赵志军[1]2003年在《猪瘟病毒E2基因克隆、序列分析及最佳猪瘟免疫程序的制定》文中进行了进一步梳理猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的一种病毒性传染病。猪瘟兔化弱毒疫苗有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但自80年代以来，我国出现了温和型、非典型性猪瘟。本研究主要是对猪瘟兔化弱毒疫苗、猪瘟病毒野毒株抗原基因(E2)进行序列分析和同源性比较，分析发生非典型性猪瘟的原因，并在此基础上制定最佳猪瘟免疫程序。 以猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞毒(HCLV)中提取的细胞总RNA为模板，以RT-PCR技术，扩增出了完整E2基因的cDNA片段。经电泳、酶切分析，证实了所扩增片段为E2基因特异性片段。随后对其进行了核苷酸序列测定和氨基酸序列的推导和同源性分析。收集疑似猪瘟病料13份，经荧光抗体检查、兔体交互免疫试验，结果均为阳性。取其中2份(HC-JN：来源于江苏省江宁县、HC-YC来源于江苏省盐城市)，接种PK-15传代细胞，分离培养，获得猪瘟病毒野毒第六代细胞毒(HCV-JN，HCV-YC)。以此病毒RNA为模板，利用RT-PCR技术，扩增出了猪瘟野毒株HCV-JN、HCV-YC完整的E2基因，用pMD-18T载体克隆，经电泳检测、酶切分析及PCR鉴定初步证实了所扩增片段的特异性。随后对其进行了核苷酸序列测定和氨基酸序列的推导，并与测得的HCLV、国外测得的C株(FC)及我国的SHIMEN株、法国的Alfort株等的相应序列进行了同源性比较。结果发现，HCLV与FC间核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为98.3％、99.2％；两个野毒株与HCLV和FC株之间的同源性也分别在98％以上，与Alfort株的同源性最低，分别在83％、89％左右。据此，可推测HCLV、猪瘟野毒株和C株之间的E2基因序列及氨基酸序列无明显差异。 给空怀母猪接种不同剂量的猪瘟兔化弱毒疫苗，分别于不同时期用PPA-ELISA检测血清抗体。结果表明，每年免疫2次，4头份／次，可使怀孕母猪的猪瘟抗体全年均维持在较高水平，此程序为繁殖母猪的最佳免疫程序。初生健康仔猪不进行免疫，于不同日龄检测其母源抗体的水平，确定仔猪的最佳初免时间为乳前免疫或25日龄免疫。选择健康仔猪于不同日龄、不同免疫剂量接种HCLV细胞苗，再分别于不同时期检测抗体，结果表明，0日龄2头份或25日龄4头份首免，60日龄加强免疫4头份可使仔猪在整个育肥期得到有效的免疫保护。攻毒试验再一次证实仔猪按此程序2次免疫，于150日龄攻毒时试验组均未发病，保护率100％。
何丹妮[2]2012年在《猪源Mx1蛋白的表达及其抗猪瘟病毒感染的研究》文中进行了进一步梳理Mx(Myxovirus resistance)是一种由I型干扰素(IFNa/β)诱导的具有GTP酶活性的抗病毒蛋白,具有广谱抗病毒活性。对Mx蛋白多种多样抗病毒活性机制研究非常重要。作为Mx蛋白家族的一员,猪Mx1蛋白已经被证实对流感病毒和水疱性口炎病毒有强大的抗病毒能力,但目前国内外尚未报道对猪瘟病毒的抗病毒研究。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的严重危害养猪业的传染性疾病,被国际兽医局(OIE)列为必须通报的传染病之一。本文对猪Mx1蛋白进行了原核表达和真核表达,制备鼠抗多克隆抗体,在细胞上研究猪Mx1蛋白的抗病毒活性。1.猪源Mx1基因的原核表达、鉴定及抗血清制备本研究通过设计一对特异性引物,从pT-poMx1中扩增出Mx1基因开放式阅读框(1992bp),并将其编码区插入到携带GST标签的原核表达载体PGEX-6p-1中,经酶切和序列测定后,构建了重组质粒PGEX-poMx1;将其转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白并分析表达效果。结果表明：经终浓度为0.8mmol/L IPTG诱导后4h, poMx1基因在BL21(DE3)中获得高效表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量为99KDa。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备了特异性多抗血清,Western blot结果显示该抗血清与融合蛋白孵育反应后有明显的特异性条带,该研究为poMx1蛋白抗病毒的效果鉴定和机制研究奠定了基础。2.猪源Mx1蛋白的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究通过设计一对特异性引物扩增出poMx1全长基因并与蛋白转导域(PTD)基因串联。将PTD-poMx1克隆至原核表达载体pCold-I。鉴定正确的阳性克隆转化大肠杆菌Rosetta2并在0.1mmol/L IPTG诱导下进行表达。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量为74.2KDa。融合蛋白经过纯化、变性、透析复性和浓缩后进行入胞试验,Western blot结果表明80μg/ml PTD-poMx1与Vero细胞孵育6h后能明显检测到融合蛋白成功转导进入细胞。Vero细胞感染100TCID50VSV后进行噬斑减少试验,160μg/mL、80μg/mL和20μg/mL PTD-poMx1蛋白处理组VSV滴度Log (PFU/mL)分别为8.05、8.10和8.31,而没有用融合蛋白处理的对照组VSV滴度Log(PFU/mL)是8.55。表明在PTD-poMx1蛋白的存在下,VSV在Vero上的增殖受到了抑制,抑制作用随着处理蛋白的浓度增加而增强,而160μg/mL组和80μg/mL组相比抑制作用增强幅度不大,所以选择80μg/mL作为融合蛋白抑制病毒复制试验的处理浓度。VSV接种Vero细胞检测其TCID50发现80μg/mL组VSV TCID50下降了101.1。SYBR Green I real-time PCR检测VSV在Vero细胞上增殖的mRNA水平,VSV感染24h、48和72h后,对照Vero细胞中增殖的病毒分别是融合蛋白处理组增殖病毒的43.1倍、9.4倍和4.1倍。一系列结果均表明转导进入Vero细胞的PTD-poMx1融合蛋白发挥了抗病毒效果。PK-15细胞感染猪瘟病毒石门株,用间接免疫荧光法测定病毒TCID50,发现用80μg/mL PTD-poMxl蛋白处理后病毒滴度从104.2/mL下降到了103.6/mL.200TCID50感染PK-15细胞24h、48h和72h后,对照组猪瘟病毒的mRNA水平分别是融合蛋白处理组的2.5倍、1.9倍和2.1倍。结果说明PTD-poMx1蛋白的存在对猪瘟病毒的复制产生了抑制作用。3.稳定表达猪源Mx1蛋白PK-15细胞系的建立及其抗猪瘟病毒的初步研究根据GenBank所收录的poMxl基因序列设计一对特异性引物,从pT-poMx1亚克隆出目的基因片段,双酶切纯化后克隆至真核表达载体pEGFP-C1,构建重组质粒pEGFP-poMx1,经PCR扩增、酶切和测序分析该重组质粒；脂质体转染猪肾细胞(PK-15)后,经G418抗性筛选,通过RT-PCR、Western blot和荧光观察,鉴定表达的融合蛋白；结果表明：建立了能稳定表达poMx1蛋白的PK-15细胞系(PK-15/EGFP-poMx1), RT-PCR能够检测到转录产生的EGFP-poMxl mRNA、Western blot鉴定到99KDa的融合蛋白,直接荧光观察到融合蛋白主要在胞浆中呈现颗粒性表达。将猪瘟病毒石门株接种建立的细胞系PK-15/EGFP-poMx1后,TCID50测定、间接免疫荧光和SYBR Green I real-time PCR检测结果表明：与对照组PK-15相比,细胞系感染猪瘟病毒24h、48h和72h后的收获的上清病毒液滴度都有所下降,随着时间的增加下降幅度有所减小；细胞系中病毒荧光斑明显减少,病毒mRNA水平明显降低。说明在PK-15细胞系中稳定表达的融合蛋白EGFP-poMx1能够抑制猪瘟病毒的复制,降低子代病毒含量。通过激光共聚焦显微镜的观察研究猪瘟病毒E2蛋白和EGFP-poMx1融合蛋白的亚细胞定位,发现两个蛋白共定位在细胞核周围。该研究结果为猪源Mx1蛋白抗猪瘟病毒的机制研究奠定了基础。
沈中华[3]2004年在《猪瘟RT-PCR诊断及抗体监测研究》文中认为猪瘟(Hog Cholera,HC;或Swine Fever,SF)是由猪瘟病毒(Hog Cholera Virus.HCV;或Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种高度接触传染性传染病。本病遍布于全世界,流行广泛、死亡率高,对养猪业危害极大,许多国家制定兽医法规,都将猪瘟列为法定传染病之一,即必须列表上报的疫病。设在法国巴黎的国际兽医局(OIE)制定的《国际动物卫生法典》中,猪瘟被列为A类16种法定传染病之一,要求各会员国有义务报告疫情,按规定检疫和遵守国际交换的有关规定。在我国的《家畜家禽防疫条例实施细则》中猪瘟也被列为一类传染病。近些年来,随着养猪业尤其是规模化养猪业的迅速发展,猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化,其流行形式已从频繁发生的大流行转变为小规模、周期性、波浪式的地区性和散发性流行,发病特点以非典型猪瘟为主。猪瘟表现的多样性给本病的诊断带来了较大困难,易导致误诊,实验室常用的病毒分离和免疫学诊断等技术措施,已不能满足新形势的需要。因此,开展研究,在我省建立一种更先进的更为有效的诊断技术,以及进行推广应用,对预防和控制猪瘟具有重要实践意义。本文参照已发表的猪瘟病毒E2基因序列,设计合成了一对扩增片段大小为443bp的特异性引物,用RT-PCR方法对猪瘟标准强毒株、猪瘟兔化弱毒株、9份疑似猪瘟料以及对照组的牛病毒性腹泻病毒(BVBV)、口蹄疫病毒(FMDV疫苗)进行检测诊断,结果这对引物对猪瘟标准强毒株、兔化弱毒株和其中4份疑似病料均特异性地扩增出了与预期大小相符的443bp的RT-PCR产物,而对照的其他猪病病原的扩增结果为阴性。猪瘟疑似病料经兔体交互免疫试验,结果RT-PCR阳性的4份疑似病料均被判为含有猪瘟病毒,其余病料试验结果为阴性。表明RT-PCR对猪瘟的诊断是一种特异敏感的方法,在我省首次建立了猪瘟RT-PCR的诊断方法。疫苗接种是我国目前防制猪瘟的主要手段,其实质是让猪体内产生一定量的猪瘟抗体,以抵抗猪瘟病毒的侵袭,从而达到防制猪瘟的目的。因而,猪瘟抗体的监测,对如何免疫使猪适时产生猪瘟抗体具有极为重要的作用。本文用正向间接血凝试验(IHA),对云南楚雄猪场健康母所产的105头仔猪,分为猪瘟乳前免疫和不作任何免疫两组,在不同日龄采血分离血清进行免疫抗体和母源抗体监测,以研究其抗体的消长规律,通过抗体监测掌握了猪瘟抗体的消长规律特点,为科学合理地制定猪瘟免疫程序、检查猪瘟免疫效果提供了可靠依据。
林旭埜[4]2009年在《猪瘟活疫苗全新工艺的研制与应用》文中研究指明猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起的猪的一种危害严重的烈性传染病。本研究培育了猪睾丸传代细胞(Swine Testis Cell,ST细胞)应用于猪瘟活疫苗,建立了猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产规程和质量标准,批量生产猪瘟活疫苗,并在我国八省30余个猪场推广应用,获得良好效果。为猪瘟疫病的防控奠定了坚实的基础。ST细胞培育：选用ST细胞系作为繁殖猪瘟兔化弱毒病毒液的细胞基质,将ST细胞传3代增殖至适量建立基础细胞库；将基础细胞传4代增殖至适量建立工作细胞库,对基础细胞库和工作细胞库细胞进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验,确认无任何污染。对ST细胞进行了细胞使用最高代次的研究,工作细胞库复苏的细胞传25代仍能生长良好,并保持细胞的纯净性和良好的病毒增殖能力。将基础细胞库的第3代细胞、最高限制代次细胞(工作细胞库复苏传至20代)和超过最高代次5代细胞(工作细胞库复苏传至25代细胞)进行细胞软琼脂集落试验、裸鼠肿瘤形成试验、染色体数检查等试验,未发现异常。没有致瘤、致癌、致畸性,符合弱毒活疫苗生产用细胞的各项特性,该细胞可用于猪瘟疫苗的生产。猪瘟种毒：对猪瘟兔化弱毒进行纯净性、安全性、免疫原性等多项检验,建立的生产用细胞毒种种子批经全面鉴定结果均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)中相关标准。疫苗研制：应用生物反应器进行了猪睾丸传代细胞的高密度培养和猪瘟病毒的高密度培养。对不同代次细胞产毒情况、不同接毒量、接毒后不同时间收获、病毒液于不同温度保存期等工艺进行研究和比较试验。结果显示,当脾毒种病毒含量≥105RID/ml时,接种含0..2-0.3%脾毒种的维持液,当细胞毒种病毒含量≥5×105RID/ml时,接种含3-5%的细胞毒种的维持液,于接种后5天作第1次收获换液,以后每隔4天收获换液1次最为合适,此时收获的病毒液病毒滴度最高且稳定；收获的病毒液在-15℃以下保存3个月,病毒液效价基本保持不变。建立了应用生物反应器培养猪瘟活疫苗的生产工艺；制定了猪瘟活疫苗(传代细胞源)的生产规程和质量标准。安全与效力检验：ST传代细胞源猪瘟活疫苗每头份的病毒含量比原代牛睾丸细胞苗的规程标准高了10倍,安全和效力检验试验结果证明：传代细胞源猪瘟活疫苗(7500RID/头份)30头份接种猪,3批实验室疫苗的安检猪均未出现任何不良反应,对猪安全。以1/7500头份接种家兔,所有效力指标合格；以1/5000头份接种猪,攻毒后均100%保护。疫苗对猪能产生良好免疫保护力。与同类产品的比较：参照《中华人民共和国兽药典》(2005年版)猪瘟活疫苗(细胞源)成品检验方法检验,将研制开发的的用ST传代细胞生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源)与同类产品用牛睾丸原代细胞生产的猪瘟活疫苗(细胞源)的各项指标的比较试验表明用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗1/5000头份免疫猪能100%产生免疫保护；1/7500头份接种家兔均能符合规程兔体反应热的要求,全部合格。比较疫苗的病毒含量、效力和安全检验结果,该疫苗的病毒滴度和免疫保护效力高于现有BT原代细胞活疫苗规程标准的10倍,用ST细胞生产的3批猪瘟活疫苗以30倍剂量进行安全检验,全部合格。通过对ST、BT细胞疫苗毒株E2基因所编码的gp55抗原蛋白的核甘酸、氨基酸序列比较及抗原结构和中和抗原决定簇上的差异分析,发现猪瘟兔化弱毒疫苗株在经ST和BT细胞培养后,其保护性抗原基因E2并没有明显的变化,所研究的猪瘟细胞疫苗毒在遗传上表现高度的稳定性。推广应用：在获得农业部猪瘟活疫苗(传代细胞源)生产许可后,严格按照农业部发布的猪瘟活疫苗(传代细胞源)制造及检验暂行规程、暂行质量标准的规定组织生产和检验,2008年共生产猪瘟活疫苗(传代细胞源)5批,517万头份。2009年生产了22批,经检验合格20批,2462万头份。至2009年7月31日为止,在规定的8省共销售使用了猪瘟活疫苗(传代细胞源)7批733万头份,参照各猪场免疫程序对仔猪、保育猪、育肥猪和种猪进行免疫接种,未有不良反应以及免疫猪发生猪瘟临床感染和亚临床感染的反馈。在规定的广东、湖南、河南、四川、江苏、山东、辽宁和福建等8省选择了30多个规范化猪场使用,按照猪瘟活疫苗(传代细胞源)规定的使用说明,结合各场的免疫程序进行免疫接种,并进行临床应用安全性观察、田间免疫效果等情况的跟踪调查工作,经过7批次389万头份疫苗使用观察,对经产母猪、种公猪、后备种猪、商品肉猪一次与多次免疫接种,未见任何不良反应,安全性好,免疫效果确切。
胡玲玲[5]2018年在《规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究》文中指出猪瘟(CSF)和猪伪狂犬病(PR)是感染猪的两种重要疫病,农业部于2008年将猪瘟列为一类动物疫病,伪狂犬病列为二类动物疫病,目前这两种疫病在我国一些规模化猪场普遍存在,直接或间接地影响着我国养猪业的持续健康发展。近年来,随着我国CSF和PR诊断技术和综合防控措施研究的不断突破与创新,以及CSF和PR的净化技术的成熟,规模化猪场CSF和PR的净化已被列入《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》。为进一步探索研究完善规模化猪场CSF和PR科学可行的净化方案,本研究对已建立的规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案在规模化猪场中的应用效果进行监测净化研究,并在以净化为目的条件下对规模化猪场CSF和PR展开了流行病学调查以及病原的分离鉴定工作。以期为后期规模化猪场CSF和PR的流行、变异、防控及净化提供一定的参考。1、规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病血清学调查研究为了更好的实施CSF和PR净化方案,试验对贵州省实施方案前的某规模化猪场采集的1 430份血液样品进行CSF和PR抗体ELISA检测,结果显示,在所检测的样品中,PRV gB抗体阳性率87.2%(1 247/1 430);其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的PRV gB抗体阳性率均在85%以上。PRV gE抗体阳性率4.48%(46/1 430);保育猪群中检出PRV gE抗体阳性率最高,为5.26%(12/228),育肥猪群中检测阳性率最低,为4.14%(11/266)。猪瘟抗体阳性率为84.27%(1205/1 430);其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的猪瘟抗体蛋白阳性率均在80%以上。该研究结果为后期规模化CSF和PR的净化提供本底调查,并为贵州规模化CSF和PR的流行状况提供参考依据。2、规模化猪场CSFV和PRV病原学调查研究为了掌握规模化猪场CSFV和PRV的感染状况及相应病原特征,试验对贵州省实施方案前的某规模化猪场采集的1 430份扁桃体及血液样品进行CSF和PR的mPCR和单一PCR/RT-PCR检测,并对PCR/RT-PCR检测阳性的部分样本进行CSFV和PRV的分离鉴定。结果显示,猪伪狂犬病病原核酸阳性率为1.96%(28/1 430);实验成功分离得到1株猪伪狂犬病病毒,命名为Guizhou-T1株。该毒株接种Vero细胞盲传至第3代时开始产生CPE,盲传至第5代出现稳定的CPE,其TCID_(50)为10~(-10.11)/100μL;电镜下可见呈椭圆形、有囊膜、直径为120~180 nm病毒粒子,核内见呈晶格状排列的病毒包涵体;病毒悬液过滤后接种引起家兔奇痒、麻痹死亡。猪瘟病原核酸阳性率2.59%(37/1 430),其中保育猪群野毒阳性率最高,为3.07%(7/228);分离鉴定了一株猪瘟病毒,命名GZA株。该毒株接种PK-15细胞后连传7代RT-PCR均能扩增出CSFV E2基因阳性条带。间接免疫荧光试验表明CSFV确在PK-15细胞中得以增殖;病毒粒子在电镜下呈椭圆形或圆形,直径30~80 nm。研究结果初步摸清了规模化猪场PRV和CSFV病原学特点,为后期规模化猪场开展CSF和PR的净化提供了本底调查。3、规模化猪场CSFV和PRV分子流行病学调查研究为了解贵州省某规模化猪场CSFV和PRV的分子流行病学状况,本试验对该规模化猪场中的已检测CSF和PR部分阳性样品进行CSFV E2及PRV gE全基因进行的克隆、测序及序列分析。结果显示,4株PRV贵州流行株gE基因核苷酸同源性为99.6%~99.9%,氨基酸同源性为99.1%~99.8%,Guizhou-T1~T4株在gE48和gE496位有天冬氨酸(Asp D)的插入;遗传进化树显示:gE基因序列与2011年后所报道的变异毒株序列同属一个分支。并且Guizhou-T1株与GZ-Z1株和Guizhou-DY株同源性分别为97.5%和99.3%;与Guizhou DY株之间有8个氨基酸突变位点,与GZ-Z1株之间有26个氨基酸突变位点。实验获得的CSFV GZA株和GZB株E2基因与参考毒株的CSFV E2基因的核苷酸同源性为82.8%~83.4%,氨基酸同源性为88.7%~90.6%,经遗传进化树分析得出CSFV贵州分离株E2基因与参考毒株之间差异较大。该研究结果为贵州规模化猪场CSF和PR的遗传变异状况提供参考依据。4、规模化猪场猪瘟和伪狂犬病净化效果研究为研究规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案的应用效果,本试验分4次采集该方案实施猪场的1 776份扁桃体和1 776血液样品份,采用已建立的CSFV RT-PCR检测技术((GB/T 16551-2008))、PRV gE/gB-ELISA检测方法(GB/T18641-2002)和本实验室已建立的鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR方法,对贵州省某规模化种猪场CSF和PR开展了净化研究。对贵州省某规模化种猪场CSF和PR分4个阶段开展了净化研究。结果显示,实施净化方案后所检测PRV gB抗体阳性率从83.98%(367/437)上升到98.17%(429/437);PRV gE抗体阳性率从5.72%(25/437)下降到0.23%(1/437);猪伪狂犬病病原阳性率从2.75%(12/437)下降到0;猪瘟抗体阳性率从85.81%(375/437)上升到98.63%(431/437);猪瘟病原阳性率从2.06%(9/437)下降到0,表明采用该净化方案对猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化达到了预期的效果。该研究为规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化思路提供一定的参考依据。
杨林[6]2005年在《猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用》文中研究指明猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪病毒性传染病,猪瘟兔化弱毒疫苗有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但自上世纪80年代以来,我国开始出现了温和、非典型性猪瘟。究其原因,可能与CSFV出现了新的变异株等因素有关。尤其是亚临床感染猪,依靠常规诊断方法很难确诊并剔除此类病猪,给CSF的防制工作带来新的困难。因此,有必要建立一种新的迅速、准确诊断CSF的实验室诊断系统,为在我国彻底消灭CSF奠定基础。 基因芯片(Gene Chip)是生物技术与电子芯片融合的结晶,是由固定于固相载体(如硅片、玻璃、塑料等)表面的核苷酸阵列构成的一种新型微型器件。由于其快速、微量、准确的应用优点,正在成为新一代的自动化医学检验工具。通过设计针对基因的探针,与被检测基因的碱基序列互补匹配,可快速、准确地检测到基因,用于疫病的诊断。 本研究采用以基因测序为基础的系统进化树分析方法,对黑龙江省部分地区猪瘟病毒流行株进行分离鉴定和E2基因序列分析,并与传统的石门强毒和猪瘟兔化弱毒在抗原基因上存在的变异进行比较。研究结果表明:病料为CSFV感染,CSF流行毒株和疫苗株在核苷酸和氨基酸序列上存在一定的差异,E2基因部分序列接近Alfort,与Brescia同源性最低。该试验从核酸和蛋白质水平上研究了黑龙江省部分地区猪瘟病毒流行株与其它标准毒株之间的同源性及其变异情况,揭示了在该省猪瘟流行的本质,为实施科学有效的猪瘟防制措施提供依据。 本研究通过RT-PCR扩增CSAV相当保守的NS基因作靶DNA制作芯片,将被检样品在PCR过程中用Cy-5标记,得到DNA产物与芯片杂交,达到检测CSFV的目的,建立CSF基因芯片诊断方法;同时通过研究不同靶探针浓度对检测结果的影响,确立最佳反应条件靶探针浓度为1 μg/μl;分析芯片诊断技术的特异性和敏感性等技术指标:与RT-PCR方法和间接荧光抗体试验方法进行比较,并开展了初步应用。本研究建立的CSFV基因芯片诊断技术,可以成功地检测到CSFV保守区基因,荧光信号清晰,敏感性利特异性高,实际应用效果奸,是一种检出率高的诊断方法。 总之,本研究将基因芯片技术应用于动物疫病的诊断,成功建立了CSFV基因芯片诊断技术平台,解决了CSF诊断中的难题,具有重大的理论意义和应用价值。为今后利用基因芯片开展动物疫病诊断和研究提供理论依据,也为控制和消灭CSF奠定基础。但要实现基因芯片在动物疫病方面的广泛应用,还要做更深入的研究。
欧莹[7]2014年在《2012-2013年广西猪瘟流行病学调查》文中指出猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种接触性传染病,严重危害猪群的健康和损害养猪业的经济效益。近年来,猪瘟仍然是阻碍养猪业发展的主要疫病之一,而广西又是猪瘟的老疫区。本研究从2012年至2013年采用猪瘟IHA方法对广西各地市血清进行猪瘟抗体检测,采用PT-PCR方法对广西各地市猪组织进行猪瘟病原检测,并对9株猪瘟毒株进行E2基因克隆测序分析,以期全面了解2012-2013年广西猪瘟的流行情况,为广西控制和消灭猪瘟提供科学依据。在血清抗体检测方面,2012年检测猪血清1443份,猪瘟抗体合格率为57.7%；2013年检测猪血清2353份,猪瘟抗体合格率为57.8%。两年总体合格率为57.7%,合格率偏低。在猪组织病原检测方面,2012年检测猪组织样品1212份,病原阳性率为5.8%；2013年检测猪组织样品1161份,病原阳性率为1.7%,总体阳性率为3.83%。2013年病原阳性率较2012年有所下降,两年间猪瘟感染发病逐渐减少。广西猪瘟一年四季均有发生,春秋两季病原阳性率比夏冬两季高,春秋两季为广西猪瘟易感季节。在猪瘟病原阳性中,不同阶段猪群所占比例从大到小依次为保育猪、哺乳仔猪、育肥猪和母猪,猪瘟病原感染以保育猪为主,哺乳仔猪其次,感染趋向幼龄。猪瘟毒株E2基因克隆测序分析方面,测序的广西猪瘟毒株与Shimen、 HCLV株的E2基因的核苷酸同源性分别为81.3%-82.4%和81.9%-83.3%,推导氨基酸的同源性分别为88.0%～89.6%和89.3%～90.6%。本次测序的广西猪瘟毒株在E2蛋白关键单抗识别氨基酸位点713位(G→E)、724位(H-→Y)、725位(D→G)、729位(N-----D)、734位(K→R)、738位(V→T)、761位(G→R)等7个位点均有突变。根据猪瘟E2基因分群法,本实验测序9猪猪瘟毒株均属于S2.1亚群,其中GXYL1、GXYL2、GXYL3、 GXYL、GXYL5属于S2.1b子群；GXHZ1、GXHZ2、GXBH1和GXBH2属于S2.1c子群。
杨文超[8]2007年在《猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗体制备》文中提出E2蛋白是猪瘟病毒的跨膜结构糖蛋白,是最易发生变异的一种蛋白,能诱导感染动物产生保护性免疫和猪瘟病毒中和抗体,是一种免疫优势蛋白,其中A1、B、C区对介导中和抗体的产生很重要,用A1和B或A1和C的单抗可见协同中和反应。表达CSFV Brescia株E2蛋白重组伪狂犬病毒以及用亲和层析法从昆虫细胞中的基因工程E2蛋白均能保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染,可以确定E2蛋白诱导的免疫反应足以保护免疫猪抵抗猪瘟病毒的感染。为制备猪瘟病毒E2蛋白的抗体,研究E2基因表达产物在免疫检测中的应用及E2蛋白的中和性抗原表位,我们进行了猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达。首先根据GenBank中登录的猪瘟病毒基因组序列,设计一对引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术从本实验室保存的重组质粒(PGEX-4T-1-PE2)中扩增出大小约为622bp的基因;经单酶切鉴定,与已知的猪瘟病毒E2基因含有相同的DraⅠ酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,并转化宿主菌DH5α,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆PMD18-T-TE2,结果表明本实验成功的克隆到猪瘟病毒TE2基因。其次,根据所克隆的猪瘟病毒TE2基因序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆酶切位点设计另一对引物,应用PCR技术从重组质粒PMD18-T-TE2中扩增出长约622bp的猪瘟病毒TE2基因,编码包括CSFV E2囊膜糖蛋白主要抗原区域A、B、C和D。再将扩增的猪瘟病毒TE2基因克隆到原核表达载体PGEX-4T-1中,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建原核表达重组质粒PGEX-4T-1-TE2。然后将该重组质粒转化大肠杆菌(EcoliRosetta(DE3)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与TE2的融合蛋白GST-TE2,融合蛋白的分子量约为47.0KD,与预期结果相符。通过优化原核表达条件,确定了原核表达的最佳诱导时间和诱导剂浓度。对表达蛋白的可溶性进行鉴定,结果表明表达产物GST-TE2融合蛋白以包涵体形式存在。我们用优化的原核表达条件对含有PGEX-4T-1-TE2质粒的Rosetta(DE3)BL21菌进行大量诱导表达,反复冻融和超声方法裂解诱导菌,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,Folin-酚法测定提取的融合蛋白GST-TE2浓度约为1.2mg/ml。应用提取的GST-TE2融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备鼠抗猪瘟病毒TE2多克隆抗体。琼脂扩散实验表明制备的多抗具有良好的反应性,ELISA实验表明鼠多抗的有效稀释度可达1:25600,免疫印记(Western-blotting,WB)实验证实鼠抗猪瘟病毒GST-TE2多抗含有抗GST抗体和抗融合蛋白GST-TE2抗体。综上所述,本研究成功地克隆了猪瘟病毒TE2基因,成功构建了原核表达质粒PGEX-4T-1-TE2并进行了原核表达,提取了融合蛋白GST-TE2,并且制备了效价高、反应性强的鼠源抗猪瘟病毒GST-TE2多克隆抗体,这些为进一步研究猪瘟病毒E2蛋白免疫学功能及其应用提供了试验材料。
李素[9]2007年在《猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备》文中研究表明CSFV是黄病毒科瘟病毒属成员,基因组编码4个结构蛋白(C、E0、E1、E2)以及至少7个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。其中E2蛋白为重要的免疫保护性蛋白,能刺激机体产生中和抗体。许多诊断方法以及标记疫苗的研究大都是围绕E2开展的。E2蛋白的828-842抗原表位(氨基酸序列为QTAVSPTTLRTEVVK)是中和抗原表位,该表位在CSFV高度保守,而同属的BVDV和BDV却不存在这一表位。本实验克隆了CSFV石门株E2基因和E2的抗原表位的4个重复(4P),分别插入pGEX-6P-1、pMAL-P2X表达载体中,构建了4个原核重组表达质粒,诱导后4个重组表达质粒均得到表达。将表达蛋白的上清MBP-4P、GST-4P、MBP-E2,以及复性和变性后的包涵体GST-E2应用亲和层析的方法进行了纯化,纯化后的蛋白经ELISA和Western-blotting检测具有反应性,能与猪瘟病毒阳性血清发生反应。MBP-4P、GST-4P不与兔抗BVDV E2血清发生反应,因此,可以作为一个潜在的鉴别CSFV的抗原。应用表达的融合蛋白MBP-E2、MBP-4P以及实验室制备的昆虫细胞sf9杆状病毒表达系统表达的真核E2蛋白联合免疫家兔,制备了较高滴度的多克隆血清。ELISA、Western-blotting,IFA试验证明所制备的多克隆血清具有良好的反应性和特异性。本研究为建立猪瘟病毒组合抗原的抗体检测方法和猪瘟鉴别诊断以及大量表达CSFV E2蛋白研究其结构和功能打下基础。
韩雪清[10]2002年在《猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究》文中研究表明针对频繁出现的弱毒疫苗免疫失败现象和免疫猪群持续带毒等猪瘟(CSF)防制中的重大问题，本项研究从病毒的分子水平入手，试图从病毒分子变异水平以及当前流行毒的分子差异程度澄清原因，并针对CSF的持续感染研制出高效安全的基因工程标记疫苗和诊断试剂，为彻底消灭CSF提供科学依据和技术支撑。主要研究内容包括： 1．猪瘟病毒主要免疫原E2基因的序列分析：利用反转录PCR(RT-PCR)及套式PCR(nPCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株(C株)兔脾组织毒保护性抗原E2(gp55)基因，成功地将其克隆并测定核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列比较的结果是：C-株兔脾毒与C-株细胞(SK6)毒、C-株疫苗(犊牛睾丸细胞，CSFV-C)毒CSFV-SM株(石门)毒、Bresia株(荷兰)毒、Alfort株(德国)毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87％、98.34％、94.58％、91.00％、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95％、97.37％、94.22％、91.60％、89.23％。对C-株兔脾毒与C-株细胞毒、经典强毒E2上的A、B、C叁个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为：C-株兔脾毒与C-株疫苗细胞毒的差异很小甚至没有差异。 2．猪瘟病毒分子流行病学分析：利用RT-PCR及nPCR扩增并测定了我国近期(1997～2001年)12个省的51株流行野毒株的E2基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：C-株兔组织毒、C—株细胞毒和中国50～60年代流行的石门强毒株同属于组群1(Group 1)；近期猪瘟流行毒株均属于组群2(Group 2)的两个不同的亚组群(Subgroup2.1和2.2)，表明我国目前流行毒株至少有2个亚组群。流行毒株与疫苗毒株有较大的差异(E2全基因核苷酸序列同源性82.2％～84.3％)，表明猪瘟流行毒株已远离疫苗毒株的方向演变，明确了我国CSF流行趋势及我国CSFV在世界SCFV大系谱中的位置，并为基因工程疫苗的研究提供了基因储备。 3．猪瘟病毒E2基因的真核表达：分别将CSFV两个代表株的E2基因克隆入毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，酶切线型化后电穿孔导入P.Pastotis进行整合，经G418筛选得到25个高拷贝转化子，经DNA斑点试验和DNA测序证明外源基因E2稳定地整合到P.Pastoris染色体中。经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和Western blot结果证明了P.Pastoris培养上清液中含有正确糖基化的E2蛋白，表达量约250mg/L。重组P.Pastoris经连续培养8代仍可分泌特异性蛋白。免疫活性研究证明P.Pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生1：128～1：256猪瘟病毒的抗体。有望用于基因工程亚单位疫苗的研制。 4．猪瘟病毒E2基因的密码子改造优化：低利用率密码子的数量和分布是影响外源基因有效表达的参数之一，优化密码子序列能够提高外源基因的表达。利用PCR基础上的定点突变方法对猪瘟病毒E2基因的24个密码子进行优化。优化后的E2基因转化P.Pastoris菌，甲醇诱导表达。诱导培养上清的SDS-PAGE和Western blot分析显示，E2蛋白在P.Pastoris中得到了高效的表达，表达量约1.08g／L。这表明对E2基因上低利用密码子的改造是成功的， 猪瘟病毒EZ基因遗传变异及体外表达研究为进一步大规模生产打下了基础。5．毕赤酵母高效表达的培养条件探索：用PPastoris系统表达外源基因，对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。除外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用外，表达条件对表达量高低的影响也极其显着。分别在不同时间、不同诱导型、不同pH、不同诱导剂量方面进行了较系统的对比：经不同时间表达，表明72小时蛋白可达峰值；采用抑制／诱导方式会提高表达量；表达EZ蛋白pH最佳值在7．5—8刀；最佳甲醇诱导量是2％～3％；得到了一套较完善的在PPastoris中表达CSFV EZ基因的条件，以供在规模化发酵罐中表达EZ基因蛋白生产亚单位疫茵。6．猪瘟病毒EZ基因的原核表达：PCR扩增出当前猪瘟流行野毒株，中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒EZ基因的主要抗原区，将其克隆到原核大肠杆菌表达载体PPROEX－HTb中诱导表达，经 SDS－PAGE检测表明，重组质粒能表达EZ基因主要区蛋白，Western blot检测表明，诱导表达蛋白与猪瘟阳性血清发生特异性反应，表达量为35％和38％，可用于基因工程诊断抗原。7．猪瘟病毒EZ基因的乳腺特异表达载体构建：将在乳腺细胞中特异分泌的信号肽序列连接到EZ基因，PCR得到了目的片段，再将pGFPCI载体上的Kana基因切下与在乳腺细胞中特异表达的P22载体连接，使其带有筛选标记，然后将带有信号肽的EZ插入到P22中，试图构建山羊乳腺上皮细胞的特异性表达载体。探索了构建的含目的基因的乳腺特异性表达载体调控成分的有效性，也为在体外培养的乳腺细胞中定位重组目的基因一体细胞克隆一动物乳腺生物反应器工作的开展作准备工作。
参考文献：
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[2]. 猪源Mx1蛋白的表达及其抗猪瘟病毒感染的研究[D]. 何丹妮. 南京农业大学. 2012
[3]. 猪瘟RT-PCR诊断及抗体监测研究[D]. 沈中华. 甘肃农业大学. 2004
[4]. 猪瘟活疫苗全新工艺的研制与应用[D]. 林旭埜. 南京农业大学. 2009
[5]. 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究[D]. 胡玲玲. 贵州大学. 2018
[6]. 猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用[D]. 杨林. 中国农业大学. 2005
[7]. 2012-2013年广西猪瘟流行病学调查[D]. 欧莹. 广西大学. 2014
[8]. 猪瘟病毒E2基因部分片段的克隆和原核表达及其抗体制备[D]. 杨文超. 安徽农业大学. 2007
[9]. 猪瘟病毒E2蛋白及其重复抗原表位的原核表达和特异抗血清制备[D]. 李素. 吉林大学. 2007
[10]. 猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D]. 韩雪清. 西北农林科技大学. 2002
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