张红艳[1]2003年在《彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究》文中认为享有“绿色产品”、“生态珍品”的天然彩色棉因其独特的优势和特性，成为目前研究的热点之一。运用转基因技术提高植物抗性，为植物遗传育种提供了一条新的途径。作者在实验中对彩色棉再生体系建立中的一些影响因子作了探讨，并对利用农杆菌介导法将抗病基因兔防御素NP-1导入彩色棉的前期工作进行了初步研究。 选用彩色棉优良品种(棕色)：新彩1号、新彩2号。以下胚轴和子叶作为外植体，确立了5～6日苗龄的彩色棉下胚轴是较好的愈伤组织诱导外植体。不同激素组合及浓度对愈伤组织的诱导有重要作用，2，4-D是愈伤组织诱导中重要的激素，在附加有0.1mol／L 2，4-D+0.1mol／L KT的MSB培养基上，诱导形成的愈伤组织质地疏松、生长旺盛，有利于分化为胚性愈伤。比较了不同糖源在愈伤组织诱导中的效应，在蔗糖和葡萄糖为糖源的培养基中，愈伤组织诱导率均为100％，但葡萄糖更有利于愈伤组织的形成和生长，蔗糖的诱导效果次之；麦芽糖和乳糖对愈伤组织的诱导效应不及蔗糖和葡萄糖；甘露醇作为糖源则抑制了愈伤组织的诱导和生长。在胚性愈伤组织的诱导培养中，KNO_3加倍和NH_4NO_3减半的组合利于胚性愈伤组织的发生。 实验中，利用石蜡切片法和扫描电镜技术对愈伤组织的发生及细胞整体形貌进行了观察。结果表明，存在不同的两类愈伤组织，第一类愈伤组织多呈淡黄色、黄绿色或灰色，质地疏松，生长旺盛，易于分化为胚性愈伤，且该类愈伤组织来源于皮层细胞；第二类愈伤多呈深绿色或白色致密状，生长缓慢，不利于分化为胚性愈伤。 在根癌农杆菌介导的转化过程中，对选择性抗生素Kan的最适浓度、外植体与农杆菌的感染时间、共培养时间以及乙酰丁香酮的效应等进行了初步研究。外植体经农杆菌浸染10min，共培养48h较为合适，在添加头孢霉素500mg／L、卡那霉素50mg／L的培养基中筛选抗性愈伤组织。
张红艳, 李冠, 李仁敬[2]2004年在《彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究》文中进行了进一步梳理选用彩色棉优良品种(棕色):新彩1号、新彩2号.以下胚轴和子叶作为外植体,确立了5～6日苗龄的彩色棉下胚轴是较好的愈伤组织诱导外植体.不同激素组合及浓度对愈伤组织的诱导有重要作用,2,4-D是愈伤组织诱导中重要的激素,在附加有0.1mol/L2,4-D+0.1mol/LKT的MSB培养基上,诱导形成的愈伤组织质地疏松、生长旺盛,有利于分化为胚性愈伤.比较了不同糖源在愈伤组织诱导中的效应,在蔗糖和葡萄糖为糖源的培养基中,愈伤组织诱导率均为100%,但葡萄糖更有利于愈伤组织的形成和生长,蔗糖的诱导效果次之;麦芽糖和乳糖对愈伤组织的诱导效应不及蔗糖和葡萄糖;甘露醇作为糖源则抑制了愈伤组织的诱导和生长.在胚性愈伤组织的诱导培养中,KNO3加倍和NH4NO3减半的组合利于胚性愈伤组织的发生.在根癌农杆菌介导的抗病基因兔防御素NP-1转化过程中,外植体经农杆菌浸染10min,共培养48h较为合适,在添加头孢霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L的培养基中筛选抗性愈伤组织.
冯鸿杰[3]2014年在《天然彩色棉纤维色素物质的鉴定及其代谢机制研究》文中研究指明目的：天然彩色棉是一种成熟纤维具有天然色彩的棉花，其健康、环保的特性迎合了市场的需求，具有广阔的发展前景。但是，天然彩色棉色彩单调、色素遗传不稳定等严重制约了彩色棉的开发和利用。由于缺乏除棕、绿两种颜色之外的其他颜色的种质资源，通过常规的杂交手段难以解决目前彩色棉颜色单调的问题。人们寄希望利用基因工程手段来改变彩色棉纤维的颜色，完成这项工作的前提是明确彩色棉纤维色素形成的分子机制。因而，分离、鉴定彩色棉纤维色素物质并解析其形成的分子机制将为利用基因工程手段改良彩色棉纤维色泽品质提供理论基础。方法：（1）通过MALDI-TOF MS、NMR及HPLC等方法，鉴定棕色棉纤维中原花色素的的种类、分子质量、聚合度、基本结构单元及其空间连接方式；分析原花色素合成、转运过程中的关键基因GhANR、GhLAR和GhMATE表达模式，利用Gateway技术构建GhANR基因的过表达和干扰载体，分别转化白色棉和棕色棉。（2）用脂溶性和水溶性提取液，提取分离绿色棉纤维色素物质。克隆绿色棉纤维中的4CL基因，筛选绿色棉纤维中优势表达的4CL基因，利用Gateway技术构建其过表达和干扰载体，转化白色棉和绿色棉。结果与结论：（1）棕色棉纤维中原花色素是由90.1%的原翠雀素和9.9%原花青素组成，其基本结构单元黄烷-3-醇的空间立体结构为2,3-顺式构型（即表棓儿茶素/表儿茶素）；白色棉纤维中原花色素大约是由等比例的的原翠雀素和原花青素（约为1:1.05）组成，其基本结构单元黄烷-3-醇结的空间立体结构为2,3-顺式构型（即表棓儿茶素/表儿茶素）。另外，白色棉纤维中的原花色素结构中还存在一定比例的棓酰基。在棕色棉纤维发育过程中原花色素的含量和聚合度急剧增加，30DPA达到最大，随后逐渐减少。与白色棉相比，棕色棉纤维中原花青素含量显着高于白色棉纤维，聚合度也较白色棉大。香草醛-盐酸反应实验表明，成熟的棕色棉和白色纤维均检测不到原花色素，但是，未成熟棕色棉纤维中含有大量的原花色素，而白色棉从发育15DPA纤维开始原花色素含量明显减少。Borntrager‘s反应实验表明，随着纤维发育，醌类化合物在棕色棉中含量逐渐增多，而且在成熟纤维中含量仍然很高。相反，未成熟的和成熟的白色棉纤维均没有颜色变化，表明白色棉纤维中没有醌类化合物的积累。上述实验表明，原花色素氧化成的醌类物质是棕色棉颜色形成的直接原因，原花色素在棕色棉纤维中的形成是棕色棉纤维颜色形成的根本原因。在棕色棉纤维发育过程中，GhANR基因的转录水平很高，而GhLAR的表达几乎就检测不到。基因GhMATE1a和GhMATE1b均具有12个跨膜域，聚类分析发现，其与拟南芥TT12、苜蓿MATE1等蛋白聚为一类，暗示棕色棉纤维中GhMATE1a和GhMATE1b可能与无酰基化修饰的原花色素前体的转运有关。表达分析还发现，GhMATE1a和GhMATE1b在棕色棉纤维中的转录水平比在白色棉纤维高，分别在21DPA和27DPA达到最大转录水平。克隆并构建了GhANR的过表达和干扰载体，转化棉花，得到7棵过表达阳性再生植株T0代，收获T1种子，待进一步验证。（2）从绿色棉纤维脂溶性提取溶液中分离得到苹果酸甲酯和苹果酸二甲脂，没有发现有颜色化合物（除我们前期分离得到的咖啡酰基甘油酯类外）；水溶性提取液中分离得到没食子酸和鞣花酸（主要是没食子酸）。由于没食子酸及其衍生物与葡萄糖或多酚可以通过酯键形成水解单宁，呈现淡黄色至浅棕色夜色，推测绿色棉纤维色素可能也与苯丙烷类衍生物代谢途径有关。从绿色棉纤维中克隆获得了叁个4CL基因，生物信息学分析发现这3个基因均具有Motif I—AMP结合功能域和Motif II保守域；通过与已知功能基因聚类分析和3个4CL基因在棉花各组织中中的表达分析，推断Gh4CL1可能参与绿色棉现在中黄酮类色素物质的代谢，Gh4CL3可能参与绿色棉现在中咖啡酸及其衍生物的代谢，Gh4CL4参与棉纤维中木质素（也可能是纤维素）的代谢。基于此，构建Gh4CL3的表达载体和干扰载体，转化棉花，得到7棵阳性过表达再生植株T0代，收获T1种子，待进一步验证。
范芸[4]2011年在《LTP、GAFP基因转化甘蓝型油菜及其抗病性的研究》文中指出油菜是世界四大油料作物之一,其用途广泛,经济价值高。在中国,油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)居油菜叁大病害之首,严重影响了我国的油菜生产。近年来,随着生物技术的发展,许多学者通过基因工程的手段研究油菜的抗病性。研究表明,植物脂质转移蛋白(Lipid Transfer Protein,LTP)、天麻抗真菌蛋白(Gastrodia Antifungal Protein, GAFP)具有广谱抗病菌、真菌的活性。为研究LTP、GAFP基因对植物抗病的作用及获得抗菌核病的油菜植株,本研究以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)为试验材料,将LTP和GAFP基因进行农杆菌介导的遗传转化。主要工作和结果如下：1、LTP基因转化甘蓝型油菜(1)通过改变外植体的培养时间,菌液浓度,培养基的激素配比,培养条件等,优化了油菜子叶柄遗传转化体系；(2)对To代再生植株进行PCR检测,得到阳性植株12棵,自交结实后收取T1代种子；T1代植株PCR检测出阳性条带,说明目的基因转入；(3)通过苗期离体叶片菌核病菌丝体接种法,对T1代植株抗病性进行鉴定,鉴定结果发现转基因T1代植株的抗病能力优于对照“扬油6号”；(4)草酸是核盘菌的次生代谢物,众多研究证明油菜对草酸的抗性与对病原的抗性一致。种子萌发能力实验表明,草酸胁迫下转基因T1代种子发芽率要明显高于对照“扬油6号”；(5)对转基因T1代幼苗和对照“扬油6号”幼苗用草酸处理24h后,进行生理指标检测。结果显示,胁迫条件下转基因T1代幼苗中MDA含量(与抗病能力负相关)更低,SOD活性和POD活性(与抗病能力正相关)更高。2.GAFP基因转化甘蓝型油菜(1)通过探讨下胚轴诱导愈伤组织的影响因素,优化油菜下胚轴转化体系；(2)对To代再生植株进行PCR检测,得到阳性植株10棵；(3)对To代PCR检测为阳性的植株进一步分子检测,RT-PCR结果为阳性,说明转入的基因得到了表达。
李博[5]2012年在《棉花Cry5b Bt基因的转化及检测》文中认为随着基因工程技术的不断发展,利用基因工程的技术手段来培育转基因抗虫棉新品种,已经成为棉花遗传育种研究的热点课题和重要研究方向。本研究是国家转基因重大专项—“高产优质新型转基因抗虫棉花新品种(系)的培育”项目(2009：ZX08005-012B)中的部分研究内容。Cry5bBt基因是一个新的抗虫基因,是根据棉花遗传密码子偏好及Genebank上Cry5bBt基因序列人工合成,其表达载体为PRI101-AN(由takara公司合成),含有卡那霉素抗性选择标记基因(NPTⅡ)。本研究采用花粉管通道法将Cry5b Bt基因注射到棉花幼铃中,获得转化种子T0代,再经遗传转化检测,获得了T1、T2、T3代的检测结果。主要研究结果如下：1、受体棉铃喷施赤霉素可显着提高成铃率以非转基因棉花品系晋1和转基因棉花品系JX010为受体材料,经花粉管通道法注射含有Cry5b Bt目的基因的质粒后,立即向受体棉铃喷施50μg/ml的赤霉素,其成铃率可达到44.6%,比喷清水对照的成铃率高15.5%。2、不同世代的遗传转化率将花粉管通道法转化获得的2529粒晋1种子,在田间进行卡那霉素检测,T1代阳性株率为7.76%。对卡那霉素反应的阳性植株进一步进行PCR检测,去除假阳性株,检测结果表明,T1代基因转化株率为2.35%。从晋1T1代转化株(PCR检测阳性株)获得的种子大田种植,经卡那霉素检测,其阳性株率为73.1%,再对卡那霉素检测阳性株进行PCR检测,结果表明T2代的转基因株率为55.8%。晋1T2代转化株(PCR检测阳性株)获得的种子大田种植,经卡那霉素检测,其阳性株率为95.5%。JX010T1代通过PCR检测表明,其转基因株率为3.41%,T1代转化株(PCR检测阳性株)种子收获后经种植得到T2代经PCR检测,其转基因株率为52.4%。3、PCR反应条件的优化通过对本试验的PCR反应条件进行优化,获得了较适合的PCR反应体系,即20ng模板DNA,2μl的10×Tag Buffer,0.5μl Tag DNA聚合酶(2.5U/μl),0.6μl的dNTP(10mM/L)和0.2μl的引物,其余用超纯水补足20μ l。4、转化株的抗虫分析通过对T2代晋1和JX010PCR检测呈阳性的植株进行棉铃虫抗性测试,结果表明,在第二、叁、四代棉铃虫发生盛期,T2代晋1叶片对棉铃虫抗性的校正死亡率分别为85.42%、75.35%、62.79%,比对照GK19分别高2.43%、高1.79%、低0.80%；T2代JX010叶片对棉铃虫抗性的校正死亡率分别为81.37%、72.58%、69.19%,比对照GK19分别低1.62%、低0.71%、高5.60%。结果表明,尽管转化群体尚未稳定,但对鳞翅目害虫的抗性已与对照GK19无显着差异。
吕秀娟[6]2007年在《新疆陆地棉转化雪莲磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因的研究》文中指出本研究根据植物表达载体的构建策略首次成功构建了含雪莲磷脂酰乙醇胺结合蛋白(XLPEBP)基因的植物高效双元表达载体pXLPEBP,通过农杆菌介导法和花粉管通道法对选定的新疆陆地棉早熟品种进行了遗传转化,主要研究结果如下:1构建了植物表达载体pXLPEBP构建成携带有非编码序列的XLPEBP全长基因片段、CaMV35S启动子和GUS报告基因的高效双元植物表达载体pXLPEBP。2初步建立了陆地棉遗传转化体系(1)以农杆菌介导法对选定品种陆地棉进行遗传转化,筛选到了茎尖生长最适培养基和茎段愈伤组织生长最适培养基,研究了菌液浓度、不同激素浓度、感菌时间及共培养天数对转化率的影响。(2)研究了棉花茎尖和茎段外植体对卡那霉素的敏感性,确定了转基因筛选的抗生素最佳选择压力。3获得了GUS基因检测阳性的棉花愈伤组织4获得了转化小苗5用花粉管通道法对陆地棉进行了遗传转化
参考文献：
[1]. 彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究[D]. 张红艳. 新疆大学. 2003
[2]. 彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究[J]. 张红艳, 李冠, 李仁敬. 新疆大学学报(自然科学版). 2004
[3]. 天然彩色棉纤维色素物质的鉴定及其代谢机制研究[D]. 冯鸿杰. 石河子大学. 2014
[4]. LTP、GAFP基因转化甘蓝型油菜及其抗病性的研究[D]. 范芸. 扬州大学. 2011
[5]. 棉花Cry5b Bt基因的转化及检测[D]. 李博. 湖南农业大学. 2012
[6]. 新疆陆地棉转化雪莲磷脂酰乙醇胺结合蛋白基因的研究[D]. 吕秀娟. 新疆农业大学. 2007