巴结的分布情况,重点观察DCs的分布情况对AS发生发展的影响;体外培养实验动物骨髓源DCs,并通过ELISA、流式细胞技术及免疫检测技术观察模型动物的自体血清与ox-LDL刺激对DCs成熟诱导情况,以明确AS动物模型中DCs与典型斑块形成的可能机制。结果分述如下。1.新西兰兔的模型制备及相关检测1.1动脉粥样硬化新西兰兔成模情况及各组兔一般情况的比较16只雄性纯种新西兰白兔,体重2.50±0.14kg,随机分为对照组和实验组,各组予以腹主动脉内膜的球囊损伤后,实验组以高脂饮食喂养2月,对照组则以正常饮食喂养2月。给予高胆固醇饮食喂养2月,喂养后兔的体重较喂养前在实验组与对照组均数均明显增加,差异有显著性意义(P=0.000);实验组喂养后较喂养前的TC、TG、LDL均数增高,差异有显著性意义(P=0.000);实验组喂养后与对照组喂养后比较,其TC、TG、LDL均数明显增高,差异有显著性意义(P=-0.000)。1.2各组新西兰白兔腹主动脉造影及外周血管超声情况的比较两组新西兰白兔喂养2月后,行腹主动脉造影检查及外周血管超声检查,分别比较喂养2月后两组新西兰白兔腹主动脉硬化斑块形成对动脉管腔变化的影响,并观察麦角新碱对球囊剥脱部位诱发痉挛情况的比较。在腹主动脉造影下,测量药物刺激后血管收缩率,t检验显示实验组的损伤部位和未损伤部位之间以及实验组的损伤部位与对照组的损伤部位之间血管收缩率差异存在显著性意义(P=0.000)。以体表超声评价血管偏心指数(斑块偏心指数=斑块最厚处斑块厚度/该部位对侧斑块最薄处斑块厚度)。结果显示偏心指数较大的斑块在药物刺激后血管收缩明显增加,偏心指数与血管收缩率之间呈显著正相关(r=0.983,P=0.000)。1.3各组新西兰白兔腹主动脉内膜增生情况比较:两组新西兰白兔喂养2月后,分别留取球囊剥脱部位及临近剥脱部位的腹主动脉血管标本。比较喂养2月两组新西兰白兔主动脉形态学,实验组光镜下见中膜和内膜均明显增厚,有较多增生的血管平滑肌细胞,呈环形排列整齐,新生内膜中有大量细胞外基质形成,管腔明显狭窄。各种参数如内弹力膜环绕总面积、新生内膜面积、管腔面积及内膜增生百分比的结果比较,四组之间明显差异,独立样本t检验发现实验组球囊剥脱部位与临近剥脱部位和对照组相比,新生内膜面积显著增大,差异有显著性意义(P=0.004),管腔面积显著减小,差异有显著性意义(P=0.000),内膜增生百分比明显增大,差异有显著性意义(P=0.001)。说明实验组新西兰白兔球囊剥脱部位的主动脉内膜有新生内膜形成。1.4各组新西兰白兔血清NO水平及血管标本内eNOS酶蛋白表达的比较采用硝酸还原酶法对两组新西兰白兔喂养2月后的血清NO水平进行检测。结果显示实验组与对照组比较,血清NO水平下降的差异有显著性意义(P=0.002)。采用免疫组化对各组血管组织中eNOS酶蛋白含量和定位进行检测,结果显示对照组血管组织中,内皮细胞有阳性着色,球囊剥脱部位与临近剥脱部位内皮细胞阳性着色点无明显差异;实验组与对照组相比球囊剥脱部位内膜的阳性着色减少,内皮下层出现散在的阳性着色点,而临近球囊剥脱部位内膜阳性着色点较对照组无明显差异。说明高脂血症可以导致血浆NO水平下降,但对血管内皮eNOS酶表达无明显影响,只有在血管内皮损伤后,血浆胆固醇进入内膜进一步演变成有害胆固醇蛋白,进而对内皮功能产生影响。2.兔动脉粥样硬化与炎症及细胞免疫的关系通过ELISA方法检测实验组血浆炎症因子表达水平,并流式细胞检测技术和免疫组织化学方法,分析AS动物模型血管壁内DCs及免疫细胞的分布,观察是否存在与正常对照组之间的区别。2.1血生化指标及炎症指标的检测:制备模型2月后,通过ELISA方法检测实验动物血浆炎症因子表达水平,实验组兔血清sICAM、sVCAM、IL-6、TNF、hsCRP的含量与对照组相比,存在显著性差异(P＜0.01)。提示在兔动脉粥样硬化的发生、发展过程中存在炎症反应,黏附分子与CRP等炎症因子共同促进动脉粥样硬化的发展。2.2兔DCs表型分子S100及抗原呈递细胞活性分子CD86、MHCⅡ分别在两组剥脱及未剥脱血管部位的表达情况制备模型2月后,经流式细胞术检测,实验组血管剥脱部位的CD86、MHCⅡ、S100含量分别与未剥脱部位、对照组剥脱部位的血管相比明显升高,差异有显著意义(P＜0.01);CD86、MHCⅡ、S100的含量在实验组未剥脱部位、对照组剥脱部位及未剥脱部位的血管两两之间,差异无显著性意义(P＞0.05)。在模型兔剥脱部位血管壁组织内检测到兔特异性的DCs标记分子明显增多,说明实验组较对照兔腹主动脉血管壁内DCs明显升高;而检测抗原呈递细胞活性分子CD86及MHCⅡ含量也较对照组明显升高,说明抗原呈递细胞活化与AS的进展高度相关3.兔外周血来源的DCs可以在模型自体血清及AS相关物质刺激下诱导成熟,并具有诱导T细胞增殖的能力制模前兔外周血来源的DCs分为4组,空白组予以PBS干预,对照组予以制模前的兔自体血清干预(10%),实验组予以制模后兔自体血清干预(10%),ox-LDL组予以ox-LDL(10μg/mL)干预。3.1兔外周血源的DCs培养及形态学鉴定:兔外周血源的DCs在光学显微镜下可见悬浮生长,部分细胞聚集成簇,细胞表面有数量不等、形态不一的树突样突起;在扫描电镜下细胞呈不规则形,表面粗糙,胞体有形态不一的突起。3.2各组兔外周血源的DCs的表型流式细胞学检测:空白组、实验组、对照组以及ox-LDL组的兔外周血源的细胞培养前后的表型流式细胞学检测结果经One-Way ANOVA检验显示:MHCⅡ(P=0.000)、CD86(P=0.001)、CD14(P=0.000)在各自的不同组间的差异有显著性意义,对照组、实验组与ox-LDL组的MHCⅡ、CD86的表达较空白组上调,差异有显著性意义(P<0.05),实验组与ox-LDL组的CD14表达下调明显,差异有显著性意义(P<0.01)。对照组表现为CD86~+/MHCⅡ~+/CD14~(dim),区别于空白组单核/巨噬细胞的MHCⅡ~+/CD14~+的表型特征。在实验组自体血清环境以及ox-LDL组的ox-LDL刺激后,MHCⅡ和CD86表达继续上调,CD14~+/aim则转化为CD14~-,其MHCⅡ~+/CD86~+/CD14~-的表达为成熟树突状细胞的表现。3.3混合淋巴细胞反应:各组的兔细胞按照不同比例(1:10、1:50、1:100)与同种异源的T淋巴细胞混合,加DMSO后用酶标仪检测波长490nm的A值。结果显示各组均可产生不同程度的增殖反应,析因分析表明混合比例因素(P=0.000)和分组因素(P=0.000)对MLR的结果影响均有显著性意义,且1:10的比例时增殖反应最强。One-Way ANOVA检验各组在不同混合比例下的差异,实验组(P=0.026)各比例间差异有显著性意义。One-Way ANOVA检验不同比例的MLR在各组之间的差异,结果提示在1:10及1:50混合比例时各组之间比较有显著性意义(P=0.002),且ox-LDL组和实验组较空白组具有更强的刺激异体淋巴细胞增殖的能力,比较有显著性意义(P<0.05),说明经高脂血清环境培养的DCs与ox-LDL刺激生成的DCs具有更强的抗原提呈能力,并且随着DCs数量的增多,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强。通过上述三个部分的实验,我们得出以下结论:1通过球囊内皮剥脱并高脂饮食2月后,可形成明确的兔腹主动脉硬化斑块,该斑块具有显著的内膜增生、管腔狭窄等特点;2模型兔腹主动脉斑块具有部分类似人动脉硬化的特点,体表超声显示该斑块呈密度低、偏心形等特点,麦角新碱诱发下腹主动脉造影显示球囊内皮剥脱部位可诱发明显的血管痉挛;3斑块形成部位eNOS减少说明斑块部位内皮功能严重受损;4模型兔血浆炎症因子分泌增多,说明炎症与AS形成高度相关;5模型兔血管壁DCs的比例增多,且其活性表型分子表达增多提示DCs可能参与AS的形成;6外周血分离的PBMC可在IL-4及GM-CSF的联合诱导下,培养出形态及表型稳定的DCs;7模型兔自体血清可诱导DCs的成熟及促进T淋巴细胞的增殖,可能参与AS形成;8 ox-LDL同样可诱导DCs的成熟及免疫活性,可能在本实验动物模型中占据主要的抗原成分地位。
傅强[3]2001年在《内皮一氧化氮合酶基因表达在局限性血管痉挛发病机制中作用的实验研究》文中研究指明研究背景：冠状动脉痉挛作为临床多种缺血性心脏病的共同病理基础，不仅与变异性心绞痛的发生有关，还与不稳定心绞痛、心肌梗塞和猝死的发生高度相关。但是，其发病机制仍不清楚。目前认为，冠状动脉痉挛是多因素共同作用的结果。以局灶冠脉高反应性为基础，合并来自神经、体液等方面的异常刺激为诱因，可能是CAS发生的本质。针对冠脉高反应性的研究中，以交感神经支配异常、平滑肌细胞功能异常和内皮细胞功能失常等方面较多，而内皮功能异常倍受关注。临床研究发现，eNOS基因表达缺陷与冠状动脉痉挛的发生高度相关。eNOS酶表达减少、活性降低，影响到NO的合成与分泌，导致内皮功能障碍，可能诱导冠状动脉痉挛发生。本课题拟对eNOS基因表达与冠状动脉痉挛的发生的关系进行研究。 研究目的：本实验旨在探讨eNOS基因表达和酶表达减少所致内皮功能障碍，与局限性血管痉挛的关系。进一步了解eNOS基因的调控和表达在血管痉挛发生过程中所起的作用。 方法和结果： 1.新西兰白兔36只，雌雄各半，体重2.4±0.3kg。分成正常组（4只）、假手术组+普通饮食组（组1，8只）、假手术组+胆固醇饮食组（组2，8只）、内皮剥脱+普通饮食组（组3，8只）和内皮剥脱+胆固醇饮食组（组4，8只）。组4通过球囊内皮剥脱和高胆固醇饮食8周，建立局限性腹主动脉痉挛模型；组3通过球囊内皮剥脱和普通饮食，建立饮食对照；组2手术但不行球囊内皮剥脱并胆固醇饮食，建立假手术对照；组1行假手术和普通饮食，建立完全空白对照。术后立即造影，麦角新碱和组织胺诱发，未见明显血管收缩。8周后，组2和4的血清胆固醇水平明显高于组1、3（P＜0.001）；再次造影，各组血管没有明显狭窄；组4在剥脱部位可以诱发出明显的血管痉挛；血管组织学发现组2、3和4内皮剥脱部位出现血管内膜增厚（P＜0.001），但组2、3和4之间相差不显著。 2.采用硝酸还原酶法对手术后0周、8周药物诱发前后血清NO水 平进行检测。结果显示0周药物诱发后各组NO水平较诱发前明显升高 （P＜〕om）；8周后组2禾4 NO水平较O周明显降低（p＜corn）；药物 诱发后组 1、3 NO水平较诱发前明显升高，但组 2和 4无明显差异。 采用免疫组化对各组血管组织中eNOS酶蛋白含量和定位进行检测，结 果显示正常、组1和组3血管组织中，内皮细胞有相似阳性着色，组3 内皮下层出现散在的阳性着色点；组2与正常组相比内膜的阳性着色减 少，组4内膜的阳性着色明显减少，内皮下层阳性着色点明显增多。 3．应用原位杂交和 Northern blot方涪对各组血管组织中 eNOSInKNA 的表达进行定位和定量分析。原位杂交显示正常组、组1和组3血管组 织中内皮细胞内有相似阳性着色，组2阳性着色减少。而组4没有明显 的阳性着色。Northern blot定量分析结果显示 8周后，组 4 eNOSmKNA 的相对表达值与其他各组相比显著减少。而组2则较组1和3减少。 结论：高胆固醇和内皮剥脱可以诱导eNOS基因转录和翻译下调， 血管内广eNOS含量和活性下降，影响NO合成和释放，导致内皮依赖 性的舒张功能受损，可能与实验性血管痉挛的发生密切相关。
徐凤芹[4]2003年在《芎芍胶囊防治动脉粥样硬化血管重构的临床与实验研究》文中研究指明目的：研究芎芍胶囊对颈动脉粥样硬化(AS)患者及实验性AS模型血管重构的影响，探讨其作用机制；方法：临床采用随机对照方法，血管超声法为主要指标观察芎芍胶囊对颈AS患者的影响；实验研究应用计量组织学方法及免疫组化、原位杂交等技术观察兔节段性AS模型血管重构的动态变化过程及芎芍胶囊对其的影响，探讨其作用机制；结果：内膜增厚和病理性血管重构共同参与了AS过程。芎芍胶囊具有调脂、抗血小板聚集、影响血管活性物质水平、调控血管平滑肌细胞(SMC)增殖凋亡、改善内皮细胞结构功能、调节胶原的含量及排列、抑制内膜增厚、改善病理性血管重构及消减AS斑块等作用；结论：病理性血管重构是AS过程中的重要环节，是导致管腔狭窄的主要因素。芎芍胶囊具有较好的防治AS作用，调控血管重构过程为作用机制之一。
张澄[5]2009年在《动脉粥样硬化病变分子机制和基因治疗的实验研究》文中研究指明论文一肿瘤坏死因子TNFα抑制胶原合酶限速亚单位P4Hα1的作用及其分子机制的实验研究1.背景:动脉粥样硬化斑块不稳定所导致的斑块破裂和血栓形成是引起急性心脑血管事件的主要原因。研究发现典型的易损斑块具有以下特点:较大的脂核、较薄的纤维帽、斑块胶原纤维和平滑肌细胞含量减少、巨噬细胞密度和活性增加、活化T细胞浸润增加等,其中斑块胶原的过度降解是导致斑块不稳定的主要原因,因此斑块内胶原的代谢平衡已成为近年来心血管病基础研究的热点之一。动脉粥样硬化斑块纤维帽的完整性和高强度主要有赖于细胞外基质的支持,其中最主要的成分是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原纤维。胶原代谢主要由胶原的合成与降解平衡来调节。此外,胶原纤维的三维结构也是影响其功能的因素之一。分布在动脉内膜的血管平滑肌细胞是粥样斑块内胶原的主要来源。斑块内胶原的代谢失调如胶原合成减少和/或降解增加均可导致斑块表面的纤维帽变薄和斑块的不稳定。因此,明确斑块的细胞外基质代谢及其调节机制对于稳定斑块具有重要的意义。胶原蛋白的生物学合成过程包括一系列的前骨胶原的翻译后修饰,其中细胞修饰过程需要5种酶的参与,包括3种胶原羟化酶和2种胶原糖基转移酶。在这些羟化酶中,4羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是一个具有2个α亚基(P4Hα1,P4Hα2)和2个β亚基(P4Hβ1,P4Hβ2)的四聚体。其中β亚基是二硫化异构酶,起催化作用的主要部位存在于β亚基,而α亚基的主要作用是决定酶的活性,是胶原合成的重要限速酶。P4H是在所有的已知21种类型胶原合成过程中起关键作用的酶。P4H的过表达会导致胶原的合成增多,而抑制P4H的产生则可导致胶原的不稳定和降解。炎症在许多心血管疾病的发生和发展过程中都起着重要的作用,如动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌病和动脉瘤等。在急性冠状动脉综合征(ACS)的发病过程中,炎症是斑块易损和破裂的始动环节。炎症可以诱导多种细胞因子的分泌,如肿瘤坏死因子(TNFα)、转录生长因子(TGF-β)以及各种白细胞介素等,这些细胞因子可通过激活基质金属蛋白酶(MMP)和抑制胶原合成引起细胞外基质的降解。在这些因子中,TNFα由激活的巨噬细胞所分泌,在细胞外基质降解和ACS的发病过程中起着非常重要的作用。2.目的:(1)在体外试验中,研究肿瘤坏死因子(TNFα)对胶原酶限速亚单位P4Hα1的抑制作用。(2)在体外试验中,探讨TNFα对P4Hα1抑制作用的分子机制,为稳定易损斑块寻找新的治疗靶点。3.方法:3.1质粒构建pGL3-baisc多克隆载体被用来构建包含P4Hα1启动子片断的质粒。我们首先应用带有KpnⅠ和HindⅢ内切酶双酶切位点,并含有P4Hα1启动子片断的引物对P4Hα1启动子进行扩增。我们选取了-580bp至+76bp这一部分的启动子序列,采用逐段删除的方法,对引物进行设计,最后得到了包含9段P4Hα1启动子片断,顺序依次为:-580至+76bp、-480至+76bp、-417至+76bp、-320至+76bp、-271至+76bp、-184至+76bp、-145至+76bp、-97至+76bp、-32至+76bp、+18至+76bp的pGL3-P4Hα1载体。3.2对细胞的转染与刺激在剂量实验中,0 ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml和100 ng/ml TNFα纯品被分别加入到细胞培养基中,在时间实验中,我们在4小时,8小时,24小时和48小时,分别向培养基中加入100 ng/ml TNFα,与培养基充分混匀后进行检测。将1 ug含有P4Hα1启动子片断的pGL3-baisc质粒转染进平滑肌细胞中,进行下一步检测。为了检测细胞因子在TNFα对P4Hα1抑制过程中所起的作用,我们设计了因子NonO、hnRNP-K、BUB3、ILF2、DJ-1和HIF1等的RNA干扰片断,将siRNA转染入细胞进行检测。3.3 RT-PCR通过RNA提取,逆转录和RT-PCR的方法对平滑肌细胞内P4Hα1,β-actin,luciferase等的mRNA进行检测。3.4 EMSA将探针与细胞核蛋白混合,用抗体标记后进行凝胶电泳,观察探针与蛋白的结合能力。3.5 ChIP分析将抗目的蛋白的抗体与核蛋白结合后,用含有目的片段的引物进行PCR扩增,观察目的蛋白与目的DNA片段的结合能力。3.6 Western Blot经过提取蛋白,凝胶电泳,转膜,标记一抗和二抗,曝光等步骤观察目的蛋白的表达。4.结果:4.1.TNFα对P4Hα1的抑制作用我们用100ng/ml TNFα分别刺激平滑肌细胞4,8,24和48小时后,提取细胞RNA,检测P4Hα1mRNA的表达水平。发现经TNFα刺激8小时后,P4Hα1mRNA产量明显下降。用1ng/ml,10ng/ml和100ng/ml TNFα刺激平滑肌细胞8小时,观测P4Hα1mRNA的表达,发现随着TNFα浓度的升高,P4Hα1的mRNA水平呈递减趋势,在100ng/ml达到最大的抑制效应。4.2.P4Hα1启动子上TNFα反应元件(TaRE)的鉴定我们用脂质体转染的方式将含有P4Hα1启动子片断的PGL3 Basic载体转入平滑肌细胞中,经TNFα刺激后,用RT-PCR的方法检测PGL3 Basic载体上荧光素酶的表达。发现转染了含有+18至+76bp启动子片断的载体后,超过80%的TNFα的抑制作用消失,荧光素酶表达基本恢复正常,证明TNFα反应元件位于P4Hα1启动子-32至+18片断上,TNFα通过作用于这一片断抑制P4Hα1的mRNA表达。4.3.NonO与P4Hα1启动子的结合在EMSA中,我们将平滑肌细胞核蛋白与含有-32至+18片断的探针结合后,用抗NonO抗体标记,在经TNFα刺激后,Supershift条带显著增强,证明NonO在TNFα刺激后,与P4Hα1启动子的结合力增强。在平滑肌细胞核蛋白中,用抗NonO抗体免疫共沉淀下与NonO结合的DNA片段,用包含P4Hα1启动子-32至+18片断的引物进行PCR扩增后,发现只有经TNFα刺激后,NonO蛋白才能与P4Hα1启动子结合,从而扩增出清晰的PCR条带。将NonOsiRNA转入平滑肌细胞后,经TNFα刺激,用RT-PCR检测P4Hα1mRNA的表达。发现敲低NonO蛋白后,60%以上的TNFα对P4Hα1mRNA的抑制作用消失。4.4.TNFα通过下游通路ASK1和JNK实现对P4Hα1的抑制作用TNFα刺激平滑肌细胞前,先用JNK抑制剂-SP600125刺激平滑肌细胞1小时阻断JNK通路,观测P4Hα1mRNA的表达。发现加入JNK抑制剂后,TNFα对P4Hα1mRNA的抑制作用基本消失。ASK1抑制剂-Thioredoxin刺激平滑肌细胞1小时后,继续用TNFα刺激8小时,RT-PCR检测P4Hα1的mRNA水平变化,发现ASK1抑制剂几乎全部消除了TNFα对P4Hα1mRNA的抑制作用。4.5.DJ-1在TNFα对P4Hα1抑制过程中的作用我们将DJ-1siRNA转入平滑肌细胞中沉默DJ-1基因,经TNFα刺激后,观察P4Hα1mRNA的表达。结果显示DJ-1基因沉默消除了超过50%的TNFα对P4Hα1的抑制作用。将DJ-1siRNA转入平滑肌细胞中,并分别用TNFα和JNK1腺病毒刺激细胞,用抗NonO抗体免疫共沉淀后用含有P4Hα1启动子TaRE片段的引物PCR扩增,发现经TNFα或JNK1刺激都不能扩增出PCR片段,证明DJ-1RNA干扰后,NonO与TaRE不再结合。我们进一步将NonOsiRNA转入平滑肌细胞,用TNFα或JNK1腺病毒刺激后,用抗DJ-1抗体进行ChIP分析,发现不仅将NonO敲低后,DJ-1不能与TaRE结合,而且在没有转染NonOsiRNA的细胞中,TNFα或JNK1也都不能导致DJ-1与TaRE的结合。进一步用抗氧化DJ-1抗体进行ChIP分析,发现TNFα和JNK1均可使氧化DJ-1与TaRE结合,在将NonO基因沉默后,这种结合力明显下降。4.6.TNFα导致的组蛋白改变平滑肌细胞经TNFα或JNK1腺病毒刺激后,提取核蛋白,用抗组蛋白4第12个赖氨酸的抗体进行ChIP分析。结果显示,经TNFα刺激后,组蛋白4第12个赖氨酸的乙酰化明显增强。平滑肌细胞经TNFα或JNK1腺病毒刺激后,用抗组蛋白3第9个赖氨酸的抗体和包含P4Hα1启动子TaRE片段的引物进行ChIP分析。发现TNFα刺激后,组蛋白3第9个赖氨酸的去乙酰化明显增强。用20uMHATI刺激平滑肌细胞24小时,提取核蛋白,用抗NonO抗体进行ChIP分析后发现,不能扩增出PCR片段,证明经HATI刺激后,NonO不能再与P4Hα1启动子片段结合。经TSA刺激后,用抗NonO抗体免疫共沉淀NonO蛋白后,经ChIP分析,发现TSA对NonO与TaRE片段的结合并不能产生影响。用NonOsiRNA敲低NonO蛋白后,用抗组蛋白4第12个赖氨酸乙酰化抗体进行ChIP分析,结果显示组蛋白4第12个赖氨酸乙酰化没有变化,NonO的RNA干扰不能影响其乙酰化过程。经TNFα或JNK1刺激后,用抗组蛋白3第9个赖氨酸乙酰化抗体进行ChIP分析,发现扩增出了PCR片段,证明NonO的RNA干扰影响了组蛋白3第9个赖氨酸的构型,使其由去乙酰化变成乙酰化。5.结论:(1)TNF-α通过作用于P4Hα1启动子上的反应元件,激活ASK1-MKK4-JNK1-NonO信号通路,使转录因子DJ-1氧化和转录因子NonO磷酸化,实现对P4Hα1的抑制作用。(2)这些结果揭示了炎症因子引起胶原降解的关键分子,对于减少斑块纤维帽的胶原降解、稳定易损斑块、抑制主动脉瘤的形成,提供了具有重要学术意义和潜在应用价值的治疗新靶点。论文二动脉粥样硬化斑块中精氨酸酶Ⅱ表达水平和调控机制的实验研究1.背景近年来,由动脉粥样硬化(AS)导致的心脑血管疾病已成为世界许多国家第一位致死性疾病。研究证明,在AS的长期病程中,血管内皮功能异常是最早可检出的异常,在多项临床试验中,高频血管超声技术所测量的肱动脉内皮功能异常已被作为预测急性心脑血管事件的替代终点。由内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric-oxide synthase,eNOS)所介导的一氧化氮(NO)的产生是血管内皮功能的最重要调节因素。NO具有扩张血管的直接作用,并可通过激活下游通路,抑制血小板粘附和聚集、血管平滑肌细胞的增殖和迁移以及内皮细胞表达黏附分子,从而起到抗AS的作用。已有研究表明,NO合成的减少会导致血管内皮功能的失调,继而促进AS病变或诱发心脑血管事件。大量的基础和临床研究已证明由eNOS所介导的NO的产生对于AS的发生和发展起着关键的作用。目前,文献中已报告3种类型的一氧化氮合酶,第一种一氧化氮合酶首先在大脑中被分离出来,故称为神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxidesynthase,nNOS),但其后在多种细胞包括血管内皮细胞中发现了nNOS的表达;第二种一氧化氮合酶首先从巨噬细胞中被分离出来,称为诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS);第三种一氧化氮合酶首先在主动脉内皮细胞中被发现,故称为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。在这三种一氧化氮合酶中,eNOS对于血管功能的调节最为重要。eNOS可被内皮细胞中的一些信号传导分子所激活,eNOS的构型变化尤其是磷酸化改变会直接影响eNOS的活性。左旋精氨酸是一个参与许多病理过程的半必需氨基酸,可被催化成为左旋脯氨酸、左旋鸟氨酸以及多聚氨酸,同时也是NO合酶的作用底物。在血管内皮细胞中,经eNOS作用后,左旋精氨酸转化为左旋瓜氨酸和NO,是NO的前体物质。由于NO在维持内皮功能中的关键作用和左旋精氨酸在NO合成中的重要地位,近年来一些学者对左旋精氨酸的血管保护作用进行了研究,结果表明左旋精氨酸-eNOS-NO通路参与AS的发生和发展过程。动物实验的结果证实,左旋精氨酸治疗可降低AS病变的发生率。精氨酸酶是一种尘物锰金属酶,可催化左旋精氨酸水解为左旋鸟氨酸和尿素。精氨酸酶有两个60%同源序列的同功异构体—精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ,它们在组织中的表达和细胞中的定位均不相同。精氨酸酶Ⅰ在肝脏内大量表达,并调节着体内大部分精氨酸酶的活性。精氨酸酶Ⅱ则在大部分组织中都有表达,尤其是肾脏和前列腺,但在肝脏中含量很少。最近的研究表明,在主动脉、肺动脉、颈动脉和冠状动脉等血管组织中,精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ的含量都很丰富。由于精氨酸酶有水解左旋精氨酸为左旋鸟氨酸和尿素的生物学功能,因此可与eNOS竞争分解左旋精氨酸,使左旋精氨酸向NO的转化减少。在巨噬细胞中对精氨酸的代谢过程的研究发现,左旋精氨酸向尿素的转化要多于向NO的转化,在动物体内抑制了精氨酸酶的表达后,NO的产量明显增高,在内皮细胞中的实验也证实抑制了精氨酸酶后,可刺激NO的合成。另外,精氨酸酶Ⅰ和精氨酸酶Ⅱ的过表达在降低左旋精氨酸水平的同时,也显著抑制了NO的含量。在精氨酸酶的两个同功异构体中,精氨酸酶Ⅱ与AS的关系更为密切。在人动脉内皮细胞中,针对精氨酸酶Ⅱ的RNA干扰降低了Ox-LDL对精氨酸酶的上调程度,增加了NO的表达。在ApoE基因敲除小鼠的主动脉早期AS病变中,精氨酸酶Ⅱ活性升高,NO水平降低。但这些研究主要局限于AS早期病变,随着斑块负荷的增大,精氨酸酶Ⅱ表达水平是否持续升高,eNOS表达水平是否持续下降,二者之间的关系如何,尚不清楚。因此,对于AS晚期病变,精氨酸酶Ⅱ能否作为敏感的生化标记物和有效的干预靶点是一个悬而未决的问题。此外,调节精氨酸酶Ⅱ的转录过程迄今不明,能否在启动子和转录因子水平抑制精氨酸酶Ⅱ的合成成为另一个悬而未决的问题。2.目的(1)在放置颈动脉狭窄套管的ApoE基因敲除小鼠中,建立斑块负荷较大的颈动脉AS模型,检测斑块内精氨酸酶Ⅱ和eNOS的表达水平。(2)寻找精氨酸酶Ⅱ的启动子活性片断以及与精氨酸酶Ⅱ启动子结合的转录因子,明确精氨酸酶Ⅱ的转录过程。3.方法3.1.质粒构建pGL3-baisc多克隆载体被用来构建包含精氨酸酶Ⅱ启动子片断的质粒。我们首先应用带有XhoⅠ和HindⅢ内切酶双酶切位点,并含有精氨酸酶Ⅱ启动子片断的引物对精氨酸酶Ⅱ启动子进行扩增。然后经PCR扩增、目的片断与载体的连接后构建pGL3-精氨酸酶Ⅱ启动子质粒。3.2.apoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的建立80只雄性apoE-/-小鼠均全程高脂饲料喂养(0.25%胆固醇+15%脂肪),并行颈动脉套管术,以诱发颈总动脉粥样硬化病变,喂养8周后提取斑块组织进行检测。3.3.细胞培养人HELA细胞和内皮细胞经原代培养和细胞传代后进行实验研究。3.4.免疫组化经漂洗,封闭,一抗和二抗孵育后测量NO,eNOS和精氨酸酶Ⅱ等因子在斑块的含量3.5.RT-PCR经RNA提取,逆转录和RT-PCR等步骤检测精氨酸酶启动子片断的活性。4.结果4.1.组织学检测4.1.1.HE染色HE染色发现,小鼠右侧颈总动脉狭窄套管内出现较大的斑块,斑块内膜和中膜面积明显增大,左侧颈总动脉无斑块生成。4.1.2.Masson染色ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉斑块中的胶原含量丰富。4.1.3.天狼猩红染色ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉斑块中的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原纤维均明显增多。4.1.4.油红0染色ApoE-/-小鼠右侧颈总动脉斑块中脂质成分明显增多。4.2.eNOS在斑块组织中的表达用免疫组化的方法检测了eNOS在ApoE-/-小鼠双侧颈总动脉中的蛋白表达,发现apoE-/-小鼠右颈总动脉的eNOS蛋白表达水平显著低于左侧。4.3.精氨酸酶Ⅱ在斑块组织中的表达通过免疫组化观察精氨酸酶Ⅱ在斑块中的表达后,发现与左侧颈总动脉相比,右颈颈总动脉斑块内的精氨酸酶Ⅱ蛋白表达水平明显升高。4.4.精氨酸酶Ⅱ启动子片断活性的检测我们将包含精氨酸酶Ⅱ启动子片段的质粒转入HELA细胞中,24小时后,用RT-PCR的方法观察荧光素酶的表达。发现启动子-704bp至-644bp片断承担了大部分的精氨酸酶Ⅱ启动子活性。4.5.与精氨酸酶Ⅱ启动子结合的转录因子的鉴定我们设计了包含精氨酸酶Ⅱ启动子-704bp至-644bp片断的生物素标记探针。用免疫共沉淀的方法沉淀下与探针结合的蛋白,经凝胶电泳后和考马斯亮蓝染色,切下清晰的条带后,进行质谱分析,发现了与精氨酸酶Ⅱ启动子片断结合的蛋白PARP1、PSPC1和SFPQ。5.结论(1)在斑块负荷较大的AS病变中,精氨酸酶Ⅱ的蛋白表达水平明显升高而eNOS蛋白表达水平明显降低。PARP1、PSPC1和SFPQ等转录因子结合于精氨酸酶Ⅱ启动子的活性区域,参与调节精氨酸酶Ⅱ的转录过程。(2)这些结果提示精氨酸酶Ⅱ可作为AS的生化标记物和干预靶点,通过高效、特异地抑制精氨酸酶Ⅱ的合成,可增强eNOS的活性和改善血管内皮功能,具有重要的学术意义和潜在的应用价值。论文三ACE2基因转染抑制早期动脉粥样硬化病变及其分子机制的实验研究1.背景近年来的研究认为,AS发生的始动环节是血管内皮细胞(VEC)损伤,VEC损伤后可表达粘附分子,后者可使单核细胞与血管内皮细胞相互粘附,继而在趋化因子的作用下,使单核细胞与T-淋巴细胞迁移入内膜下组织,然后单核细胞转变为巨噬细胞并吞噬脂质形成单核源性泡沫细胞,同时产生一系列炎症和免疫反应,从而促进AS的形成。单核细胞趋化因子(MCP-1)是一种强有力的趋化因子,主要作用是促进单核细胞聚集于内膜下,在AS的形成中起重要作用。近年研究还发现,在人类内皮细胞上有一种能够结合Ox-LDL的受体,称之为植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体(Lectin like Ox-LDL Receptor-1,LOX-1),LOX-1的激活进一步诱导了粘附分子的产生,导致内皮细胞功能的损伤。LOX-1的表达是VEC出现功能异常的早期标志,在AS的形成中起重要作用。因此,深入研究MCP-1、LOX-1等炎症因子和内皮细胞功能的变化,对明确AS早期病变的发生机制和防治措施至关重要。传统的观念认为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS系统的主要成分,最近发现了这一系统的许多新成员,包括ACE2、Ang-(1-7)、Ang-(1-9)等,这些物质的发现和对其病理生理学意义的研究使人们对RAS有了许多新的认识。ACE2是近年来发现的第一个ACE的同系化合物,与ACE一样,ACE2也是一种含锌的金属蛋白酶,完整的人类ACE2蛋白由805个氨基酸组成。目前发现的ACE2的生理功能主要有两点:能够高效催化AngⅡ转化为Ang-(1-7),这一途径的催化活性较ACE水解AngⅠ的催化活性高400倍。ACE2亦可使AngⅠ转化为Ang-(1-9),后者还可以进一步被ACE或其他的酶继续降解成为Ang-(1-7)。研究发现Ang-(1-7)是一种有重要生物学作用的血管紧张素家族的终末活性产物,是AngⅡ的内源性拮抗因子,具有扩张血管、降低血压、抑制平滑肌细胞增殖、利尿、利钠及抑制血管新生内膜增生等多种功能。近年来,ACE2及其催化产物Ang-(1-7)与心血管病的关系日益受重视。研究发现,新西兰大白兔AS斑块中有大量ACE2蛋白的表达,主要分布在血管内皮细胞和泡沫细胞,提示ACE2与AS斑块的病理过程密切相关。急性心肌梗死(AMI)的大鼠中ACE2及ACE基因的表达明显增多,免疫组化研究发现ACE2蛋白主要表达在血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞以及心肌细胞中。心力衰竭患者中心肌ACE2基因表达增多,ACE2过表达可抑制高血压大鼠的心肌纤维化,改善左室舒张功能,提示ACE2拮抗了ACE的功能。直接应用Ang-(1-7)还可改善急性心肌梗死的左室重构。这些研究提示ACE2过表达具有保护心血管的功能。通过增强ACE2的表达或直接应用Ang-(1-7),可拮抗ACE的作用,对AS及心脑血管病的治疗可起到积极的作用,从而有望成为心脑血管病的一个治疗新靶点。然而,ACE2过表达对于早期AS病变的作用及其分子机制至今不明。2.目的(1)在体内研究中,观察ACE2过表达对AS早期病变的抑制作用。(2)在体内和体外研究中,探讨ACE2过表达抑制早期AS病变的分子机制。3.方法3.1.ACE2表达质粒—复制缺陷重组腺病毒质粒Ad5-ACE2的构建将质粒PMD18-T-ACE2进行酶切,然后构建穿梭质粒(pDC316—ACE2)。穿梭质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组,形成重组腺病毒质粒,重组腺病毒质粒在HEK293细胞内包装成为复制缺陷重组腺病毒质粒Ad5-ACE2。2.2.ACE2基因治疗100只新西兰大白兔随机分为Ad-ACE2组(20只)、Ad-ACE2+A779组(20只)、Ad-EGFP组(20只)、单纯高脂对照组(20只)及单纯高脂对照+A779组(20只)。在所有实验兔中行腹主动脉内膜球囊损伤术并行4周高脂喂养,于4周末时开始基因治疗,向转染部位的管腔中分别注入滴度为2.5×10~9pfu/mL的Ad-ACE2或Ad-EGFP。在Ad-ACE2+A779组,除进行ACE2基因治疗外,加用Ang-(1-7)受体拮抗剂A779,用药具体用法为:经颈静脉泵入,浓度为200 ngkg~(-1) min~(-1),用药28天。3.3.内皮细胞的ACE2腺病毒转染首先用Ang-Ⅱ(终浓度为10~(-6)M/L)刺激细胞24小时,更换培养基后将ACE2腺病毒载体和EGFP腺病毒载体按1×10~6 pfu的浓度分别加入细胞培养基中,在ACE2基因转染24小时,48小时和72小时后提取细胞蛋白进行检测。用1×10~6mol Ang-(1-7)加入到内皮细胞培养基中,充分混匀后于37℃培养箱放置,于4小时,8小时,16小时和24小时提取蛋白进行检测。3.4.质谱分析用质谱分析的方法测量AS病变组织中Ang-(1-7)/Ang-Ⅱ比值和Ang-Ⅰ/Ang-Ⅱ比值,分别反映ACE2和ACE的活性。3.5.血脂水平检测在实验开始、4周末和8周末抽取兔的血液样本,留取血清,用酶学检测血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。3.6.免疫组化检测经漂洗、封闭、一抗和二抗孵育后测量LOX-1、MCP-1、ERK、p38等因子在AS组织中的含量3.7.RT-PCR经RNA提取,逆转录和RT-PCR检测AS病变组织中ACE2的表达。3.8.Western Blot经凝胶电泳、转膜、加入一抗和二抗后检测AS病变组织中ACE2、ACE、AT1R、MCP-1、LOX-1等因子的蛋白表达水平。4.结果4.1.基因转染后ACE2的表达提取兔的斑块组织,发现与Ad-EGFP组,单纯高脂对照组和单纯高脂对照+A779组相比,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的ACE2基因表达明显增高。用Western Blot的方法观察Ad-ACE2在细胞内的转染效率,发现与EGFP腺病毒转染组和对照组相比,ACE2的蛋白水平在腺病毒转染24小时后显著增高。4.2.ACE2基因转染对AS病变的影响通过对兔腹主动脉斑块的HE染色观察到,Ad-EGFP组、单纯高脂对照组、单纯高脂对照+A779组与Ad-ACE2组相比,AS病变的内膜面积显著增加,内膜与中膜面积比值增大。在加入了Ang-(1-7)受体拮抗剂-A779后,Ad-ACE2+A779组的内膜面积和内膜与中膜面积比值比Ad-ACE2组又明显增大。4.3.ACE2基因转染对MCP-1和LOX-1表达的影响以免疫组化方法检测斑块内MCP-1和LOX-1的蛋白表达,与Ad-ACE2组相比,Ad-EGFP组、单纯高脂对照组、单纯高脂对照+A779组中MCP-1和LOX-1蛋白表达水平升高。以ACE2腺病毒和A779刺激细胞后,用Western Blot观测MCP-1和LOX-1的蛋白水平,发现在ACE2腺病毒转染48小时后,与EGFP腺病毒转染组和对照组相比,MCP-1和LOX-1蛋白表达水平明显下降,但在加入A779后,发现ACE2对MCP-1和LOX-1表达的抑制作用了大部分被逆转。4.4.ACE2过表达对Ang-(1-7)蛋白表达的影响通过对腹主动脉斑块内Ang-(1-7)蛋白水平的检测发现,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的Ang-(1-7)表达高于Ad-EGFP组、对照组和A779组。ACE2基因转染24小时后,Ang-(1-7)蛋白水平与EGFP基因转染组和对照组相比明显升高。4.5.ACE2腺病毒转染对ACE表达的影响用免疫组化的方法对体内ACE蛋白表达水平的检测发现,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的ACE表达明显低于Ad-EGFP组、对照组和A779组。Western Blot检测内皮细胞ACE表达后发现,在ACE2腺病毒转染细胞24小时后,与EGFP基因转染组和对照组相比,ACE蛋白表达水平明显降低。4.6.ACE2腺病毒转染对AT1R表达的影响对AS组织进行Western Blot分析,发现Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的AT1R蛋白表达水平明显低于Ad-EGFP组、对照组和A779组。提取细胞蛋白后,用Western Blot检测AT1R的表达水平,发现在ACE2腺病毒转染细胞48小时后,AT1R蛋白表达水平明显下降。4.7.ACE2腺病毒转染对ERK-p38表达的影响对AS组织进行免疫组化检测,发现Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的ERK和p38蛋白表达比Ad-EGFP组、对照组和A779组显著降低。ACE2基因转染内皮细胞24小时后,与EGFP基因转染组和对照组相比,ERK和p38的蛋白表达水平明显下降。4.8.ACE2腺病毒转染PI3K-Akt表达的影响用Western Blot的方法观察了AS组织内PI3K和Akt通路的表达情况,结果显示,Ad-ACE2组和Ad-ACE2+A779组的PI3K和Akt蛋白表达比Ad-EGFP组、对照组和A779组明显升高。ACE2腺病毒转染细胞24小时后,与Ad-EGFP组和对照组相比,PI3K和Akt蛋白表达水平明显升高。4.9.ACE2腺病毒转染对ROS表达的影响我们在细胞中对Ang-Ⅱ下游通路ROS的表达进行了观测,发现ACE2基因转染48小时后,与Ad-EGFP组和对照组相比,ROS蛋白表达水平显著下降。加入A779后,与Ad-ACE2组相比,Ad-ACE2+A779组ROS蛋白表达水平明显回升。5.结论(1)ACE2通过多条信号通路的交互对话实现对AS早期病变的显著抑制作用,这些通路包括:Ang-Ⅱ-AT1R-ERK-p38-ACE,Ang-Ⅱ-AT1R-ROS-MCP-1/LOX-1,Ang-Ⅱ-AT1R-PI3K-Akt-LOX-1/MCP-1,Ang-(1-7)-ERK-p38-ACE,Ang-(1-7)-PI3K-Akt-LOX-1/MCP-1和Ang-(1-7)-ROS-MCP-1/LOX-1等。(2)通过选择性增强或抑制Ang-Ⅱ和Ang-(1-7)信号通路的交互作用,有可能起到抑制AS早期病变的作用,这为AS的治疗提供了多个具有重要理论意义和潜在应用价者的新靶点。
佚名[6]2009年在《中华老年心脑血管病杂志2009年第11卷主题词索引》文中指出说明:(1)本索引主题词按汉语拼音字母顺序排列,同主题词的文章按页码顺序排列。(2)在汉字相同的情况下.按数字、英文字母、希文字母顺序先后排列。(3)缩略语及未译出的原文按英文字母顺序排列在各(字母)部之首。(4)文题作者后括号内数字为期号,最后为起页。
卿立金[7]2012年在《清热解毒活血法干预动脉粥样硬化易损斑块的实验与临床研究》文中提出目的通过动物实验与临床研究,观察清热解毒活血法稳定动脉粥样硬化易损斑块的疗效以及从抗易损斑块炎症因子,特别是从CD40-CD40L信号通路方面探讨清热解毒活血法稳定易损斑块的可能机制,为清热解毒活血法稳定动脉粥样硬化易损斑块提供理论和实践依据。方法(一)实验研究本研究对50只新西兰白兔以普通饲料喂养1周后随机分为高剂量中药组、低剂量中药组、辛伐他汀组、模型对照组、正常对照组,每组10只。第2周除正常对照组外,其他四组采取经股动脉球囊损伤主动脉内膜,第3周开始改用高脂饲养10周建立兔动脉粥样硬化易损斑块模型,正常对照组予普通饲料饲养。第3周开始五组动物分别予以高、低剂量解毒活血方水煎剂、辛伐他汀、生理盐水、生理盐水灌胃,每日一次,连续10周。第13周实验结束时全部处死动物取动脉标本行病理形态学观察；采用免疫组化法观察斑块ICAM-1、 TNF-a表达；采用荧光定量PCR法检测动脉粥样硬化斑块内CD40mRNA及IL-1β mRNA表达水平；采用ELISA法检测血清炎症因子(sCD40L、 ICAM-1、 TNF-a、 IL-1水平,检测治疗前后血脂水平的变化。(二)临床研究按随机对照研究原则,将114例冠心病急性心肌梗死且行急诊冠状动脉造影,符合中医热毒血瘀辨证标准的患者,随机分为清热解毒活血组、活血组和西药对照组。分别予清热活血方+西医常规治疗、冠心二号方+西医常规治疗、西医常规治疗；疗程2周。重点观察治疗前后中医证侯评分、中医症状疗效、血清hs-CRP、 Fib、 PAgT及安全性指标变化。结果(一)实验研究动脉HE染色示正常对照组动脉组织结构正常；模型对照组动脉组织结构紊乱,内膜厚薄不一,局部斑块突出管腔,斑块内见泡沫细胞大量聚集,斑块表面覆盖纤维帽很薄,斑块表面形成溃疡,斑块破裂,呈现易损斑块特点。低剂量中药组内膜增厚,局部中度隆起,纤维帽较模型对照组厚,斑块内中等量泡沫细胞。高剂量中药组、辛伐他汀组主动脉内膜略有增厚,内皮细胞较完整,少许斑块突出管腔,斑块表面纤维帽较厚,斑块内见少量空泡状泡沫细胞,斑块呈稳定性斑块特点。高剂量中药组抑制粥样斑块内TNF-a、 ICAM-1免疫组化表达明显,斑块IL-1β基因水平与模型对照组比较,差异有显著性(P＜0.05),且优于辛伐他汀组(P＜0.05)；高剂量中药组与模型对照组比较,能降低血清ICAM-1、IL-1β水平,差异有显著性(P＜0.05),但与辛伐他汀差异无统计学意义(P＞0.05)。各干预组与模型对照组比较,都能降低血清TNF-a、sCD40水平,差异有显著性(P＜0.05),各干预组之间比较,辛伐他汀组有进一步降低血清TNF-a水平的趋势。高剂量中药组在抑制粥样斑块CD40基因表达作用明显,与模型对照组比较,差异有显著性(P＜0.05),高剂量中药组CD40基因表达接近正常对照组水平,两者比较差异无统计学意义。而低剂量中药组、辛伐他汀组与模型对照组比较,对斑块内CD40基因表达影响不明显。低剂量中药组与模型对照组比较,能降低血清sCD40水平、血清TNF-a水平,差异有显著性(P＜0.05)。在调脂方面,特别是降低LDL-C,辛伐他汀组优于中药组。(二)临床研究急性心肌梗死患者急性期中医“热毒”症候明显,清热解毒活血法能明显改善急性心肌梗死患者口干、口苦、烦躁、小便短黄、大便干结等中医症状积分,治疗后总积分明显低于活血组、西药对照组,差异有显著性(P＜0.05),活血组与西药对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。中医总体症状疗效清热解毒活血组优于活血组、西药对照组,差异有显著性(P＜0.05)。清热活血方降低血清hs-CRP、 PAgT水平优于活血组及西药对照组,差异有显著性(P＜0.05),血清Fib三组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。各组无明显不良反应。结论动物实验提示采用球囊损伤+高脂饲养法成功建立易损斑块动物模型。动脉HE染色提示解毒活血方、辛伐他汀对该模型斑块的易损性有拮抗作用,高剂量解毒活血方组优于西药辛伐他汀组及低剂量解毒活血方组。清热解毒活血法能降低该动物块模型多项炎症因子表达,对稳定易损斑块有一定的作用,且与药物浓度呈正相关。清热解毒活血法抑制易损斑块的机制可能通过抑制而非完全阻断动脉斑块内CD40/CD40L系统,打断CD40/CD40L系统与炎症因子之间的恶性循环,从而使CD40、 sCD40、TNF-a、ICAM-1、IL-1β水平降低,抑制易损斑块内炎症因子紊乱,从而稳定易损斑块。急性心肌梗死患者急性期中医“热毒”症候明显,清热解毒活血法能明显改善急性心肌梗死患者中医“热毒”症状,提高中医疗效；能降低血清hs-CRP水平,具有抗炎作用；进一步降低PAgT,与西药合用具有强化抗血小板的效应,降低血粘滞度趋势,进一步减少急性心肌梗死血小板聚集及支架置入术后血栓形成的可能,临床观察未出现出血并发症。因此,清热解毒活血法具有调整CD40/CD40L系统、抗炎、稳定易损斑块的作用,临床运用有效、安全。
胡娇娇[8]2011年在《IGF-1对动脉粥样硬化斑块易损性的实验性研究》文中进行了进一步梳理目的l通过高脂饲料喂养和球囊扩张术建立兔动脉粥样硬化模型,了解此模型所形成斑块的大体形态,以及显微镜下斑块的病理组成。2探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对实验性动脉粥样斑块易损性的影响。方法1动物造模:实验动物(24只雄性新西兰兔)购进后给予常规普通饲料喂养1周,以使其适应饲养环境,后实验组及正常对照组分别给予高脂饲料及普通饲料喂养,1周后正常组行假手术,实验组行动脉内膜球囊扩张术配合高脂饮食建立动脉粥样硬化模型。2实验分组及给药:将动物随机分为正常对照组、模型组、IGF-1因子干预组、辛伐他汀干预组,术后正常对照组继续给予普通饲料喂养,其余三组继续给予动物高脂饲料喂养,共10周,同时IGF-1干预组每天给予0.1mg/mL的IGF-1因子1mL腹腔注射、辛伐他汀干预组给予辛伐他汀悬浊液按2.5mg/kg给予灌胃(辛伐他汀片碾碎制成1mg/mL的悬浊液),模型组给予等量的生理盐水灌胃。3血脂测定:12周后处死动物,测血脂,采血前禁食水约12h。测定血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白水平。4用病理学染色和免疫组化染色,测量相关病理学指标及巨噬细胞、IGF-1的阳性面积。5用TUNEL法测定凋亡细胞的阳性面积。6检测结果用x ?s表示,各组间差异比较用单因素方差分析。用SPSS16.0分析软件进行统计分析结果。结果1血脂情况:实验12周末,模型组与正常对照组比较血脂各项指标水平差异均有统计学意义(p<0.05);辛伐他汀组血脂TC、TG、HDL、LDL水平与模型组型组相比均明显降低(p<0.05),IGF-1与模型组比较中四项指标中TG、HDL差异有统计学意义(p<0.05)。2病理学形态观察:正常对照组主动脉内膜光滑、三层结构清晰、内皮细胞排列整齐,未见脂纹及斑块形成。模型组主动脉管壁病变最重,管壁三层结构可见,但不清晰,内膜明显增厚,不光滑,内皮细胞损伤脱落呈连续性缺失,可见斑块突出管腔,斑块表面覆盖的纤维帽较薄,斑块内含有大量的巨噬/泡沫细胞,胆固醇结晶、平滑肌细胞等人类粥样斑块主要成分,部分标本可见弹力膜断裂和斑块破裂,表现为易损斑块的特点。3病理形态及免疫组化定量分析:①与模型组相比各药物干预组,斑块顶部纤维帽厚度、斑块肩部、顶部帽/核比值均有显著增加(P<0.05或P<0.01);②肩部纤维帽厚度比较:IGF-1组较模型组增加(p<0.05),模型组与辛伐他汀组间以及IGF-1与辛伐他汀组间差异无统计意义(p>0.05)。③与模型组相比,各药物干预组斑块脂核面积/斑块面积、斑块直径与对应管腔直径比较均显著降低(p<0.05或p<0.01),IGF-1组与辛伐他汀组比较二者差异无统计学意义(p>0.05)。④与模型组比较正常对照组、IGF-1组及辛伐他汀组中IGF-1阳性表达面积、显色强度及染色指数明显降低(P<0.05)。⑤高脂模型组斑块内巨噬细胞含量(RAM-11阳性面积)显著增加;与高脂模型组相比,各药物干预组斑块内巨噬细胞阳性细胞数量分级均显著为低(p<0.01),个药物干预组间无明显差异(p>0.05)。4凋亡细胞检测:与模型组比较,两药物干预组凋亡细胞阳性面积、染色强度及染色指数均明显减低(P<0.05)。结论1用高脂饲料喂养联合球囊扩张术建立的动脉粥样硬化模型,与人类粥样斑块的基本成分相似,其内存在大量的泡沫细胞、炎症细胞。2辛伐他汀能够显著减低血脂水平;IGF-1亦具有一定的调脂作用,可能有助于HDL的升高。3 IGF-1在一定程度上能够改善动脉粥样硬化易损性,对与易损斑块肩部纤维帽厚度改善情况可能优于辛伐他汀。
禹静[9]2017年在《超声实时弹性成像技术、超声造影及能谱CT检测颈动脉斑块的多模对照研究》文中提出目的通过建立新西兰兔动脉粥样硬化斑块模型的动物实验验证应用实时组织弹性成像技术、超声造影及能谱CT三种检查方法检测颈动脉粥样硬化斑块性质的可行性。通过对行颈动脉内膜剥脱术的患者的临床研究,并与病理结果对照,探讨三种检查方法在评价颈动脉粥样硬化性斑块性质的诊断价值,并比较诊断效能,为脑缺血事件的预防和治疗奠定基础。方法动物实验:1.选取12只3月龄的健康雄性新西兰兔,腹主动脉超声检查确认无动脉粥样硬化后,行高脂饲料喂养(1%胆固醇+8%蛋黄粉+8%猪油)。2个月后每2周行超声检查1次,于5~8个月发现斑块明显后,选择明显的斑块后于1周内进行弹性成像、超声造影和能谱CT三种检查评估斑块情况。2.超声检查:常规超声观察斑块大小及回声类型,启动实时弹性成像(RTE)技术,采用Itoh 5分法对RTE图像进行评分,评分标准:1分:斑块整体呈均匀绿色;2分:斑块呈蓝绿色相间,以绿色为主;3分:斑块呈蓝绿色相间,以蓝色为主;4分:斑块整体呈蓝色;5分:斑块完全呈蓝色,且斑块周围少部分组织也呈蓝色。1分预判为脂质斑块,2~3分预判为混合斑块,4~5分预判为纤维斑块。选取观察斑块为感兴趣区A(ROI A),同层面血液区域为ROI B。计算B/A比值(B/A Ratio)。B/A≤5预判为脂类斑块,B/A>5且B/A<20预判为混合斑块,B/A≥20预判为纤维斑块。并调用内置数据处理系统对斑块进行分析,得到蓝色区域面积百分比(AREA%)和弹性指数。3.超声造影:经肘静脉注入造影剂SonoVue,应用超声造影模式获取造影图像,观察斑块内有无增强,将斑块增强分为0~4级,分级标准为0级:无增强;1级:仅外膜增强而斑块内未见增强:2级:斑块内仅少量散在点状增强:3级:线状增强向斑块内部伸入;4级:斑块内弥漫性增强。并用Qlab分析软件分别计算斑块内EI值及斑块内EI值与动脉管腔内EI值的比值。4.能谱CT:应用造影剂碘海醇对兔行CT血管造影检查,选取GSI扫描模式,所有的图像进行单能量(MONO)和混合能量(QC)重建,参数同扫描设置,使用图像分析软件逐层计算混合能量,分析血管内腔与整个血管面积比。5.三种检查方式的对比实验结束后行空气栓塞法安乐死新西兰兔,立刻解剖分离其腹主动脉经脱水,包埋,切片,染色后光镜观察斑块并对比以上三种检查方式。参照美国心脏病协会(American Heart Association,AHA)分类标准(修订版)判断斑块性质,包括脂类斑块(Ⅳ型)、混合斑块(Ⅴ型、Ⅵ型)和纤维斑块(Ⅶ型)。临床试验:1.选取2014年10月至2017年6月临床确诊的颈动脉粥样硬化疾病并行颈动脉内膜剥脱术患者45例,其中男29例,女16例,年龄42~77岁,中位年龄62岁,行上述3种检查方式评估颈动脉斑块情况并与病理结果相对照。2.超声检查:常规观察斑块大小及回声类型,启动实时弹性成像(RTE)技术,采用Itoh 5分法对RTE图像进行评分,评分标准:1分:斑块整体呈均匀绿色;2分:斑块呈蓝绿色相间,以绿色为主;3分:斑块呈蓝绿色相间,以蓝色为主;4分:斑块整体呈蓝色;5分:斑块完全呈蓝色,且斑块周围少部分组织也呈蓝色。1分预判为脂质斑块,2~3分预判为混合斑块,4~5分预判为纤维斑块。选取观察斑块为感兴趣区A(ROI A),同层面血液区域为ROI B。计算B/A比值(B/A Ratio)。B/A≤5预判为脂类斑块,B/A>5且B/A<20预判为混合斑块,B/A≥20预判为纤维斑块。并调用内置数据处理系统对ROI进行分析,得到蓝色区域面积百分比(AREA%)和弹性指数。3.超声造影:选取感兴趣斑块,经肘静脉注入造影剂SonoVue,应用超声造影模式获取造影图像,将斑块增强分为0~4级,分级标准为0级:无增强;1级:仅外膜增强而斑块内未见增强:2级:斑块内仅少量散在点状增强:3级:线状增强向斑块内部伸入;4级:斑块内弥漫性增强,0~1级预判为稳定斑块,2~4级预判为易损斑块。并分别计算斑块内EI值及斑块内EI值与颈动脉管腔内EI值的比值。4.能谱CT:应用造影剂碘海醇行CTA检查,选取GSI扫描模式,CT图像上传至GE能谱CT工作站,重建能谱曲线、碘基物质浓度、有效原子序数图像。5.病理:参照美国心脏病协会(American Heart Association,AHA)分类标准(修订版)判断斑块性质,包括脂类斑块(Ⅳ型)、混合斑块(Ⅴ型、Ⅵ型)和纤维斑块(Ⅶ型),易损斑块(Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型)、稳定斑块纤维斑块(Ⅶ型)。6.使用四格表统计弹性评分、应变率比值、能谱CT斜率、碘基浓度、有效原子序数等在诊断颈动脉斑块中的灵敏度、特异度。绘制不同检查技术及不同检查技术联合评分模型诊断易损斑块与稳定斑块的受试者工作特性曲线并对比曲线下面积。结果动物实验:12只兔建模成功,病理结果显示脂质斑块6例,混合斑块4例,纤维斑块2例。超声检查分别显示均匀高回声斑块2处,不均匀高回声6处,不均匀低回声4处。弹性评分1~4分,应变率比值为14.29±15.06(最小值为2.02、最大值为36.23)。超声造影检查斑块增强程度呈0~4级,EI为4.01±0.91dB(最小值为2.82dB、最大值为5.11 dB)、Ratio为0.30±0.07(最小值为0.20、最大值为0.39)。能谱CT检查血管内腔面积(LA)、整个血管面积(TVA)分别为1.46±0.36mm~2(最小值为1.01mm~2,最大值为1.88 mm~2)、4.41±0.53mm~2(最小值为3.69 mm~2,最大值为5.13 mm~2),,病理LA、TVA分别为1.69±0.41mm~2(最小值为1.17 mm~2,最大值为2.41 mm~2)及2.19±0.51mm~2(最小值为1.47 mm~2,最大值为2.99 mm~2)。临床试验:45例患者行颈动脉内膜剥脱术,其中脂质斑块13处、混合斑块18处、纤维斑块14处。1.超声检查:共发现低回声斑块10处,混合回声斑块26处,高回声斑块9处。斑块厚度0.20-0.39cm(平均0.28±0.07cm)。弹性评分预判脂质斑块12个、混合斑块23个、纤维斑块10个,应变率比值预判脂质斑块14个、混合斑块20个、纤维斑11个。不同病理类型斑块的弹性评分、应变率比值及蓝色区域面积百分比(AREA%)和弹性指数不同,差别有统计学意义,脂质斑块、混合斑块及纤维斑块的各参数均逐渐增加,脂质斑块、混合斑块、纤维斑块弹性评分分别为1.14±0.54、2.74±0.75、4.16±0.65;应变率比值分别为3.55±0.78、9.78±3.63、30.55±19.79;AREA%分别为18.43±2.81、61.32±16.70、80.64±16.54;弹性指数分别为0.67±0.32、1.96±0.29、3.76±0.46。超声造影分级预判稳定斑块(0~1级)11例,易损斑块(2~4级)34例,不同病理类型颈动脉斑块的超声造影EI及Ratio比较差异均有统计学意义(均P<0.05),脂质斑块、混合斑块及纤维斑块造影EI及Ratio逐渐减低。脂质斑块、混合斑块、纤维斑块EI分别为4.43±2.09、2.45±1.88、1.82±1.03,Ratio分别为0.35±0.13、0.21±0.10、0.17±0.11。2.能谱CT:能谱CT曲线斜率预判脂质斑块13个、混合斑块19个、纤维斑块13个,有效原子序数预判脂质斑块10个、混合斑块22个、纤维斑块13个,碘基物质浓度预判脂质斑块10个、混合斑块23个、纤维斑块12个。不同病理类型斑块能谱CT曲线斜率和有效原子序数测值不同,差别有统计学意义,脂质斑块、混合斑块及纤维斑块测值逐渐增高。脂质斑块CT值、曲线斜率及有效原子序数分别为40.58±12.77、-3.54±0.77、3.21±0.87,混合回声斑块CT值、曲线斜率及有效原子序数分别为80.02±14.65、0.46±0.70、7.88±0.60,而纤维斑块CT值、曲线斜率及有效原子序数分别为77.55±15.33、2.33±0.57、8.56±0.69。3.实时超声弹性成像技术、超声造影及能谱CT检测颈动脉斑块性质的对比分析:结果提示超声弹性成像技术中弹性评分和应变率比值对脂质斑块检出的灵敏度和特异度相对较高;能谱CT对纤维斑块检出的灵敏度和特异度相对较高。超声弹性成像技术对易损斑块的诊断效能高于能谱CT,而超声弹性成像、超声造影及能谱CT联合对颈动脉斑块性质诊断的效能高于超声弹性成像技术与超声造影技术的联合及能谱CT三项技术的联合。结论1.高脂饲料喂养法建立新西兰兔动脉粥样硬化斑块模型操作简单,成功率高。弹性成像、超声造影及能谱CT三种检查结果与病理结果比较相符,验证了临床研究的可行性。2.与病理对照,超声弹性成像技术中的弹性评分和应变率比值对脂质斑块的敏感性和特异性较高,能谱CT对纤维斑块的敏感性和特异性较高,超声弹性成像技术结合超声造影对易损斑块的诊断效能高于能谱CT,因此对颈动脉斑块易损斑块的检查超声应作为首选。3.实时超声弹性成像、超声造影及能谱CT三种检查方法从不同角度评估斑块,其优势互补,联合应用可以更全面的预测颈动脉斑块的稳定性。
闫盛[10]2009年在《染料木黄酮对兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后血管重塑的影响》文中研究表明目的:1、评价20mg/kg染料木黄酮对兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后血管重塑(VR)的干预作用。2、探讨兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后20mg/kg染料木黄酮对血管壁MMP-2的表达及血浆NO、ET-1水平的影响。材料和方法:1、动物模型和分组6月龄成年雄性新西兰大白兔56只,分兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后普通饮食组28只、兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后20mg/kg染料木黄酮干预组28只。兔左侧颈总动脉内膜剥脱+颈前静脉自体静脉移植制作再狭窄模型,对侧假手术颈总动脉及颈前静脉为对照组,造模后取3天、7天、14天和42天4个观察时间点,每个时间点选7只模型动物,留取血浆后,血管标本原位灌注固定取材。2、病理学资料图像分析采用病理图像分析系统对标本HE,Masson染色片进行形态计量分析。3、免疫组化分析术后3天、7天、14天、42天免疫组化法测定血管标本中MMP-2的表达。4、化学法分析分别于造模前和造模后3天、7天、14天、42天采血测量血浆中NO的水平。用硝酸还原酶法测定硝酸根推算血浆NO水平,采用的NO试剂盒由南京建成生物所提供,血样由同一批试剂测试。5、用放免法测定血浆ET-1水平,采用的ET-1试剂盒由北京普尔伟业有限公司提供。结果:一、染料木黄酮对兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后血管重塑的影响。1、内膜剥脱+自体静脉移植术后,移植静脉血管腔面积(LA)总体呈逐渐缩小趋势,3天组LA较对照组明显增大,7天、14天、42天组LA明显缩小,小于对照组并可见弹力纤维形成。染料木黄酮可明显抑制移植静脉的收缩性重塑,用药3天组LA较对照组无明显变化,14天、42天时LA较术后普通饮食组明显增大,有效抑制了收缩性血管重塑,有统计学意义。2、内膜剥脱+自体静脉移植术后,吻合口近端颈动脉内、外弹力板面积总体呈逐渐缩小趋势,术后3天、7天吻合口近端颈动脉呈现收缩性重塑,内膜局部形成;14天、42天时吻合口近端颈动脉LA明显缩小同时并发血管的收缩和硬化斑块的形成:染料木黄酮可明显抑制颈动脉的收缩性重塑。染料木黄酮干预组在术后3天时LA较对照组有显著性差异,7天时内外弹力板回缩较对照组有所减轻,14天、42天时内外弹力板回缩较对照组明显减轻,平滑肌细胞增殖减轻,有效抑制了收缩性血管重塑。二、染料木黄酮对兔颈动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后MMP-2、NO、ET-1表达的影响1.血浆NO水平在术后3天、7天、14天时呈现低表达,42天时较造模前采血组,无显著性差异。染料木黄酮组3天、7天、14天时表达高于术后普通饮食组但低于造模前采血组,有统计学意义,42天时染料木黄酮组较造模前采血组无显著差异性。2.血浆ET-1水平在自体静脉移植术后普通饮食组呈现高表达,3天时明显升高后逐渐回落,42天时于造模前采血组无明显差异(P>0.05)。染料木黄酮组3天、7天、14天时表达低于术后普通饮食组(P<0.05),42天时染料木黄酮组较造模前采血组无明显差异(P>0.05)。3.血管壁MMP-2表达高峰出现至第14天。血管壁各层和总MMP-2表达率分别与对应血管重塑具有明显的相关性。染料木黄酮可以明显抑制MMP-2的表达。结论:1、本实验成功地制作了兔颈总动脉内膜剥脱+自体静脉移植术后再狭窄模型。2、再狭窄过程中动脉存在收缩性重塑现象,管腔的狭窄与否取决于血管重塑指数的变化。内弹力板面积(IELA)和外弹力板面积(EELA)可作为判断管腔狭窄及评价血管重塑的指标。染料木黄酮可明显减轻动脉的收缩性重塑。3、再狭窄过程中移植静脉存在扩张性和收缩性重塑现象,染料木黄酮可明显减轻静脉的收缩性重塑及内膜的增生。4、染料木黄酮可以抑制MMP-2、ET-1的产生,增加NO的产生,减轻术后再狭窄。
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