关键词:CRISPR/Cas;外源遗传物质;获得性免疫;
1.CRISPR-Cas概述
CRISPR"一组规则间隔的短回文重复(“（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）”)。CRISPR-CAS系统靶向DNA或RNA,可以作为防止病毒和其他遗传因素移动的一种方式[1,2]。CRISPR位点首先在大肠杆菌中观察到[3]根据CRISPRdb的最新更新,其存在于约84%的古细菌和45%的细菌中[4]。
CRISPR有独特序列的间隔子分隔的短重复序列的阵列,前端是富含AT的前导序列,通常有几百个碱基对[5]。发挥着解旋酶和核酸酶作用的一些Cas蛋白,有助于CRISPR系统发挥其重要的功能[6]。间隔区被用作识别元件来寻找匹配的病毒基因组并将其摧毁[7,8],通常是由外源核酸获得的宿主基因中的小的可变序列。
2.CRISPR作用机制
这种适应性免疫系统存在于细菌和古细菌中,这取决于CRISPR(簇规则间隔短回文重复序列)和CRISPR相关基因(CAS)基因的不同盒序列[9]。CRISPR系统分为三种主要类型(i-III)和至少十一种不同的亚型(IA至IF)。II-A到II-C和III-A到III-B)[10]。在I类系统中,前cRNA由CaS5或CaS6处理。除了级联和crRNA外,DNA目标干扰也需要CaS3。III类系统也使用Cas6处理crRNA,但是另外的未知附加因子执行3’末端修整。
尽管CRISPR系统存在多样性,但一切CRISPR-Cas免疫系统都是经过三个基本的阶段完成发挥功能:捕获外源DNA,crRNA合成和靶向干扰[11]。
2.1第一阶段捕获外源DNA
噬菌体病毒初次侵入宿主细菌时,将其双链DNA注入细胞内。此时CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为其原间隔序列(protospacer),整合到基因组的CRISPR序列之中。然而,原始区间序列的选择不是随机的。原始间隔序列的碱基序列非常保守，它被称为protospacer相邻基序(PAM)。当外源病毒入侵时时,相应的CaS1和CaS2编码的蛋白质对外源DNA进行探测并鉴定其中的PAM区域,然后选择候选保质子(通常是接近PAM的DNA序列)。然后,Cas1/2蛋白复合体剪切外源DNA中的protospacer,借助于其他酶的协助将protospacer插入临近CRISPR序列前导区的下游。接下来,DNA借助其特有的修复功能,修复双链缺口。如此,细菌基因组的CRISPR序列之中就多了一段外源间隔序列。
2.2.第二阶段:crRNA合成
CRISPR RNA起始于转录,经过初级转录物演变成短CRISPR-衍生的RNA(crRNA)的文库,其中含有与遇到的外源DNA互补的序列。在I型和III型系统中,CRISPR转录物通过CRISPR特异性内切核糖核酸酶发挥作用。在Ⅲ系统中,Cas6与CRISPR RNA在时间上相结合,而CRRNA的3末端进一步被未知核酸酶剪除。II系统中的CRISPRRNA通过TracrRNA工作。其含有与重复序列互补的序列[9,15]。这些双链区域在存在Cas9的情况下由RNA酶III处理。来自该系统的两种RNA已融合成单引导RNA(sgRNA),此时crRNA,Cas9以及tracrRNA组成的复合物发挥作用。
2.3第三阶段:靶向干扰
CRISPR CAS系统中的目标干扰原理是,与CAS蛋白结合的CRRNA对应的原型间隔物被特定的Cas nuclease降解。[12,13]。然而,不同的CRISPR系统的降解机制是不同的。II系统只需要CaS9蛋白干扰。I和III系统之间的区别在于它不仅需要crRNA,而且还需要与CAS9和CRRNA结合的TracrRNA来进行目标识别和降解[14 ]。
而III型系统的具有内源性核酸酶活性的多亚基复合体,则通过转录方式降解互补的RNA、靶向DNA,但是III型系统不借助PAM而是通过碱基互补配对,导向靶标位点的识别,阻止靶向裂解。
3.CRISPR的应用
CRISPRs在其宿主防御功能已经被用于应用目的。然而,最有名的应用来自II型系统发展成为真核细胞的强大遗传工具。Cas9已被开发为可用于特异性靶向抗生素抗性和/或高毒力菌株的抗微生物剂。基因治疗应用也已经通过修复来自人类囊性纤维化病人的培养细胞中的cftr基因来证明通过改变小鼠生殖系细胞中的DNA来治疗显性白内障病症和杜氏肌营养不良[17]。
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当然CRISPR在应用中依旧存在着诸多问题,但不可否认的是,随着科学家的不懈努力,这些问题终将被解决,最终可以将发挥其最大的使用价值,为人类的疑难杂症的治愈带来新的曙光。
参考文献:
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论文作者:周银唤
论文发表刊物:《科技新时代》2018年3期
论文发表时间:2018/6/6
标签：序列论文; 系统论文; 靶向论文; 间隔论文; 细菌论文; 转录论文; 核酸论文; 《科技新时代》2018年3期论文;