李桂新[1]2004年在《NMDA受体主亚基NR1抗原表位分析》文中进行了进一步梳理N-甲基-D-门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate Receptor,NMDAR,NR)是离子型兴奋性氨基酸受体的一种类型,该受体具有生理学和病理学双重作用,不仅与兴奋性突触传递、突触可塑性、学习和记忆等许多中枢活动密切相关,而且NMDA受体过度激活所介导的神经兴奋毒性与许多常见的神经、精神疾患,如脑出血、脑肿瘤及脑外伤等引起的癫痫、抑郁、痴呆等有密切关系。 鉴于NMDA受体在生理和病理状态下的双重作用,通过选择性干预NMDA受体活动,可为相关致死、致残性疾患提供有效的治疗手段。已有的NMDA受体拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药物,能弥散通过血脑屏障(空间窗过大),作用选择性低,病变脑区及非病变脑区都会受到影响,而且由于神经元可逆性损伤的“时间窗”极短,人们难以适时使用有效的神经保护药物,这些均导致已有的药物难以进入临床。因此,人们开始探讨新的抑制NMDA受体功能的方法,其中,保护疫苗的应用有望成为中枢神经系统兴奋毒性脑损害免疫防治的新策略。本实验利用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化出针对NMDA受体主亚基NR1PreM1片段的R1JHL单克隆抗体,利用噬菌体展示技术分析NMDA受体表位,为表位疫苗免疫干预防治兴奋毒性脑损害策略的实
吴兰香[2]2004年在《人NR1a膜蛋白自身免疫优势性表位确定及其抗体功能检验》文中研究说明脑卒中、癫痫、脑肿瘤、神经退行性疾病等急慢性神经损伤都被证明与N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)介导的神经兴奋毒性有关。通过选择性干预NMDA受体过度激活所介导的神经兴奋毒性,为上述若干致死、致残性疾患提供有效的防治手段是近20多年来基础与临床神经科学始终追求的一个重要目标。然而,现有的NMDA受体拮抗剂或阻断剂因严重的毒副作用和有限的临床疗效始终未能在临床治疗中取得成功。兴奋毒性脑损害免疫防治策略在该领域是一项全新的探索:以NMDA受体为免疫原,对上述脑疾患高危人群予以自身免疫干预,打破自身免疫耐受,建立抗NMDA受体的特异性体液免疫反应,当诱导产生的自身抗体与NMDA受体结合后会干预其过度兴奋,从而达到防治目的。由于过长的蛋白质抗原作为免疫原会对机体产生潜在的细胞毒性危害,因此构建抗原表位亚单位疫苗是最理想的选择,而表位的选择是疫苗设计的关键。为解决此问题,本课题对人NMDA受体主亚基NR1a膜蛋白的两个胞外区片段——胞外氨基端和M3-M4环进行了分析,认为以M3-M4环作为免疫干预的靶点可能更为安全有效,并从中筛选出了一个自身免疫优势性表位,共聚焦显微镜下观察到针对这个表位的单克隆抗体具有抗兴奋毒性神经保护效应。主要实验内容如下:一.人NR1a膜蛋白自身免疫优势性表位的生物信息学分析通过对以往相关实验资料的研究分析表明,在免疫干预过程中,NR1a膜蛋白的M3-M4环与胞外氨基端相比,可能更容易诱导产生安全有效的免疫反应。为避免以过长分子作为免疫原所导致的细胞毒性危害,在M3-M4环上筛选出一个自身免疫优势性表位,打破自身免疫耐受而实现安全、可控的免疫干预效果便成了问题的关键。近几年生物信息学的飞速发展使异源分子B细胞表位的预测准确率有了很大提高,但对于自身分子,至今尚未有成熟的B细胞表位预测方法出现。本
孙长凯[3]2003年在《人NMDA受体主亚基M3M4环靶片段自身免疫抗兴奋毒性神经保护研究》文中提出脑血管疾病、脑外伤、脑肿瘤及其继发的脑内综合征(如脑心综合征、消化道出血等)、焦虑、抑郁、疼痛、癫痫、痴呆等重大神经、精神疾患,尽管发病原因各异,但其发生、发展均被证明与N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)异常有一定关联。试图通过选择性干预NMDA受体过度激活所介导的神经兴奋毒性,为上述若干致死、致残性疾患提供有效的防治手段,是近20多年以来基础与临床神经科学研究始终追求的一个重要目标。然而这种努力至今尚未在临床上取得相应成功。其原因可能至少有二:(1)已有NMDA受体拮抗剂或阻断剂的应用“空间窗”过大。NMDA受体在神经系统内分布广泛,具有重要生理功能。以往所检验的NMDA受体拮抗剂或阻断剂均能弥散通过血脑屏障,所以不仅作用于受累脑区的NR靶点,还会广泛影响未受累脑区的重要功能,这应该是导致“天使粉”苯环己哌啶(PCP)与Dizocilpine(MK-801)等显示有严重毒副作用因而难以进入临床的一个主要原因。(2)应用“时间窗”过小。众所周知,神经元可逆性损害的“时间窗”短至数小时、数分甚至数秒,因此通常情况下,有效的神经保护药物难以得到适时使用,不可逆性损害阶段予以应用,显然为时已晚。这种客观上的使用“延迟”可能是导致现有NMDA受体拮抗剂临床应用失败的又一重要原因。 我们认为,对上述若干脑疾患高危人群予以NR自身免疫接种有望解决这两个重要的障碍性问题,NMDA受体干预研究因此可望取得新的突破:(1)治疗“空间窗”缩小。在无疾病的健康状态下,针对自身NR的循环抗体因血脑屏障的限制无法进入作用靶区,而缺乏血脑屏障的脑区恰恰又是非NR富集区和非NR主要工作区,因此对高危人群予以预防性免疫接种,其循环抗体不会对正常人体的生理功能产生明显的影响。而对疾病状态下的受累脑区,局部血脑屏障开放,循环抗体选择性地进入其中,有限地作用于局部过度激活的分子和细胞靶点,由此产生预期的治疗或预防效应。血脑屏障开放度越小,这种选择性干预作用便越小。反之,局部受累脑区损伤越重,其血脑屏障开放程度越大,自身NR循环抗体的特异性干预效应也会越大。(2)治疗“时间窗”延长。特异性循环抗体在疾病发生前或发展中既已存在,一旦疾病发生或进一步发展,受累脑区血脑屏障开放度加大,循环抗体会随之自动进入相应脑区而发挥直接的干预作用,NR过度激活所造成的不可逆性神经元损害因此会得到有效延缓。同时,由于治疗“时间窗”被客观延长,其它任何有效的急救手段也将因此赢得更多的应用时机。 为探讨建立这种“兴奋毒性脑损害免疫防治”全新策略的可能性,我们以人NR主亚基(NR1)重要异型NR1a胞外区受体激活相关靶片段为对象进行了下述研究: 一、人NR1a胞外区受体激活相关靶片段表位分析 采用生物信息学方法对人NMDAR主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽片段P1(第一跨膜域前)、P2片段(第叁、四跨膜域之间即M3M4环的主要部分)的理化特性与抗原性进行了分析。用GOLDKEY软件分别选取公认的Hopp等与Kyte等亲水性参数、Jain表面可及性参数、Karplus-Schulz主链柔韧性参数及Welling抗原性参数对P1、P2两个多肽片段进行多参数分析。并采用通用的Prosite程序与Chou-Fasman方法比较分析P1、P2多肽片段的氨基酸组成与二
康晓楠[4]2003年在《NMDA受体主亚基M3M4环自身免疫抗兴奋毒性研究》文中进行了进一步梳理N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR，NR)介导的兴奋毒性机制与许多常见的神经、精神疾患，如脑出血、脑肿瘤及脑外伤等引起的癫痫、抑郁、痴呆等有密切关系。已有的NR受体拮抗剂或阻断剂均为人工合成的小分子药物，能弥散通过血脑屏障(空间窗过大)，作用选择性低，病变脑区及非病变脑区都会受到影响，而且由于神经元可逆性损害的“时间窗”极短，人们难以适时使用有效的神经保护药物，这些均导致已有的药物难以进入临床。因此，人们开始探讨新的抑制NR功能的方法，保护性疫苗和抗体治疗在该领域是一种新的探索。本课题主要针对NR主亚基NR1的抗原性、免疫原性及其抗体对兴奋毒性神经元损伤保护作用进行充分的研究论证，为兴奋毒性脑损伤免疫干预提供实验基础。主要实验内容如下： 一 NR1激动剂结合区域片段表位分析 采用生物信息学方法对人NMDAR主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽片段P1(第一跨膜区前)、P2片段(第叁、四跨膜域之间)的理化特性与抗原性进行了分析。用GOLDKEY软件分别选取公认的Hopp等与Kyte等亲水性参数、Jain表面可及性参数、Karplus-Schulz主链柔韧性参数及welling抗原性参数对P1、P2两个多肽片段进行参数分析。并采用通用的Prosite程序与Chou-Fasman方法比较分析P1、P2多肽片段的氨基酸位点与二级结构特征。综合判定两个多肽片段的抗原性及其位点，结果认为P2抗原性强于P1。P2片段可能的抗原位点有7个，从氨基端开始依次是FLVLDRPEERI、RLRNPSDKFIYAT、YRHMEKHNYES、RDNKLHAFIW、ASQKCDLVTT、KDSPWKQNVS、ILKSHENGF，分布较均匀，包含有受体激活相关重要位点或与其距离较近。与P1相比，P2更容易成为免疫干预的靶片段。 二M3M4环靶片段特异性单抗表位分析 为了进一步获得M3M4片段的表位信息，我们以单克隆抗体MAB363(识别表位位于人NRI分子M3M4环)淘筛噬菌体展示随机12肤库，对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析，从30个克隆中得到一个阳性克隆序列“VHTN甲sTwQPIL”(克隆1);原核表达的NRI M3M4环可以与克隆1竞争结合MAB363;结合生物信息学预测结果，固相合成5个表位探针短肤，发现其中只有R(22)L RNpsKD可以与M3M4环竞争结合抗体，将NPs叁个氨基酸残基逐一敲除，缺失N或NP的合成肤和M3M4环竞争抗体的能力减弱，缺失N甲S的合成肤完全没有竞争能力。提示N[PS可能是NRI膜蛋白M3M4环靶片段上一个重要的B细胞表位(主表位)，其序列或构象特征，特别是其中S残基在原子水平上的某种特征(另两个阳性克隆序列均含有SPPL残基)，可能为生物信息学预测表位RLRNI〕SD昨工YAT以及噬菌体展示肤vHTNPSTwQPIL的免疫反应原性所必需。 叁M3 M4片段免疫应答检测及抗血清的抗兴奋毒性作用与机制探讨 (一)M3M4片段免疫应答检测 为研究M3M4的免疫原性并制备抗血清，M3M4重组肤(100卜g/只)多点注射免疫Balb/C(H一2‘)小鼠，初次免疫时加福氏佐剂乳化分别于第4周和第6周加强。流式细胞仪测定脾细胞CD4+、CDS寸淋巴细胞亚群，间接ELISA测定血清Thl细胞因子几一2、TN下一a和『N一Y，Th一2细胞因子几一4、IL巧和几一6的水平，同时检测特异性抗体产生情况。第6周和第8周CD4+、CDS’T淋巴细胞的百分率与对照组相比都有显着性的增加(P<0.01)尤其是CDS+T淋巴细胞的百分率有更明显的增加，CD4十/C DS‘比值降低。初次免疫后4w+ld血清细胞因子有显着变化，其中TN下一。、IFN一Y、IL一4、几一6明显增加，与对照组之间有显着性差异，说明小鼠机体内产生了细胞免疫和体液免疫反应。初次免疫后第5周开始可以检测到抗M3M4工gG抗体，以后抗体水平开始升高，于第8周达到高峰，抗血清滴度为l:100。，抗血清还可以结合合成肤NPS，证明该表位具有免疫原性和抗原性。收集抗血清用于功能检测。 (二)M3M4片段抗血清抗兴奋毒性损害作用 以台盼蓝染色法和原位末端标记(TUN’EL)法观察抗血清对原代培养海马神经元兴奋毒性坏死和凋亡的保护效应。结果，在高浓度谷氨酸(500 0 mol/L)条件下，抗血清可以使神经元坏死减少16%;在低浓度谷氨酸(50卜Inol/L)作用下，抗血清保护可使神经元凋亡率减少13%。说明NMDA受体重组肤免疫抗血清具有抗兴奋毒性损伤的作用。以上研究为免疫防治兴奋毒性脑损伤策略的建立提供了坚实的体外实验基础。 (叁)单克隆抗体拟B363抗兴奋毒性损害作用 琳B363识别表位位于主亚基NRI重要功能区附近，为了了解其是否对兴奋毒性脑损害有保护作用，通过检测神经细胞存活率(台盼蓝拒染法)和细胞培养上清乳酸脱氢酶漏出量以及细胞形态学、凋亡率观察，结果发现，0.妙mo1/’L的单抗琳B363可以明显提高神经元抗谷氨酸兴奋毒性损伤能力，细胞存活率提高41%;乳酸脱氢酶漏出量减少25%;抗体表位合成肤可以阻断这种保护，提示该抗体的表位是一个受体功能拮抗靶点。 (四)单克隆抗体以B363抗兴奋毒作用机制探讨 (1)探讨抗体保护与神经元钙离子内流的关系。通过激光共聚焦方法来观察细胞内钙离子浓度变化，结果，体外培养12天的?
康晓楠, 孙长凯, 范明, 薛沿宁, 邵宁生[5]2003年在《噬菌体肽库中筛选NMDA受体抗原表位》文中研究表明为了获得人N 甲基 D 天冬氨酸受体 (NR)主亚基 (NR1)M3 M4环B细胞表位 ,以人NR1分子M3 M4环单克隆抗体MAB36 3淘筛噬菌体展示随机 12肽库 ,对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析 .从 30个克隆中得到一个阳性克隆序列“VHTNPSTWQPIL” (克隆 1) ,原核表达的NR1M 3 M 4环可以与克隆 1竞争结合MAB36 3.固相合成 5个表位探针短肽 ,发现其中只有R (2 2 )LRNPSKD可以与M3 M4环竞争结合抗体 ,将NPS叁个氨基酸残基逐一敲除 ,缺失N或NP的合成肽和M 3 M 4环竞争抗体的能力减弱 ,缺失NPS的合成肽完全没有竞争能力 ,证明MAB36 3的表位为NPS ,S可能是关键性残基 .上述结论为免疫干预防治兴奋毒性脑损害策略的实施提供了一个重要线索和依据
张滢莹, 唐霓, 孙双春, 屈强[6]2013年在《噬菌体肽库中小鼠NMDA受体和转铁蛋白受体模拟抗原表位的筛选》文中进行了进一步梳理N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-asparate receptor,NR)是兴奋性氨基酸的一种特异性受体,在中枢神经发育及神经回路行程中发挥关键作用。NR过度激活可导致癫痫发作、痴呆、脑卒中等临床表现,功能降低可出现精神分裂样症状[1]及T细胞或者抗体及补体介导抗NR抗体脑炎[2]。NR含有7个亚单位,NR1是其功能亚单位,具有NR的一切电生理学特性和药理学活性[3]。选择性阻断NR1活性
孙长凯, 赵杰, 李伍举, 冯健男, 刘淑红[7]2002年在《人N-甲基-D-门冬氨酸受体主亚基受体激活相关多肽的理化特性与抗原性分析》文中研究说明目的 分析人N 甲基 D 门冬氨酸受体 (NMDAR)主亚基NR1a上两个受体激活相关多肽P1、P2的抗原性及其理化特性。方法 用GOLDKEY软件从蛋白质数据库中调出人NR1a分子的氨基酸序列 ,分别在其第一、第叁跨膜域前后逆向、顺向截取 15 1和 14 4个氨基酸长度的多肽片段P1与P2 ,选取Hopp&Woods与Kyte亲水性、Janin表面可及性、Karplus Schulz主链柔韧性及Welling抗原性等参数予以多参数分析 ,采用Prosite程序与Chou Fasman方法比较其氨基酸位点与二级结构特征 ,以此为基础综合判定P1与P2片段的抗原位点并与已有的实验结果相比较。结果 P1、P2多肽片段上可能分别有 6和 7个 8～ 15aa长序列具有良好的抗原性。P1相关序列主要分布于其氨基端 ,与配体结合关键氨基酸残基相距较远。P2上的相关序列分布较均匀 ,包含有受体激活重要相关位点或与配体结合关键氨基酸残基距离较近。P2片段的总体抗原性、亲水性与可及性均强于P1,尤以其近膜的 15个残基为着。P1、P2多肽片段均含有一定数量的 β 转角 ,但P1片段含有较多的半胱氨酸残基和无规卷曲 ,而P2片段则含有较多的芳香族残基并以α螺旋结构为主。结论 人NMDAR主亚基NR1a上的两个受体激活相关多肽P1、P2均具有一定数量的抗原位点 ,与P1相比较 ,P2可能更易成为NMDAR免?
李双月[8]2004年在《人NR1a膜蛋白M3-M4环B细胞表位肽小鼠免疫接种途径及其对策研究》文中进行了进一步梳理N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)的过度激活与脑血管疾病、脑外伤、脑肿瘤及其继发的脑内综合征(如脑心综合征、消化道出血等)、焦虑、抑郁、疼痛、癫痫、痴呆等重大神经、精神疾患密切相关。如果能及时、有效地选择性干预局部受累脑区NR过度激活所介导的神经兴奋毒性,将为上述疾患提供有效的防治手段。但已有的NR干预药物因严重的毒副作用和难以适时使用而不能进入临床,兴奋毒性脑损害防治策略研究急需取得新的突破。安全、有效的保护性疫苗接种和抗体治疗在该领域是一种新的探索。本实验主要针对人NR主亚基NR1a膜蛋白M3-M4环B细胞表位(NE1)的八分枝抗原肽(multiple antigen peptides, MAPsNR1a)的免疫接种途径进行比较研究,并以MAPsNR1a为筛选抗原淘筛人源性噬菌体抗体库,为兴奋毒性脑损害疫苗免疫防治策略的建立提供实验基础。主要实验内容如下:一. MAPsNR1a的设计、合成和小鼠免疫接种途径研究本实验组已得到人NR1a膜蛋白M3-M4环上一个B表位NE1,固相合成法合成MAPsNR1a,并以MAPsNR1a为免疫原对小鼠进行鼻腔、腹腔、皮下等多途径免疫接种并检测MAPsNR1a特异性抗体;对小鼠进行多指标行为学观察、水迷宫、避暗、跳台等实验及鼻粘膜HE染色,评估MAPsNR1a免疫的安全性和有效性。结果提示,皮下和腹腔免疫接种均检测到MAPsNR1a特异性抗体,且对小鼠的行为、学习记忆能力没有影响,此两种途径安全、有效,可以作为MAPsNR1a抗兴奋毒性脑保护疫苗的接种途径;鼻腔免疫接种未检测到相应抗体,但鉴于其应用简便等优点,可通过佐剂交联、改变MAPsNR1a的溶解状态等方法进行进一
参考文献：
[1]. NMDA受体主亚基NR1抗原表位分析[D]. 李桂新. 大连医科大学. 2004
[2]. 人NR1a膜蛋白自身免疫优势性表位确定及其抗体功能检验[D]. 吴兰香. 大连医科大学. 2004
[3]. 人NMDA受体主亚基M3M4环靶片段自身免疫抗兴奋毒性神经保护研究[D]. 孙长凯. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[4]. NMDA受体主亚基M3M4环自身免疫抗兴奋毒性研究[D]. 康晓楠. 大连医科大学. 2003
[5]. 噬菌体肽库中筛选NMDA受体抗原表位[J]. 康晓楠, 孙长凯, 范明, 薛沿宁, 邵宁生. 生物化学与生物物理进展. 2003
[6]. 噬菌体肽库中小鼠NMDA受体和转铁蛋白受体模拟抗原表位的筛选[J]. 张滢莹, 唐霓, 孙双春, 屈强. 细胞与分子免疫学杂志. 2013
[7]. 人N-甲基-D-门冬氨酸受体主亚基受体激活相关多肽的理化特性与抗原性分析[J]. 孙长凯, 赵杰, 李伍举, 冯健男, 刘淑红. 中华医学杂志. 2002
[8]. 人NR1a膜蛋白M3-M4环B细胞表位肽小鼠免疫接种途径及其对策研究[D]. 李双月. 大连医科大学. 2004
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