[摘要]目的: 探讨促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)对心衰大鼠心功能的影响及其可能的作用机制。方法：60只SD大鼠随机分4组，分别为①对照组（A组）8只；②心衰组（B组）20只；③ EPO组（C组）14只；④LY294002组（D组）18只。超声心动图检测各组大鼠心功能，然后处死大鼠并留取心脏标本，Tunel法测心肌细胞凋亡，硫代巴比妥酸（TBA）法测定大鼠心肌组织中丙二醛(MDA)水平、邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、Western blot测大鼠心肌组织中Akt、pAkt的水平。结果：与对照组相比，心衰组大鼠心脏功能下降，心肌细胞凋亡指数增加，MDA升高，SOD降低，pAkt下调（p<0.05）。与心衰组相比，EPO组大鼠心脏功能明显改善，心肌细胞凋亡指数减少，MDA下降，SOD增加，pAkt上调（p<0.05）。与EPO组相比，LY294002组大鼠心脏功能明显下降，心肌细胞凋亡指数增加，MDA升高，SOD降低，pAkt下调（p<0.05）。结论：PI3K/Akt信号通路是EPO发挥心肌保护作用的通路之一，其作用机制可能是EPO激活PI3K/Akt途径，活化的Akt抑制心肌细胞凋亡对阿霉素诱导的的心衰大鼠起心脏保护作用。
[关键词] 红细胞生成素；心力衰竭；PI3K/Akt
慢性心力衰竭是各种心血管疾病终末期的临床表现，而终末期心力衰竭患者住院率及死亡率极高，给社会经济带来极大的负担，因此在传统治疗慢性心衰的基础上寻找新型的抗心衰药物是非常有意义的。本文主要探讨EPO对阿霉素所致慢性心力衰竭大鼠的保护及其作用机制。
1 材料与方法：
1.1 动物 健康雄性纯种SD大鼠，体重(250~270 g)60只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。
1.2 试剂 TRIzolRNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒、Real-MasterMix(天根公司)，LY294002、二甲基亚砜（promega公司），阿霉素、促红细胞生成素（sigama公司），751-GM紫外分光光度计（上海惠普公司）；水平电泳槽、垂直板蛋白电泳装置（Bio-Rad公司）；半定量PCR仪（Beckman公司）；显微镜（Olympus公司）台式低温高速离心机（Heraeus公司）；
2 方法
2.1 动物模型的建立及分组 雄性SD大鼠60只，体重250-270g，随机分4组，分别为①对照组（A组）8只；②心衰组（B组）20只；③ EPO组（C组）14只；④LY294002组（D组）18只。第一步：B、C、D组均予腹腔注射阿霉素制作大鼠心衰模型（2.5mg?kg-1?d-1，2次/周，共5周），A组予同体积的生理盐水2次/周，共5周；第二步：造模完成后第二天，D组尾静脉注射LY294002（0.3mg?kg-1?d-1），A、B、C组均予尾静脉注射同体积的生理盐水；30分钟后，C、D组腹腔注射EPO（4000U?kg-1?d-1），A、B组均予同体积的生理盐水；整个过程重复4天。
2.2超声心动图检查 实验最后一天进行，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定于木板上，胸部脱毛，接心电图，取大鼠胸骨旁左室长轴切面测量左室舒张末径(LVIDd)、左室收缩末径(LVIDs)、射血分数（EF%）、缩短分数(FS%)。
2.3 心肌细胞凋亡检测 实验步骤按照细胞凋亡原位检测试剂盒说明书进行，以不加TdT酶者为阴性对照，Dnase1(10mg/L)消化的左心室心肌切片为阳性对照。每只大鼠观察4张切片，每张切片在40倍视野下，随机计数5个不同视野的凋亡细胞及细胞总数，计算凋亡细胞数占总细胞的百分率，取其平均值为凋亡指数(AI)。
2.4 心肌组织SOD、MDA的测定 称取心肌1.0g，按1：10加入冰冷的生理盐水制成10%匀浆，2 500 r/min，离心10min，取上清待测。采用邻苯三酚法测定SOD的活性，硫代芭比妥酸法测定MDA的含量，具体步骤按试剂盒说明书方法进行。
2.5 Western Blot检测心肌组织中pAkt、Akt的水平 称取100mg大鼠心肌组织剪碎，加入1ml的裂解液匀浆(所有步骤均在冰上操作)。具体方法按Western Blot试剂盒说明书进行。用ECL发光剂，暗室曝光后凝胶成像系统进行图象分析处理。
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3 统计学方法SPSS14.0统计软件对所得结果进行处理，计量资料用均数±标准差( ) 表示，组间比较采用方差分析和q检验，P<0.05有统计意义。
实验结果
1 实验末存活大鼠36只，其中A组8只，B组和C组剩9只，D组余10只。24只大鼠死于造模期间。
2 心脏超声测定结果 与A组相比，B组大鼠经阿霉素处理后EF和FS降低（p<0.05）；与B组相比，C组的EPO处理能增加大叔的EF、FS值（p<0.05）；和C组相比，D组大鼠的EF、FS值增加（p<0.05）
3 Tunel法测定结果 光镜下A组偶见凋亡细胞，B、C、D组均可见明显凋亡细胞，B组AI高于A组（p<0.05），C组AI低于B组（p<0.05），D组AI高于C组（p<0.05）。
4 氧化应激的测定结果 与A组相比，B组的SOD活力降低、MDA含量增加（p<0.05）；与B组相比，C组的SOD活力增加、MDA含量减少（p<0.05）；与C组相比：D组SOD的活力降低、MDA含量增加（p<0.05）。
5 Wstern blot检测结果 与B组相比，C组的EPO处理明显增加大鼠心肌组织中pAkt的水平（p<0.05），而D组的LY294002处理则能削弱EPO的上述作用（p<0.05）；A、B两组pAkt水平无明显差异，所有大鼠心肌组织中Akt的水平无显著差异。
3.讨论
随着慢性心力衰竭的患者逐渐增多，对慢性心力衰竭的研究也变得更为重要，本研究采用分次小剂量（2.5mg?Kg-1，每周2次，共5周）腹腔注射阿霉素制作大鼠模型[1]，结果心脏彩超示与正常组大鼠相比，心衰组大鼠EF、FS值明显降低（P < 0.05），说明模型建立成功。
从实验结果看，注射了阿霉素的大鼠心肌细胞中MDA的含量较对照组增多，SOD活性下降，心肌细胞凋亡率增加。说明阿霉素可导致大鼠心肌细胞发生氧化应激进而引起心肌细胞凋亡[2]，而心肌细胞凋亡造成的心肌细胞数量的减少可能是心力衰竭发生发展的原因之一[3]，因此降低心肌细胞凋亡对保护心脏功能意义重大。
红细胞生成素(EPO)是由肾脏分泌的一种活性糖蛋白，能刺激红细胞的增殖与分化。但近年来大量研究表明使用EPO治疗合并贫血的慢性心力衰竭(CHF)患者，可使该类患者的心功能及临床症状得到显著改善 [4]，本研究表明EPO能够明显减轻阿霉素诱导的心衰大鼠氧化应激程度，减少心肌细胞凋亡，保护大鼠的心脏功能。PI3K/Akt是近年发现的体内重要的信号转导通路之一。活化的Akt 可磷酸化多种凋亡分子而抑制细胞凋亡[5]。结合本研究结果表明，阿霉素诱导的大鼠出现心力衰竭，磷酸化Akt 蛋白表达受抑制，而EPO可上调磷酸化Akt 的表达、抑制心肌细胞凋亡，保护心脏功能。Akt 特异性阻断剂LY294002 则可在一定程度上拮抗EPO处理所产生的心肌保护作用，由此推测Akt 信号通路参与了EPO心肌保护作用。这与Zhao Z Q[6]等人的研究结果相似。
综上所述EPO通过激活PI3K/Akt途径，抑制氧化应激从而保护受损的心肌细胞，改善心衰大鼠的心脏功能。这其中是否还有其他信号通路的参与，尚需进一步的考证。相信随着对EPO作用及其机制的深入研究，EPO及其衍生物必将成为心脏保护治疗的一种新方法。
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论文作者:邓琴琴1, 裴兆辉1 Δ
论文发表刊物:《世界复合医学》2017年第5期
论文发表时间:2017/9/5
标签：心肌论文; 大鼠论文; 细胞论文; 心衰论文; 凋亡论文; 心力衰竭论文; 阿霉素论文; 《世界复合医学》2017年第5期论文;