一、卵巢癌组织多药耐药性的临床研究（论文文献综述）
叶鑫鑫[1]（2021）在《MyD88上调P-gp介导宫颈癌顺铂化疗耐药机制的初步探讨》文中研究说明目的:宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,对于晚期或复发转移性宫颈癌患者最重要的治疗手段是化疗,然而宫颈癌化疗耐药的产生是导致治疗失败的主要原因。因此,探究宫颈癌化疗耐药的潜在机制对提高晚期或复发转移性宫颈癌患者的治疗疗效大有裨益。既往研究发现,MyD88在肿瘤组织中高表达,与多种肿瘤的耐药机制相关,但尚无研究证实其与宫颈癌化疗耐药的关系。因此,本研究探寻MyD88对宫颈癌顺铂化疗耐药性的影响,分析其潜在的作用机制,为宫颈癌顺铂化疗耐药逆转研究提供新的靶点和方向。方法:首先挖掘公共数据库中MyD88及P-gp在宫颈癌组织及正常对照组织中的RNA表达差异以及MyD88对宫颈癌预后的影响。随后利用蛋白免疫印迹实验（Western-blot）检测He La（宫颈癌细胞）与He La/DDP（宫颈癌顺铂耐药细胞）中MyD88与P-gp蛋白的表达情况。针对MyD88转录本的共同序列设计了3组siRNA,挑选干扰效果最为明显的siRNA转染至He La/DDP细胞中,利用CCK8增殖实验探究干扰组（He La/DDP-siRNA）、空载组（He La/DDP-NC）、对照组（He La/DDP-control）以及亲本He La细胞在含顺铂培养基中的增殖能力。最后在MyD88下调的耐药株中利用Western-blot探究P-gp的表达较前有无差异。结果:1.TCGA公共数据库中发现,MyD88及P-gp在宫颈癌组织中的表达均高于正常对照组织,低表达MyD88组远期生存率高于高表达MyD88组。2.通过蛋白免疫印迹实验发现,MyD88、P-gp在He La/DDP细胞中的表达均高于亲本细胞株He La。3.通过siRNA干扰实验,当He La/DDP细胞中MyD88被下调后,P-gp蛋白的表达量也随之下降,证明MyD88可能调控P-gp的表达。4.MyD88下调后,通过CCK8增殖实验,我们发现He La/DDP细胞在含顺铂培养基中的增殖能力明显受到抑制。结论:MyD88与宫颈癌顺铂耐药细胞的耐药性相关,干扰MyD88的表达能提高宫颈癌顺铂耐药细胞的化疗敏感性。MyD88与P-gp在宫颈癌顺铂耐药细胞中的表达成正相关关系,其可能通过调控P-gp蛋白的表达,从而影响宫颈癌细胞的顺铂耐药性。因此,如果能够对其采取合理有效的干预手段,MyD88有可能成为新的宫颈癌顺铂耐药治疗靶点。
郭敏[2]（2021）在《Hsa＿circ＿0000714/miR-370-3p调控RAB17对卵巢癌紫杉醇耐药的影响及机制研究》文中认为目的:卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,具有高度的侵袭性和致死性。由于卵巢位置深、早期症状不典型和筛查方法不可靠,大多数卵巢癌患者被诊断时已为晚期。卵巢癌的一线治疗包括手术切除并联合紫杉醇（PTX）化疗,虽然近年来中位生存率有所改善,但随之而来的紫杉醇耐药现象已经成为卵巢癌患者治疗失败的主要原因,5年生存率仅为15%-30%。研究表明,RAB小GTP酶和相关调控蛋白及效应器参与许多癌症的发生发展过程,作为RAB家族的一员,RAB17在调节众多癌症的转移和进展过程中发挥着重要的作用,但是,截至目前为止,RAB17参与肿瘤耐药的具体机制仍不清楚。环状RNA（circRNAs）的是一类无5’—帽或3’—多腺苷尾、具有共价闭环结构的非编码RNA,具有结构稳定、保存性好、组织特异性强、在不同物种的不同发育阶段有表达特异性等特性,这些特性使circRNA成为近年来的研究热点。circRNAs可以作为竞争性内源RNA（ceRNA）或miRNA海绵,通过miRNA响应元件（MRE）与miRNA结合,并对其活性进行负调控。miRNAs是一类丰富的小型非编码RNAs,长约22个核苷酸。它们通过与各自3’-非翻译区（3’-UTR）的不完全碱基配对,在转录后水平上充当基因表达的负向调节剂。作为miRNA海绵体,circRNAs可以作为促癌基因或肿瘤抑制基因发挥作用,越来越多的研究表明,circRNAs的失调与众多癌症的进展有关。尽管如此,但circRNAs在卵巢癌紫杉醇耐药中的功能作用仍不明确。本研究发现RAB17在耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/PTX中高表达,证实RAB17在紫杉醇耐药、细胞增殖和细胞周期中的重要作用,并对RAB17及其非编码RNA网络hsa＿circ＿0000714/miR-370-3p/RAB17在卵巢癌紫杉醇耐药中的作用及其机制进行解析,有助于提高对紫杉醇耐药的理解以及确定卵巢癌紫杉醇耐药的潜在生物标志物。研究方法:1、通过基因芯片筛选在耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/PTX和紫杉醇敏感细胞A2780中表达显着差异的RAB家族蛋白,结合差异倍数和P值,选择在A2780/PTX细胞中高表达而在A2780中低表达且差异倍数最大的RAB17进行研究。2、通过CCK8实验检测卵巢癌紫杉醇敏感细胞SKOV3,A2780及耐药细胞SKOV3/PTX,A2780/PTX的紫杉醇耐药指数。通过定量实时PCR（qRT-PCR）并结合Western blotting检测SKOV3,A2780及SKOV3/PTX,A2780/PTX细胞中RAB17mRNA和蛋白水平的表达情况。3、分别在A2780/PTX细胞转染RAB17干扰质粒和A2780细胞转染RAB17过表达病毒后,利用qRT-PCR和Western blotting检测转染效率。CCK8测定A2780/PTX干扰RAB17表达和A2780过表达RAB17后的紫杉醇耐药指数。克隆增殖实验检测RAB17表达变化后细胞的克隆增殖能力。流式细胞仪用于分析细胞周期变化。Western blotting用于检测相关凋亡蛋白、抗凋亡蛋白、黏附蛋白和相关信号通路的表达变化。4、利用生物信息学数据库Star Base（http://starbase.sysu.edu.cn/）和双荧光素酶报告基因实验相结合,筛选与RAB17的3’-UTR区互补的miRNA miR-370-3p并验证RAB17与miR-370-3p的靶向关系。通过生物信息学数据库Star Base分析,筛选在A2780中低表达而在A2780/PTX中高表达,可以作为miR-370-3p分子海绵的circRNA hsa＿circ＿0000714,细胞核质分离实验检测hsa＿circ＿0000714的定位情况,双荧光素酶实验验证miR-370-3p与hsa＿circ＿0000714间的靶向关系。QRT-PCR和Western blotting检测A2780/PTX细胞转染miR-370-3p mimics或干扰hsa＿circ＿0000714后RAB17表达情况,CCK8检测细胞紫杉醇耐药指数变化。克隆增殖实验检测细胞增殖情况。流式细胞仪检测细胞周期变化。Western blotting检测相关信号通路蛋白的变化。研究结果:1、RAB17在耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/PTX中显着高表达,而在相应卵巢癌紫杉醇敏感细胞A2780中低表达。2、A2780/PTX细胞敲低RAB17表达显着增加细胞对紫杉醇的敏感性,使细胞紫杉醇耐药指数下降,显着抑制细胞增殖,使A2780/PTX细胞G1期增加而S期减少,将更多细胞阻滞在G1期,抑制细胞周期,且相应的黏附蛋白和凋亡蛋白表达增加,抗凋亡蛋白表达减少。3、A2780细胞过表达RAB17降低A2780细胞对紫杉醇的敏感性,使A2780细胞紫杉醇耐药指数增加,促进细胞增殖,使细胞G1期减少而S期增加,加快细胞G1-S期转换,促进细胞周期,且相应的黏附蛋白和凋亡蛋白表达减少,而抗凋亡蛋白表达增加。4、生物信息学数据库Star Base分析RAB17的3’-UTR区具有miR-370-3p的潜在结合位点。双荧光素酶实验结果显示,当miR-370-3p mimics与RAB17-WT共转染时,荧光素酶活性明显降低,说明RAB17是miR-370-3p的直接靶基因。5、A2780/PTX细胞转染miR-370-3p mimics后RAB17表达受到显着抑制,细胞紫杉醇耐药指数下降,克隆增殖能力减弱,细胞G1期增加S期减少使细胞周期阻滞在G1期,抑制细胞周期。6、Hsa＿circ＿0000714在耐药细胞A2780/PTX中高表达而敏感细胞A2780中低表达。核质分离实验显示hsa＿circ＿0000714主要在细胞质中表达,这为hsa＿circ＿0000714发挥分子海绵提供可能,双荧光素酶实验证实miR-370-3p与hsa＿circ＿0000714间的相互作用。A2780/PTX细胞中hsa＿circ＿0000714表达被干扰时,qRT-PCR显示miR-370-3p表达增加,而RAB17表达被抑制,证实hsa＿circ＿0000714可以作为miR-370-3p的分子海绵进一步调节靶基因RAB17的表达。7、当siRNA质粒干扰hsa＿circ＿0000714表达后,A2780/PTX细胞紫杉醇耐药指数下降,细胞克隆增殖能力减弱,细胞G1期增加而S期减少,将更多细胞阻滞在G1期,抑制细胞周期。8、Hsa＿circ＿0000714/miR-370-3p调节RAB17表达,通过激活CDK6/RB信号通路,从而影响卵巢癌细胞A2780/PTX紫杉醇耐药。结论:卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/PTX中存在hsa＿circ＿0000714/miR-370-3p/RAB17调控网络,hsa＿circ＿0000714作为miR-370-3p的分子海绵调控靶基因RAB17表达通过激活CDK6/RB信号通路在卵巢癌紫杉醇耐药进展中发挥作用。
殷蓓蓓[3]（2020）在《阿帕替尼联合多西他赛治疗转移性卵巢癌疗效、安全性及增效机制研究》文中研究表明卵巢癌（Ovarian cancer）作为妇科常见的恶性肿瘤,发病率及病死率均居前列,对女性的生命健康造成严重威胁,由于其发病隐蔽的特点,让许多患者在临床症状出现后进行诊断时已是晚期,这在一定程度造成了患者总体的生存率较低。目前针对卵巢癌的主要治疗方法为手术和化疗,当患者进行初始治疗时,手术效果是影响患者预后的重要因素,对于中晚期患者,初始满意的肿瘤细胞减灭术至关重要。除手术治疗外,系统化疗也是治疗卵巢癌的另一方法,通常选用铂类联合紫杉醇类药物。卵巢癌一线含铂化疗的有效率为70%,但通常半数以上的患者会复发。近些年,虽然卵巢癌的治疗进展不断更新,但对于复发性卵巢癌尚无统一的治疗方式。初始卵巢癌治疗以规范化为主,而复发性卵巢癌则以个体化治疗为主,主要的治疗方式包括二线化疗、再次肿瘤细胞减灭术、靶向治疗、内分泌治疗、放疗。卵巢癌的复发分为铂敏感复发和铂耐药复发两种,区分的标准为铂类药物停用的时间,停用6个月以上为铂敏感型复发,停药6个月之内复发为铂耐药复发。通常对于因铂耐药而复发的患者来说,指南推荐可选择非铂类化疗单药（紫杉类药物、吉西他滨、拓扑替康、依托泊苷）、靶向治疗（奥拉帕利）、或将非铂类化疗药物和贝伐单抗进行联合治疗。对于一线应用紫衫类药物联合铂方案化疗,二线多西他赛单药治疗的患者,有潜在耐药的可能。肿瘤多药耐药（multidrug resistance,MDR）作用的产生机制较为复杂。其中,得到广泛关注的有:①药物靶点突变;②药物摄入或流入减少;③激活代偿性细胞生存的信号通路;④增加DNA损伤修复方式;⑤使药物外排泵表达增加,从而减低耐药细胞药物的浓度等。P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）是目前的研究热点,也称为ABC转运体B家族成员1（ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1）或多药耐药蛋白 1（multidrug resistance protein 1,MDR1）,此外多药耐药相关蛋白 2（Multidrug resistance-associated protein 1,MRP2）和乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein,BCRP,ABCG2）也是最常参与耐药化疗的超家族成员。生物界的转运蛋白多属于ABC家族。目前约100余种被发现,ABCB1的相对分子质量为170×103,是一种ATP依赖性膜蛋白,ABCB1除了癌细胞外,在上皮细胞顶端也是高水平表达,如结肠、肝胆管、胰腺小管、肾上腺、胎盘（血胎盘屏障）、睾丸（血睾丸屏障）、脑毛细血管（血脑屏障）。在解剖学上,ABCB1作为一个外排转运体,限制细胞摄取药物从血液进入大脑,并从肠腔进入肠细胞。另一方面,ABCB1分别促进肝细胞和肾上皮细胞的药物排泄进入胆汁和尿液。ABCB1的组成包括两同源核苷酸结合区域（nucleotide binding domain,NBD）和两个跨膜区域（transmembrane domain,TMD）。每个跨膜结构域由6个跨膜螺旋组成12个跨膜螺旋流出泵,结合疏水药物底物。它的亲水区域包含ATP结合位点,结合两个ATP分子。药物底物的流出导致ATP水解成ADP和无机磷酸盐,允许跨膜结构域结合另一个被流出的底物。通过这种连续循环的方式降低肿瘤细胞的耐药性。ABCB1的抗癌药物底物包括蒽环类、紫杉类、鬼叶藻毒素类、长春花生物碱类和酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）如拉帕替尼、厄洛替尼、舒尼替尼等。ABCB1的过表达与多种癌症相关,除实体瘤外还包括血液系统恶性肿瘤。逆转肿瘤耐药的方式有很多,针对ABCB1而言,主要如下:①化学逆转剂的应用;②改变临床用药在释放时的方式和系统;③与其他药物合用,提高药物有效性或降低药物毒性;④在基因水平进行逆转耐药;⑤应用纳米载体系统,快速高效的作用于肿瘤;⑥开发新型药物。ABCB1抑制剂处在不断的更新换代之中,已经历了三代发展,第一代抑制剂是在偶然的状况下发现的,包括维拉帕米、奎尼丁、胺碘酮等,在应用的过程中由于其对肾脏等器官具有一定的毒性作用而逐渐被第二代抑制剂所取代。第二代抑制剂的优点是在一定程度上增强了药物的活性,对肿瘤具有较好的治疗作用,临床中常用的主要有右旋维拉帕米、PSC833等,但是二代抑制剂对肝脏的解毒功能损伤严重,且长期应用会造成药物的代谢紊乱,危害机体的健康。第三代ABCB1抑制剂如dofequidar,zosuquidar,等,这些药物作用更强,药代动力学相互作用更少,但联合使用时会导致一些化疗毒性。虽然当前对于肿瘤抑制剂的研究很深入,但是仍没有MDR的逆转剂的相关报道应用于临床。靶向药物如TKIs在肿瘤治疗中起重要作用,但TKIs与传统抗癌药物少有协同作用。由于TKIs与传统抗癌药物主要毒副作用不重叠,同时,TKIs能与酪氨酸激酶的ATP结合点结合,从而抑制ABC转运泵的功能。研究发现阿法替尼、厄洛替尼、拉帕替尼等临床常用药物通过作用于其靶点蛋白ABCB1,抑制ABCB1的功能,从而增加MDR细胞内底物性抗癌药物的累积,以增加传统抗癌药物的体内外抗肿瘤效果。Apatinib（YN968D1）通常作用于血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2 VEGFR-2）,是一种小分子酪氨酸激酶抑制剂,它会选择性的阻断信号传导,起到抗血管生成的作用,进而控制肿瘤发生。2014年12月,阿帕替尼被获批用于二线化疗失败的晚期胃癌患者。目前在肺癌、肝癌、食管癌、骨肉瘤等瘤种均开展了多项临床研究,尤其是探讨其与化疗、靶向、免疫治疗联合治疗的协同增效的相关临床研究取得了很好的结果。临床研究显示阿帕替尼在卵巢癌治疗中的疗效也是肯定的。综上所述,阿帕替尼治疗耐药性晚期实体瘤的相关研究逐步成为临床研究的热点。迄今为止,尚未有针对阿帕替尼协同多西他赛治疗卵巢癌的增效机制研究。本课题拟通过临床、体内、体外三个层面研究阿帕替尼对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛耐药的影响,深入探究阿帕替尼联合多西他赛治疗转移性卵巢癌的协同增效作用机制,为复发转移性卵巢癌患者提供新的治疗思路。第一部分阿帕替尼联合多西他赛对比单药多西他赛治疗转移复发性卵巢癌的疗效及安全性研究目的:探讨阿帕替尼联合多西他赛对照多西他赛治疗二线及以上铂耐药复发转移性卵巢癌的疗效及安全性。方法:临床上收集47例铂耐药复发转移性卵巢癌患者,根据治疗方案分为2组:单纯化疗组（24例）,阿帕替尼联合化疗组（23例）。具体给药方法:单纯化疗治疗组患者采取多西他赛单药化疗治疗,阿帕替尼联合化疗组采取多西他赛和阿帕替尼联合治疗,比较这两组卵巢癌患者的疗效和不良反应发生情况,监测多西他赛的血药浓度,研究分析这两组患者的血药浓度与疗效之间存在的关系。结果:1.阿帕替尼联合化疗组ORR及DCR均优于单纯化疗组。单纯化疗组CRO例,PR 4例,SD 7例,PD 31例,ORR为16.67%,DCR为45.83%;阿帕替尼联合化疗组CR0例,PR 11例,SD8例,PD 4例,ORR为47.83%,DCR 82.61%,两组ORR 比较有明显差异（P=0.022）,两组DCR 比较有明显差异（P=0.009）。2.阿帕替尼联合化疗组中位PFS均优于单纯化疗组。单纯化疗组中位PFS为3.2（1.8～5.1）个月,阿帕替尼联合化疗组中位PFS为8.8（7.5～10.1）个月,阿帕替尼联合化疗组PFS显着高于单纯化疗组,经log-rank检验,差异有统计学意义（χ2=17.22,P<0.01）。3.阿帕替尼联合化疗组中位OS均优于单纯化疗组。单纯化疗组中位OS为10（8.44～11.56）个月,阿帕替尼联合化疗组中位OS为16.7（14.84～18.56）个月,阿帕替尼联合化疗组生存时间较单纯化疗组时间长,经log-rank检验,两者有明显差异（χ2=44.35,P<0.01）。4.阿帕替尼联合化疗组常见不良反应为高血压、手足综合征、蛋白尿。与单纯化疗组相比,阿帕替尼联合化疗组常见不良反应为高血压（52.17%）、手足综合征（34.78%）、蛋白尿（30.43%）,有统计学意义,其余不良反应两组无明显差异。5.多西他赛的AUC与与疗效成正相关。单纯血药浓度-时间曲线下面积（area under the curve AUC）与疗效评价之间存在线性关系,χ2=6.224,P=0.013。Pearson相关结果显示,AUC与疗效评价有线性关系,AUC与疗效成正相关（R=-0.368,P=0.011）。结论:阿帕替尼联合多西他赛治疗铂耐药复发转移性卵巢癌,不论是近期疗效还是远期疗效均较单用化疗组有明显优势,且安全性较好,仅高血压、手足综合征、蛋白尼尿的发生率略高于单用化疗组。阿帕替尼联合多西他赛治疗效果显着,为临床广泛应用提供支持。第二部分阿帕替尼体内水平对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的作用研究目的:构建耐药性荷瘤裸鼠动物模型,体内水平验证阿帕替尼协同耐药卵巢癌细胞对ABCB 1转运体底物性化疗药物多西他赛的抗肿瘤作用,初步探讨阿帕替尼与多西他赛联合治疗体内协同抑瘤作用机制,为提高卵巢癌治疗水平提供实验室依据。方法:1.构建卵巢癌耐药性BALB/c荷瘤裸鼠动物模型,a)对照组:腹腔注射生理盐水;b)多西他赛组:腹腔注射8 mg/kg多西他赛;c)阿帕替尼组:腹腔注射剂量100 mg/kg阿帕替尼;d)阿帕替尼联用多西他赛组:腹腔注射8 mg/kg多西他赛+100 mg/kg阿帕替尼。2.LC-MS/MS法检测组织及血浆中多西他赛的浓度。3.TUNEL实验检测组织细胞凋亡作用。4.Western blot测定P-gp水平变化。5.qRT-PCR检测组织中ABCB1转运体mRNA的表达。结果:1.阿帕替尼增效多西他赛对ES-2/D细胞异种移植肿瘤的生长抑制作用。各组小鼠初始体重差异无统计学意义（F=0.347,p=0.792）,组间均衡性良好。单纯使用多西他赛组的小鼠第20天小鼠体重均低于其他三组,差异均有统计学意义（P<0.01）。不同治疗组间的移植瘤体积存在明显差异性,对照组、阿帕替尼组、多西他赛组小鼠肿瘤体积显着增大（t=60.96,P<0.01;t=22.15,P<0.01;t=10.81,P<0.01）,而阿帕替尼联合多西他赛用药组小鼠肿瘤体积显着小于初始体积（t=7.45,P=0.001）。对照组的肿瘤抑制率是1.89%;阿帕替尼单独治疗组的肿瘤抑制率为82.00%;多西他赛治疗组的肿瘤抑制率为66.54%;而阿帕替尼联合多西他赛用药组小鼠的肿瘤抑制率为111.46%,联合治疗组小鼠的肿瘤抑制率高于单一治疗组（P<0.05）,差异具有统计学意义。2.阿帕替尼增高小鼠肿瘤组织多西他赛的浓度。多西他赛和阿帕替尼在肿瘤中的浓度差异有统计学意义（t=12.78,P<0.01）,在血浆、肾脏、肝脏、肺部及心脏中浓度差异无统计学意义（t=1.56,p=0.148;t=0.028,P=0.978;t=0.544,P=0.598;t=0.436,P=0.672;t=0.118,P=0.909）。3.阿帕替尼增效多西他赛诱导的ES-2/D细胞凋亡。TUNEL染色后,免疫荧光结果发现,与对照组、多西他赛组及阿帕替尼组相比,多西他赛和阿帕替尼联用会引起明显的细胞核碎裂,可见较多绿色荧光的TUNEL染色阳性细胞。4.阿帕替尼下调小鼠肿瘤组织ABCB1mRNA的表达。采用qRT-PCR检测四组小鼠肿瘤组织ABCB1mRNA的表达水平,对照组、阿帕替尼组、多西他赛组及多西他赛联用阿帕替尼组小鼠肿瘤组织ABCB1转运体mRNA的表达水平依次下降,单因素方差分析提示不同处理组表达水平差异显着（F=174.19,P<0.01）,Turkey检验两两比较,各处理组ABCB1转运体mRNA表达水平差异全部有统计学意义（P<0.01）。因此,多西他赛联合阿帕替尼给药组可显着降低肿瘤组织中ABCB1转运体在mRNA水平的表达量。5.多西他赛联合阿帕替尼降低了肿瘤中P糖蛋白的表达。qRT-PCR结果显示,给予多西他赛治疗后肿瘤组织中MDR1的基因表达水平显着升高（P<0.01）,药物治疗后肠道组织中的BCRP和MRP2的基因表达水平没有明显改变。Western blot结果显示,给予多西他赛治疗后肿瘤组织中P-gp表达水平显着升高（P<0.01）,阿帕替尼联合或不联合多西他赛对肠道组织MDR1、MRP2、BCRP的表达均无影响（P>0.05）。结论:1.本部分动物实验研究中,阿帕替尼提高多西他赛对卵巢癌肿瘤组织生长抑制作用。2.阿帕替尼与多西他赛对卵巢癌的体内协同抑瘤作用主要通过增加肿瘤局部多西他赛浓度、诱导肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤组织ABCB1基因及降低P-gp表达来实现。第三部分阿帕替尼体外水平对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的影响及其作用机制研究目的:体外水平验证阿帕替尼对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的影响及其作用机制。本部分主要通过细胞学实验,进一步探讨阿帕替尼联合多西他赛在耐药性卵巢癌中的治疗效果及其增效机制,为临床耐药性卵巢癌患者用药提供参考。方法:1.MTT法确定阿帕替尼用于体外实验时的浓度,MTT法检测细胞增值抑制率。2.细胞凋亡实验检测阿帕替尼对卵巢癌细胞凋亡的影响。3.药物蓄积实验检测罗丹明123在卵巢癌细胞中蓄积的影响。4.通过体外转运实验研究阿帕替尼对ABCB 1转运体外排过程的影响。5.Pgp-GloTM试剂盒检测阿帕替尼对ATPase的影响。6.Westeron blot检测阿帕替尼对耐药卵巢癌细胞中ABCB1转运体表达的影响。7.qRT-PCR检测不同浓度阿帕替尼、维拉帕米及拉帕替尼对MDR1表达的影响。8.Westeron blot检测NF-κB信号通路蛋白表达,免疫荧光法检测阿帕替尼对NF-κB的P65亚基的核转位的影响。结果:1.阿帕替尼细胞水平作用浓度预实验。阿帕替尼与化疗药物联用于卵巢癌敏感株ES-2细胞及卵巢癌耐药株ES-D细胞的三个浓度分别选为0.1、0.3、0.5μM及0.5、1.0、2.0μM。2.阿帕替尼可浓度依赖性地提高多西他赛对ES2/D细胞的抗肿瘤作用。敏感细胞株ES-2随着阿帕替尼联用浓度增加IC50的变化无统计学意义（F=2.75,P=0.112）;耐药细胞株ES-2/D随着阿帕替尼联用浓度增加IC50的降低,差异有统计学意义（F=12103,P<0.01）。3.阿帕替尼浓度依赖性的增加多西他赛诱导的ES-2/D细胞的凋亡作用。不同浓度条件下诱导ES-2/D细胞的凋亡率差异不显着(（F=0.081,P=0.968）。阿帕替尼和多西他赛对ES-2/D细胞凋亡率主效应均有统计学意义（F=509.40,P<0.01;F=717.92,P<0.01）,与阿帕替尼进行联用时,ES-2/D细胞的凋亡率表现出随着多西他赛浓度的增加,细胞凋亡率也在增加。不同浓度阿帕替尼联用多西他赛后凋亡率与单用相同浓度的多西他赛组相比,有显着差异（P<0.01）。4.阿帕替尼增加Rh123在ES-2/D细胞内的蓄积。ES-2细胞在不同浓度阿帕替尼实验组及维拉帕米阳性对照组中罗丹明123蓄积量差异无统计学意义（F=0.624,P=0.729）。阿帕替尼浓度与Rh123在ES-2/D细胞内的蓄积量成正比,阿帕替尼浓度越高,Rh123积蓄量越大（P<0.05）。5.阿帕替尼增强ABCB1转运体ATPase的活性。不同浓度阿帕替尼影响下,ABCB1转运体的ATPase的活性差异有显着差异（F=124.195,P<0.01）;不同浓度多西他赛影响下ABCB1转运体的ATPase的活性有显着差异（F=165.79,P<0.01）;与对照组相比,阿帕替尼与多西他赛均可增强ATPase的活性（P<0.05）。6.阿帕替尼降低ES-2/D细胞中MDR1基因mRNA的表达。ES-2/D细胞中ABCB1的表达水平显着高于ES-2细胞（P<0.05）,且阿帕替尼的浓度与ES-2/D细胞内ABCB1的表达水平成反比,阿帕替尼浓度越高,ABCB1表达水平越低。但是,ES-2/D细胞内ABCB1基因的表达不受维拉帕米和拉帕替尼的影响,差异不显着（P>0.05）。7.阿帕替尼降低ES-2/D细胞中ABCB1蛋白的表达。随着阿帕替尼浓度的逐渐升高,其对耐药ES-2/D细胞ABCB1转运体的抑制作用越大,细胞内ABCB1表达水平明显降低,在拉帕替尼作用的情况下,同等浓度的拉帕替尼对ABCB1转运体的表达水平无影响。8.阿帕替尼通过抑制NF-κB通路下调ABCB 1转运体的表达。检测阿帕替尼给药处理对ES-2/D细胞内NF-κB通路的影响,与NF-iκB通路的抑制剂PDTC作用相似,阿帕替尼显着下调了 ES-2/D细胞胞浆和胞核内NF-κB p65的表达水平。阿帕替尼会通过抑制NF-κ B信号通路的激活,进而降低ES-2/D细胞内ABCB1转运体的表达水平。结论:1.本部分研究证实阿帕替尼能够显着增强多西他赛在ES-2/D耐药细胞中的细胞毒性。2.阿帕替尼与多西他赛均可增强ATPase的活性,提示两者均为ABCB1的底物。3.阿帕替尼显着抑制了 ES-2/D耐药细胞内P-gp蛋白的表达量。4.阿帕替尼从mRNA水平与蛋白水平两个方面抑制了 ABCB1的表达。4.阿帕替尼会显着抑制NF-κB通路的激活,进而在蛋白水平上抑制ABCB1转运体的表达。
刘熙[4]（2020）在《冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究》文中提出[目 的]恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,目前化疗仍是恶性肿瘤临床治疗的主要方法之一。肿瘤多药耐药（Multidrug resistance,MDR）的产生是导致化疗失败,影响肿瘤患者临床预后的主要因素。因此,探寻新型作用机制、作用靶点的抗MDR药物是改变肿瘤治疗现状的重要途径,具有重要的临床意义。本课题组基于冬凌草甲素的抗肿瘤活性及其构效关系,构建了一系列以构象限制、取代基变换以及环特性变换等为特点的新型冬凌草甲素衍生物,并在前期研究中证实了其抗肿瘤作用,但该系列化合物是否具有抗肿瘤多药耐药的作用尚不清楚。本研究以耐阿霉素人乳腺癌MCF-7/ADR细胞和耐顺铂人卵巢癌A2780/CP细胞为模型,体内、外实验考察抗肿瘤活性较高的冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌和卵巢癌细胞耐药细胞的抑制作用,并探讨其作用机制。[方 法]1.采用MTT实验、克隆形成实验检测冬凌草甲素衍生物YD0514,CYD0618和CYD0686对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞的增殖抑制作用。2.采用细胞划痕实验、Transwell实验考察CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞迁移及侵袭能力的影响。3.采用流式细胞技术检测CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞凋亡的影响。4.构建MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞裸鼠移植瘤模型,考察CYD0618在体内对移植瘤的生长抑制作用。5.采用siRNA干扰技术敲低MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞STAT3的表达,检测干扰STAT3对细胞耐药性的影响。6.转染 STAT3 过表达载体（pcDNA-STAT3）或 IL-6 刺激 MCF-7 和 A2780细胞高表达STAT3,检测过表达STAT3对细胞耐药性的影响。7.采用Western Blot及免疫组织化学方法检测CYD0618对MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞STAT3及其下游信号分子表达的影响。8.采用免疫荧光技术检测CYD0618对STAT3表达及核定位的影响。9.采用分子对接法模拟分析CYD0618和STAT3相互作用的结构域。10.采用免疫共沉淀法和细胞热转变实验（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）检测 CYD0618 和 STAT3 的结合。[结 果]1.MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞呈现多药耐药特性,且具有更强的迁移及侵袭能力。2.冬凌草甲素衍生物 YD0514、CYD0686、CYD0618 对 MCF-7/ADR 及A2780/CP耐药细胞均有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性,其中CYD0618的抑制作用最强。3.划痕实验,Transwell实验结果发现CYD0618能够抑制MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的迁移及侵袭。4.流式细胞分析结果示CYD0618能够显着促进MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的凋亡。5.体内实验结果显示CYD0618显着抑制MCF-7/ADR和A2780/CP耐药细胞裸鼠移植瘤的生长,且无明显的毒副作用。6.分别在MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞中干扰STAT3,在MCF-7、A2780细胞中过表达STAT3,药物敏感实验结果显示STAT3与乳腺癌及卵巢癌细胞的耐药性密切相关。7.Western Blot结果显示CYD0618能显着抑制STAT3的表达及磷酸化,以及STAT3下游增殖、凋亡及侵袭转移相关分子的表达。免疫组化分析证实CYD0618 能抑制移植瘤 STAT3、p-STAT3、Cyclin D1 的表达,并促进 Cleaved Caspase-3的表达。免疫荧光结果示CYD0618能够抑制STAT3入核。8.分子对接结果示CYD0618能够靶向结合STAT3的SH2结构域,引起构象变化,从而抑制Tyr705残基处STAT3的磷酸化。免疫共沉淀及CETSA结果显示CYD0618能够直接结合STAT3。[结 论]STAT3的激活与乳腺癌和卵巢癌细胞的耐药性密切相关,提示药物靶向调控STAT3的活性与功能可能是一种合理、有效的抗肿瘤多药耐药的策略。冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌及卵巢癌耐药细胞均具有显着的体内、体外抑制作用。CYD0618通过直接靶向结合并抑制STAT3,进而抑制MCF-7/ADR及A2780/CP耐药细胞的增殖、侵袭和转移,促进耐药细胞的凋亡。本研究结果表明冬凌草甲素衍生物CYD0618是一种有效的STAT3抑制剂,具备开发为抗肿瘤新药的潜力。
吴佩阳[5]（2020）在《miR-382-5P介导信号通路影响铂类耐药卵巢癌细胞敏感性的机制研究》文中认为
左英[6]（2020）在《miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的机制研究》文中研究指明卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,在导致女性死亡的所有肿瘤中排第四位。因发病隐匿,无有效的早期发现指标,发病时多为晚期,卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[1-3]。据2018年统计,全球范围内,新增卵巢癌患者295414例,其中有184799例死亡[4],而我国过去十年卵巢癌发病率上升了 30%。值得注意的是,约75%的患者诊断时已处FIGO的Ⅲ期或Ⅳ期[5]。目前标准的治疗方案为卵巢肿瘤细胞减灭术+以铂类为基础的联合化疗,然而大多数患者会在12-24个月内复发,多死于对化疗药物耐药[6,7]。尽管随着PARP抑制剂的应用,在治疗铂类敏感复发的卵巢癌患者方面,带来了里程碑式的进步,使卵巢癌的治疗有了新的突破[8]。但对于耐药性卵巢癌的治疗仍是目前治疗的难点和研究的热点。因此,探究卵巢癌顺铂耐药的分子机制和克服铂类耐药的难题,对提高卵巢癌患者的生存率有着重要的意义。程序性细胞死亡蛋白受体1（PD-1）作为CD28超家族的主要细胞表面受体,是降低T细胞活化的主要抑制分子之一[9,10]。其主要配体分子PD-L1在抗原呈递细胞上表达,但也在肿瘤细胞上表达[11]。生理状况下,淋巴细胞表面的PD-1可以与其配体PD-L1相结合抑制淋巴细胞功能,从而防止自身免疫损伤[12]。在病理条件下,PD-1/PD-L1信号通路会被激活,肿瘤表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合进而抑制T细胞的活性,从而逃避T细胞的杀伤,导致肿瘤免疫逃逸。临床研究发现PD-L1的高表达与恶性肿瘤的不良预后有关[13-15]。PD-L1高表达的患者预后明显差于低表达的患者[16]。铂处理可以在非小细胞肺癌细胞中上调PD-L1的表达,而敲低PD-L1可以明显增加非小细胞肺癌细胞对顺铂敏感性[17]。此外,已有文献报道PD-L1的过表达与卵巢癌患者的预后差相关[18]。然而,目前尚无文献报道研究PD-L1在卵巢癌顺铂耐药中的作用及具体机制。MicroRNA（miRNA）是一类大小为20-25个的非编码小RNA分子,可通过沉默或降解其靶点mRNA分子调控基因表达,在多种病理过程扮演重要角色,可与多种靶信使mRNAs的3’UTR相互作用,进而在转录后水平调控基因表达[19]。近年来,随着对肿瘤耐药研究的深入,miRNA参与肿瘤耐药的机制受到研究人员的广泛关注[20,21]。miR-34a-5p被报道在多种肿瘤组织异常表达,参与肿瘤进展,如在人上皮性卵巢癌中被下调[22];在成人神经管细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌细胞中上调miR-34a-5p可以增加顺铂敏感性[23-25]。PD-L1在非小细胞肺癌和急性髓细胞白血病中被证明是miR-34a-5p的靶基因,过表达miR-34a-5p有效负性调控PD-L1的表达[26,27]。卵巢癌中miR-34a-5p是否通过影响PD-L1的表达参与调控卵巢癌对顺铂敏感性,目前尚无报道,有待进一步证实。本研究以此为切入点,从以下三个方面进行研究。第一部分通过临床组织标本及卵巢癌细胞实验检测PD-L1在化疗耐药卵巢组织和耐药细胞中高表达,得到其参与调控卵巢癌顺铂耐药。第二部分在顺铂耐药卵巢癌细胞中,检测发现miR-34a-5p表达降低,过表达miR-34a-5p能有效抑制PD-L1的表达,增加细胞对顺铂的敏感性,双荧光素酶报告基因实验证实两者存在靶向调控关系。第三部分通过裸鼠成瘤体内实验进一步验证,沉默miR-34a-5p能显着促进肿瘤体内生长,使PD-L1的表达升高,得出miR-34a-5p负性调控PD-L1的表达。第一部分PD-L1在卵巢癌组织表达及其在卵巢癌顺铂耐药细胞中的作用研究目的:检测PD-L1在卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及耐药卵巢癌组织中的表达差异,以及在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药卵巢癌细胞（SKOV3/DDP、A2780/DDP）的表达差异;并探讨PD-L1的表达对细胞增殖、周期和凋亡及化疗敏感性的影响。研究方法:1.收集卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及化疗耐药卵巢癌的组织的病理切片及临床资料为研究对象,采用免疫组化检测PD-L1蛋白表达水平,RT-qPCR检测卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及化疗耐药卵巢癌的组织中PD-L1 mRNA表达水平,分析PD-L1在化疗敏感卵巢癌患者和化疗耐药卵巢癌患者中表达差异,并探讨其临床意义。2.选取卵巢癌细胞株SKOV3、A2780,通过连续梯度增加顺铂（DDP）浓度培养,构建卵巢癌DDP耐药细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）。使用不同浓度DDP处理,MTT实验检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和DDP耐药细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）的增殖活力并计算IC50值。3.分别采用RT-qPCR和Western blot检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和DDP耐药细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）中PD-L1表达水平。4.构建shRNA-PD-L1质粒并转染细胞,检测敲降PD-L1后DDP耐药细胞的生物学性能。使用含不同浓度DDP培养,MTT实验检测PD-L1敲降后细胞的增殖活力;流式细胞术测定细胞周期的变化和凋亡率的改变。5.Western blot检测PD-L1敲降后与细胞周期、凋亡和耐药等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.PD-L1在卵巢肿瘤组织的表达水平:免疫组化结果显示,PD-L1在耐药卵巢癌组织中的表达量明显高于化疗敏感组和卵巢良性肿瘤组。RT-qPCR检测结果表明,与卵巢良性肿瘤组织相比,PD-L1 mRNA在化疗敏感卵巢癌组织和化疗耐药卵巢癌组织中均表达上调,其中化疗耐药卵巢癌组织中PD-L1的表达量高于化疗敏感卵巢癌组织。这提示,PD-L1在癌组织高表达可能参与卵巢癌耐药。2.本研究成功建立了顺铂（DDP）耐药卵巢癌细胞株（SKOV3/DDP、A2780/DDP）。MTT检测结果显示,顺铂耐药细胞株的增殖活力高于亲本株,且IC50值较亲本株也增高。3.RT-qPCR和Western blot检测结果均表明在DDP耐药卵巢癌细胞中PD-L1表达上调。4.敲降PD-L1对耐药细胞SKOV3/DDP、A2780/DDP的影响:转染shRNA-PD-L1显着抑制了耐药卵巢癌细胞对DDP的耐药,相同浓度的DDP作用下,降低了 DDP耐药细胞株的增殖活力,也降低了耐药细胞株的IC50值,促进了G1期细胞周期阻滞,提高了耐药细胞株的凋亡率。5.Western blot检测显示,在DDP存在的情况下,敲降PD-L1后降低了耐药细胞中多药耐药蛋白1（MDR1）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达水平,并显着增加了 cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白在耐药细胞中的表达。研究结论:PD-L1在卵巢癌耐药患者组织和SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞中高表达,参与调控SKOV3/DDP、A2780/DDP对顺铂的耐药。第二部分miR-34a-5p通过靶向PD-L1调控卵巢癌细胞耐药作用研究目的:探讨miR-34a-5p与PD-L1的靶向关系,研究miR-34a-5p通过调控PD-L1表达影响SKOV3/DDP、A2780/DDP对DDP耐药的作用机制。研究方法:1.采用RT-qPCR检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP 中 miR-34a-5p 的表达水平。2.构建 miR-34a-5p mimic 和 miR-34a-5p inhibitor 表达质粒,分别转染到SKOV3/DDP、A2780/DDP 细胞和 SKOV3、A2780 细胞使 miR-34a-5p 过表达或沉默,RT-qPCR检测miR-34a-5p验证转染效率,分别采用RT-qPCR及Western blot检测PD-L1表达水平变化。3.构建PD-L1 mRNA3’-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其点突变质粒,分别与miR-34a-5p mimc混合共转染293T细胞检测荧光素酶活性变化验证miR-34a-5p与PD-L1靶向调控关系。4.将miR-34a-5p mimic和PD-L1过表达载体分别转染或共转染SKOV3/DDP细胞形成不同处理的SKOV3/DDP细胞,使用DDP培养后,MTT实验检测各组细胞的增殖活力;PI染色后Flow cytometry测定细胞周期的变化和Annexin V-FITC/PI试剂盒染色后Flow cytometry测定凋亡率的改变。5.将miR-34a-5p mimic和PD-L1过表达载体分别转染或共转染SKOV3/DDP细胞形成不同处理的SKOV3/DDP细胞,使用DDP培养,Western blot检测PD-L1及耐药基因（MDR1）、细胞周期蛋白（Cyclin D1）和凋亡（cleaved-caspase-3和cleaved-PARP）蛋白的表达水平。研究结果:1.与 SKOV3、A2780 细胞相比,miR-34a-5p 在 SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞中显着低表达。2.RT-qPCR及Western blot检测结果均显示,当在细胞中转染miR-34a-5p mimic时,PD-L1表达降低;当转染miR-34a-5p inhibitor时,PD-L1表达升高,差异均具有统计学意义。3.双荧光报告基因实验结果显示PD-L1是miR-34a-5p的靶基因,miR-34a-5p靶向负性调控PD-L1的表达。4.MTT检测结果显示,过表达miR-34a-5p mimic降低了 DDP培养的SKOV3/DDP细胞增殖活力,IC50值降低;同时过表达PD-L1逆转miR-34a-5p mimic对SKOV3/DDP细胞增殖的抑制作用,且IC50值也显着升高。5.流式细胞术检测细胞周期,结果显示过表达miR-34a-5p抑制DDP培养的SKOV3/DDP细胞周期,G1期细胞百分率增多,S期和G2期细胞百分率相应的减少;同时过表达PD-L1逆转miR-34a-5p mimic对细胞周期的抑制作用,使G1期细胞百分率降低,S期和G2期细胞百分率增加。6.流式细胞术检测细胞的凋亡,结果显示,过表达miR-34a-5p促进DDP培养的SKOV3/DDP细胞凋亡,同时过表达PD-L1逆转细胞的凋亡,使凋亡率下降。7.Western blot 检测结果表明 MDR1、Cyclin D1 表达降低,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达升高;同时过表达PD-L1逆转了 miR-34a-5p mimic对细胞凋亡的诱导作用及对 MDR1、Cyclin D1、cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP的蛋白水平的调控作用。研究结论:miR-34a-5p通过靶向下调PD-L1逆转了 SKOV3/DDP对顺铂的耐药。第三部分miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的体内实验研究研究目的:通过体内实验,探讨miR-34a-5p靶向下调PD-L1增强SKOV3/DDP对DDP敏感性作用机制。研究方法:1.构建miR-34a-5p稳定过表达或表达沉默质粒,转染SKOV3/DDP细胞,RT-qPCR检测miR-34a-5p表达验证转染效率,Western blot检测转染后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达水平。2.选取4周龄健康的BALB/c裸鼠,将裸鼠分为5组,每组10只。将转染后的各组SKOV3/DDP细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝皮下组织,建立裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤体积,注射细胞量为1×106个,观察并测量肿瘤生长情况。3.当肿瘤达到一定体积时（50 mm3）,以2.0 mg/kg顺铂腹腔内注射4周,每3天注射一次,从注射顺铂开始后,第6天开始测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。实验裸鼠处死后,检测裸鼠成瘤体积大小、重量。4.提取每组裸鼠肿瘤组织,采用TUNEL法染色检测细胞凋亡水平,RT-qPCR法检测miR-34a-5p和PD-L1 mRNA的表达,Western blot法检测PD-L1以及与细胞周期、凋亡和耐药等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.成功建立miR-34a-5p稳定过表达或表达沉默SKOV3/DDP细胞,Western blot检测转染后各组细胞,过表达miR-34a-5p后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达下调,沉默miR-34a-5p后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达上调。2.构建裸鼠卵巢癌移植瘤模型,裸鼠成瘤实验结果表明,与其他4组相比,过表达miR-34a-5p后增加移植瘤对DDP的敏感性,肿瘤生长速度降低,体积减少,质量减轻。miR-34a-5p表达沉默促进肿瘤体内生长,增强对DDP的耐药性。3.TUNEL染色结果也表明,过表达miR-34a-5p显着促进了移植瘤组织细胞的凋亡。但沉默miR-34a-5p的效果与此相反。4.过表达miR-34a-5p显着降低了裸鼠肿瘤组织中PD-L1、MDR1、CyclinD1和Bc12的表达,并促进了 Bax、cytochrome C的表达。而miR-34a-5p表达沉默移植瘤组织 PD-L1、MDR1、CyclinD1 和 Bcl2 的表达升高,Bax、cytochrome C的表达降低。研究结论:miR-34a-5p通过靶向沉默PD-L1增强裸鼠卵巢癌皮下移植肿瘤对顺铂的敏感性。本文的创新点1.本研究发现PD-L1在耐药卵巢癌患者组织标本中表达上调,与卵巢癌化疗耐药相关。2.通过卵巢癌耐药细胞和动物模型实验,证实miR-34a-5p可逆转卵巢癌耐药。3.miR-34a-5p靶向负性调控PD-L1,miR-34a-5p/PD-L1分子轴可作为卵巢癌顺铂耐药临床治疗的潜在靶标。
吴佩阳[7]（2020）在《miR-382-5P介导信号通路影响铂类耐药卵巢癌细胞敏感性的机制研究》文中研究指明1基于生物学信息分析miR-382-5P在卵巢癌中的表达及临床意义目的:探究miR-382-5P在卵巢癌组织的表达情况、潜在功能及临床意义。方法:利用NCBI、miRBase、UCSC等数据库查找miR-382-5P基本信息。利用NCBI数据库检索miR-382-5P相关文献。利用miRPath DB、DIANA、miRWalk、star Base等4个靶基因预测软件预测miR-382-5P靶基因,利用c Bio Portal数据库查询HIPK3相关基因,并通过DAVID在线软件进行KEGG信号通路富集及GO功能注释。通过TCGA数据库下载卵巢癌miRSeq相关数据及其临床数据。收集广西医科大学附属肿瘤医院在2001年8月22日至2012年12月24日期间经手术治疗的72例卵巢癌组织标本,其中敏感组织42例,耐药组织30例,采用QRT-PCR检测其miR-382-5p表达水平,采用卡方检验分析其表达水平与临床病理参数之间相关性、Kaplan-Meier分析预后、Cox比例风险模型评估独立危险因素。结果:miR-382-5p的表达量具有组织特异性。miRPath DB、DIANA、miRWalk、star Base等4个靶基因预测软件同时预测的靶基因有24个（AHRR、ANKS1A、C15orf41、CABYR、CASP3、COBLL1、EEF2K、FBXO28、FGFR1OP、LRP12、MDM4、PAIP2、PARM1、PDE5A、PIAS2、SAR1B、SCD、SLC44A1、TIMM17A、TSPYL1、UBXN7、YES1、ZBTB37、ZNF587）,miR-382-5P靶基因功能显着富集于生物过程、细胞组成、分子功能等,信号传导通路显着富集于癌症中的micro RNAs、乙型肝炎病毒、MAPK通路、非小细胞肺癌、Fox O通路、凋亡、结直肠癌、催产素等通路。HIPK3相关基因显着富集于调节干细胞多功能性信号传导通路、血小板激活及Ras信号传导通路中。TCGA数据库数据分析未提示卵巢癌miR-382-5P表达水平与其临床病理参数存在相关性,差异不具备统计学意义（P>0.05）。QRT-PCR检测本院72例卵巢癌临床组织标本的结果表明:miR-382-5p在卵巢癌耐药组织中明显上调（4.60±2.959）,而在敏感组织中明显下调（1.88±2.082）,差异具备统计学意义（P<0.05）。分析本院72例卵巢癌患者随访资料得知:卵巢癌患者体内的miR-382-5p表达水平与其耐药程度存在相关性,差异不具备统计学意义（P<0.05）。卵巢癌患者的miR-382-5P表达水平、耐药情况、复发情况及治疗反应等因素与其总生存期（OS）存在相关性,差异具有统计学意义（P<0.05）。卵巢癌患者的miR-382-5P表达水平、耐药情况、治疗反应、复发情况、残留病灶大小等因素与其无进展生存期（PFS）存在相关性,差异具有统计学意义（P<0.05）。耐药因素是影响卵巢癌预后的独立危险因素,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:经综合分析发现,miR-382-5P有望成为治疗多药耐药的卵巢癌患者的新型靶点,MAPK通路、Fox O通路、凋亡等信号传导通路可能为miR-382-5P介导卵巢癌发生、发展的主要机制,为开展靶向miR-382-5P治疗耐药卵巢癌的研究奠定一定基础。2基于生物信息学分析卵巢上皮癌HIPK3基因的表达及意义目的:探究HIPK3基因在卵巢上皮癌组织的表达情况、潜在功能及临床意义。方法:利用NCBI数据库检索HIPK3相关文献。通过TCGA数据库下载卵巢癌m RNA-Seq相关数据及其临床数据。利用DAVID及Metascape数据库进行功能分析。利用Oncomine数据库及HPA数据库查询HIPK3在卵巢癌组织和正常组织中的差异表达。利用String数据库查询HIPK3的互作蛋白。利用c Bio Portal数据库查询TCGA数据库数据表明HIPK3在卵巢癌中的共表达基因。利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析HIPK3与卵巢癌患者预后的相关性。采用卡方检验分析其表达水平与临床病理参数之间相关性、Kaplan-Meier分析预后、Cox比例风险模型评估独立危险因素。结果:HIPK3表达水平与卵巢癌肿瘤直径大小呈正相关,差异具有统计学意义,而与其年龄、单双侧、组织学分级、figo分期、残留病灶、淋巴结转移、治疗反应、存活状态、耐药情况等因素之间不存在相关性,差异不具备统计学意义。Oncomine数据库及HPA数据库结果均表明HIPK3在卵巢癌组织中相较于正常组织为表达程度为中等。Kaplan-Meier Plotter在线数据库表明HIPK3水平与卵巢癌患者PFS呈负相关。HIPK3上调的差异基因有125个,下调的差异基因有442个。HIPK3共表达基因富集于调节干细胞多功能性信号传导通路、血小板激活及Ras信号传导通路中。HIPK3不是影响卵巢预后的独立危险因素（P>0.05）。结论:HIPK3与卵巢癌患者的预后具有相关性,但并非其独立危险因素,同时HIPK3可能通过调节Ras信号传导通路而调控其耐药性。3 miR-382-5P靶向HIPK3介导Ras通路调控卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性目的:探索miR-382-5P是否通过靶向HIPK3介导Ras通路调控卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性。方法:Western Blotting检测miR-382-5P敲低影响卵巢癌耐药细胞中Ras蛋白的表达情况;Western Blotting检测不同顺铂浓度作用24小时后,miR-382-5P敲低影响卵巢癌耐药细胞内Ras信号通路中各信号分子的表达情况;Western Blotting检测HIPK3过表达影响卵巢癌耐药细胞中Ras信号通路的表达情况;CCK8法检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的IC50值;CCK8法检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的增殖情况;平板克隆形成实验检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的克隆能力;划痕实验检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的迁移能力;Transwll法检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的侵袭能力;流式细胞仪检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的凋亡情况。结果:Western Blotting结果表明SKOV3-DDPII-miR-382-5P inhibitor细胞中Ras、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、C-RAF、p-C-RAF蛋白表达上调;Western Blotting结果表明SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3各组细胞中Ras信号通路各信号分子的表达情况无明显差异;CCK8法结果表明SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492、SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3各组细胞的IC50值无明显差异;CCK8法结果表明SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3组的增殖能力较SKOV3-DDPII组及SKOV3-DDPII-GV492组;划痕实验结果表明SKOV3-DDPIIGV492-HIPK3组迁移能力较SKOV3-DDPII组及SKOV3-DDPII-GV492组减弱;Transwell法结果表明SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3组侵袭能力较SKOV3-DDPII组及SKOV3-DDPII-GV492组减弱;平板克隆形成实验检测结果表明SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞的克隆能力较SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492强;流式细胞仪检测结果表明SKOV3-DDPIIGV492-HIPK3组凋亡情况较SKOV3-DDPII-GV492组减弱。结论:miR-382-5P敲低可影响卵巢癌耐药细胞中Ras信号通路的表达情况,但并非其调控卵巢癌耐药细胞对顺铂敏感性的机制;HIPK3有助于促进卵巢癌耐药细胞增殖、克隆,抑制其迁移、侵袭及凋亡等生物过程的发生,但不参与调控卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性。因此,我们仍需从其他方向探究miR-382-5P调控卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性的机制。4 miR-382-5P与MTAP基因3’-UTR的靶向验证目的:验证miR-382-5P与MTAP基因3’-UTR是否存在靶向关系。方法:Western Blotting验证miR-382-5P与MTAP基因是否存在调控关系;通过生物信息学软件查询miR-382-5P与MTAP的靶向结合位点;采用化学合成法合成MTAP序列,并将其克隆到GV272载体,构建MTAP野生型和突变型双荧光素酶报告质粒,将miRNA-NC+NC、miR-382+NC、miRNA-NC+MTAP-3UTR、miR-382+MTAP-3UTR、miRNA-NC+MTAP-3UTR-mut、miR-382+MTAP-3UTR-mut、阳参3UTR+miRNA-NC、阳参miRNA+阳参3UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞,检测各组的荧光素酶活性变化。结果:Western Blotting结果表明miR-382-5P与MTAP存在负性调控关系;酶切及测序结果表明野生型GV272-MTAP-3’-UTR-wt及突变型GV272-MTAP-3’-UTR-mut双荧光素酶报告载体构建成功;双荧光素酶结果表明相对于对照组,miR-382-5P使野生型GV272-MTAP-3’-UTR-wt活性降低,差异具有统计学意义。结论:成功构建了MTAP基因3’-UTR双荧光素酶报告载体,miR-382-5P与MTAP 3’-UTR存在靶向关系,表明miR-382-5P对MTAP的调控是直接调控。
韩娜[8]（2020）在《RASSF1A、WT-1蛋白的表达与复发性上皮性卵巢癌的关系》文中指出目的 探讨RASSF1A及WT-1蛋白的表达与复发性上皮性卵巢癌的关系。方法 收集2013年01月至2018年12月就诊于华北理工大学附属医院妇产科经病理学确诊的上皮性卵巢癌患者,剔除未行手术治疗及失访者,分为复发组、未复发组。采用免疫组化法检测RAS同源家族1A（RASSF1A）、肾母细胞瘤基因（WT-1）在上皮性卵巢癌组织中的表达,分析两种蛋白与复发性上皮性卵巢癌的关系。正态分布的计量资料以“均数±标准差”表示,组间均数比较采用t检验。非正态分布的计量资料以“中位数（四分位数间距）”表示,组间中位数比较采用非参数检验。计数资料计算百分率,组间率比较用卡方检验,不符合卡方检验条件的采用Fisher确切概率法。多因素分析采用二元多因素Logistic回归模型。组间一致性分析用Kappa检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果 1 RASSF1A及WT-1蛋白表达与复发性上皮性卵巢癌的关系分析发现,RASSF1A蛋白在复发组阳性表达率低于未复发组,差异有统计学意义（P<0.05）,RASSF1A表达阳性的上皮性卵巢癌患者复发风险是RASSF1A阴性表达的0.239倍;WT-1蛋白在复发组阳性表达率高于未复发组,差异有统计学意义（P<0.05）,WT-1表达阳性的上皮性卵巢癌患者复发的风险是WT-1阴性表达的3.852倍;RASSF1A及WT-1蛋白的表达与复发性上皮性卵巢癌的关系有统计学意义（P<0.05）,与复发有关。2 RASSF1A及WT-1蛋白表达与复发性上皮性卵巢癌临床病理特征的关系分析发现,在复发组中,RASSF1A蛋白在浆液性癌中阳性表达率均低于其他病理类型,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;在Ⅰ-Ⅱ期中阳性表达率高于Ⅲ-Ⅳ期,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在低-中分化中阳性表达低于高分化,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在R1组中阳性表达率低于>R1组,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;在伴有腹水中阳性表达率低于不伴有腹水者,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在伴有淋巴结转移者阳性表达率低于不伴有转移者,两组比较差异无统计学意义（p＞0.05）;RASSFlA蛋白阳性表达的复发时间短于阴性表达,两组比较无统计学意义（P>0.05）。在复发组中,WT-1蛋白在浆液性癌中阳性表达率高于其他病理类型,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在Ⅰ-Ⅲ期阳性表达率低于Ⅲ-Ⅳ期,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在低-中分化中的阳性表达率高于高分化组,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;在R1组中阳性表达率低于>R1组,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;在伴有腹水中阳性表达率高于不伴有腹水者,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;在伴有淋巴结转移中阳性表达率高于不伴有淋巴结转移者,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;WT-1蛋白阳性表达的复发时间长于阴性表达,两组比较无统计学意义（P＞0.05）。3 RASSF1A及WT-1蛋白表达与铂敏感/铂耐药复发的关系分析发现,RASSF1A蛋白在铂敏感分组中阳性表达率低于在铂耐药分组中阳性表达,两组比较差异统计学无意义（P>0.05）;WT-1蛋白在铂敏感分组中阳性表达率高于铂耐药组,两组比较差异无统计学意义（P>0.05）;RASSF1A及WT-1蛋白的阳性表达与铂敏感/铂耐药复发的关系无统计学意义（P>0.05）,与铂耐药复发无关。结论 1在复发性上皮性卵巢癌中WT-1阳性表达明显升高,RASSF1A阳性表达明显降低。2在复发性上皮性卵巢癌中RASSF1A和与临床分期、组织学分化、腹水有关,WT-1表达与病理类型、临床分期、腹水及淋巴结转移有关。3手术彻底性与上皮性卵巢癌的铂耐药复发有关。4本课题尚未发现RASSF1A及WT-1表达与铂耐药复发有关。图2幅;表17个;参183篇。
杨宏毅[9]（2020）在《TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制》文中提出研究背景卵巢癌作为妇科生殖系统三大恶性肿瘤之一,临床起病隐匿,缺乏有效早期诊断指标,容易复发和转移,化疗极易产生耐药性,而放疗大多不敏感,预后差。因此,深入研究卵巢癌发生发展的分子机理,对于寻找有效早期诊断指标、预后判断指标和基因靶向治疗具有重大指导意义。端锚聚合酶（tankyrase,TNKS）属于聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）蛋白家族,可与端粒酶重复绑定序列结合。人类TNKS1基因在第8号染色体p23.1上,作为调控端粒长度的关键因子在多种疾病中发挥重要作用,与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切,与卵巢癌的关系尚不清楚。Wnt/β-catenin信号传导通路在恶性肿瘤的发生和发展中起重要作用,同时研究证实TNKS对Wnt信号通路进行正调控。本文率先系统地研究了 TNKS1通过调控Wnt/β-catenin信号传导通路来影响卵巢癌发生发展的相关机制。研究目的本研究从临床样本、细胞水平、动物模型以及分子机制层面,系统立体研究TNKS1在卵巢癌发生发展中的作用及机制,为卵巢癌诊疗提供理论依据。研究材料和方法1.采用q-PCR、免疫组化和Western blot技术研究TNKS1在卵巢癌组织中的表达。2.采用MTS法、细胞集落形成、裸鼠皮下移植瘤实验研究TNKS1对卵巢癌细胞增殖与成瘤的影响。3.采用MTS法和凋亡实验研究TNKS1表达改变对卵巢癌细胞药物敏感性的影响。4.采用细胞划痕实验和Transwell转移小室实验研究TNKS1在卵巢癌迁移与侵袭中的作用。5.采用葡萄糖摄取、乳酸分泌、ATP生成以及线粒体氧耗率研究TNKS1在卵巢癌细胞有氧糖酵解中的作用。6.采用Western blot技术及细胞转染法研究TNKS1参与卵巢癌发生发展的分子调控机制。7.应用SPSS 21.0进行统计分析,实验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.TNKS1在卵巢癌组织中的表达高于癌旁组织及正常卵巢组织,且与卵巢癌患者的病理分级和肿瘤大小密切相关。2.敲低或抑制TNKS1显着抑制卵巢癌细胞增殖、细胞集落形成、体内成瘤及细胞周期进展,并有效提高卵巢癌细胞对常用化疗药物敏感性,显着抑制其迁移和侵袭能力;同时通过降低丙酮酸羧化酶表达降低卵巢癌细胞的糖代谢,提高线粒体耗氧率。3.敲低或抑制TNKS1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而下调Snail、PC、CyclinD、MDR、MMP-9 等 Wnt/β-catenin 信号通路靶蛋白的表达。TNKS1、Snail和PC在临床卵巢癌组织中表达两两之间呈正相关。结论TNKS1在卵巢癌组织中高表达,具有一定的临床意义。TNKS1可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路活性进而促进卵巢癌生长与成瘤、迁移与侵袭和降低药物敏感性;并通过β-catenin/Snail/PC信号轴促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解。TNKS1在卵巢癌发生发展中发挥重要作用,可作为卵巢癌潜在的早期诊断指标、判断预后指标或靶向基因治疗靶点。
蔡艳[10]（2020）在《卵巢癌细胞系OVCAR4生物学特性研究及CDC50A作为卵巢癌干细胞标记蛋白的验证》文中提出背景卵巢癌（0C）是女性生殖系统中死亡率最高的恶性肿瘤[1],在理想肿瘤细胞减灭术的基础上辅助铂类为基础的化疗是目前规范化的治疗策略。但是,晚期卵巢癌的生存率仅有29%[2]。肿瘤的反复复发导致的其对于铂类药物产生耐药性是卵巢癌生存率得不到进一步改善的主要原因之一[3]。卵巢上皮性癌（EOC）是一组具有多种组织学类型的高度异质性肿瘤[4],占卵巢恶性肿瘤的95%,在组织学类型上主要分为浆液性癌、粘液性癌、透明细胞癌、子宫内膜样癌等[4]。其中高级别浆液性癌（HGSOC）约占60%-70%,侵袭性强,疾病进展迅速,是一类最能体现卵巢癌的生物学特性和临床特征的组织学类型,从而成为有关卵巢癌基础与临床研究的核心类型[5]。自1951年人宫颈癌细胞系Hela[6]建立的60余年来,细胞培养及建系已成为肿瘤研究的重要手段,其使用极大地促进了人类对肿瘤生物学的理解[7]。细胞系的优势是可以提供一个相对同质性的细胞群,且能无限制复制及传代。体外细胞系和细胞系的异种移植模型也成为研究卵巢癌的重要方法[8]。2011年,采用二代测序的方法,The Cancer Genome Atlas（TCGA）中描述了各种肿瘤的基因组和表达图谱[9]。2012 年,The Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）详细的描述了约1000个肿瘤细胞系的起源及基因图谱[7]。在此基础上,Domcke等分析了 47种卵巢癌细胞系及卵巢癌肿瘤组织的DNA拷贝数改变（CNAs）、突变类型和mRNA表达水平,并将重点放在HGSOC上,寻找最适合作为体外模型的卵巢癌细胞系[10]。目前在体外实验中最常采用的HGSOC细胞系主要包括SKOV3、A2780、IGROV1、OVCAR3、CAOV3 等。其中,SKOV3 和 A2780 为 p53 野生型,均具有KRAS基因突变,表明这两株可能为低级别的卵巢上皮癌。IGROV1细胞系被发现为MLH1、MSH3和MSH6基因突变,是Lynch综合征中常见的突变基因,其起源及基因组均具有子宫内膜样癌的特征。OVCAR3和CAOV3都有p53突变和较高的CNAs值,但其CNAs和TCGA中HGSOC组织的相关性较低。Domcke等推荐了一些能更好的模拟HGSOC基因组特征、但在既往研究中较少用到的细胞系,包括KURAMOCHI和OVCAR4等。其中OVCAR4具有p53突变,CNAs与HGSOC的组织相关性强,在关键癌基因和肿瘤抑制因子中具有低的突变频率,被认为能较好的代表HGSOC细胞系。该研究改变了人们对HGSOC细胞系的认知,并且得到了之后多项研究的验证和支持[11-14]。随着肿瘤研究的进展,肿瘤干细胞（CSCs）理论于上世纪70年代左右被提出[15]。CSCs被认为是存在于肿瘤细胞中的一小群具有干细胞自我更新及分化能力的细胞,在肿瘤中长期处于静息状态,可逃避化疗药物的作用,介导肿瘤的耐药及复发[16]]。近年来针对CSCs表面特异性标志蛋白的单克隆抗体成为肿瘤治疗领域的热点[17]。研究发现,通过单克隆抗体靶向杀伤CSCs,再配合手术、放化疗等常规抗肿瘤治疗,可达到治愈肿瘤的目的。卵巢上皮性癌最突出的特点为复发及耐药,这高度提示肿瘤中可能存在CSCs细胞[[18],因此,如何通过细胞表面特异性标志蛋白识别其中的干细胞进而靶向杀灭,成为卵巢上皮性癌治疗的关键。本课题组长期致力于卵巢癌干细胞表面标志蛋白的研究,先后两次受国家自然科学基金资助,通过定量蛋白组学技术对卵巢上皮癌的侧群细胞（SP）和非SP细胞膜蛋白进行比较蛋白组学分析,从而筛选出卵巢癌干细胞表面标志物候选蛋白—CDC50A,进一步通过体内体外实验充分证实了 CDC50A可作为卵巢癌干细胞表面标志蛋白。本课题组在前期体外研究中以文献中最常用的SKOV3细胞系为主,现为进一步研究CDC50A在HGSOC中的表达及干性特征,本论文选取了具有HGSOC基因组特征的细胞系OVCAR4为研究对象,比较其与SKOV3细胞系在生物学特性上的差异;通过活体成像技术监测OVCAR4细胞系NSG小鼠腹腔及卵巢原位成瘤过程,建立理想的模拟HGSOC腹腔内播散种植转移的动物模型;进一步验证OVCAR4细胞系中CDC50A+细胞的干细胞特性,并在OVCAR4和SKOV3两种细胞系中初步探讨CDC50A作为卵巢上皮性癌干细胞治疗靶点的可行性。方法1.OVCAR4细胞系和SKOV3细胞系的生物学特性比较。采用瑞氏吉姆萨染色比较OVCAR4和SKOV3细胞系形态;七天法细胞计数绘制两种细胞系的生长曲线;流式细胞检测法检测两种细胞系的细胞生长周期分布;CCK-8法比较两种细胞系的顺铂半数抑制率（IC50）;免疫组化方式检测两种细胞系p53表达情况;建立OVCAR4及SKOV3细胞系裸鼠皮下移植瘤模型,比较两种细胞系皮下致瘤能力,免疫组化法观察移植瘤石蜡切片p53抗体染色情况。2.卵巢癌细胞系OVCAR4小鼠腹腔及卵巢原位成瘤模型的建立及动态观察。慢病毒转染技术建立OVCAR4-Luciferase细胞系,嘌呤霉素筛选稳定表达Luciferase的OVCAR4细胞,监测其细胞形态与群体倍增时间等均与OVCAR4细胞系无差异;取4-6周龄雌性NSG小鼠,OVCAR4-Luciferase细胞1× 107/100 ul/只腹腔注射法注入小鼠腹腔内,共3只;于小鼠背部解剖右卵巢,OVCAR4-Luciferase细胞5×106/40 μl/只显微注射法注入右卵巢,共5只;定期麻醉小鼠,腹腔注射底物D-Luciferin,通过活体成像仪检测荧光信号,在活体状态下连续观察成瘤情况,适时解剖小鼠,监测成瘤情况。3.CDC50A作为上皮性卵巢癌干细胞标记蛋白的体外验证。流式细胞仪分析OVCAR4细胞系贴壁生长细胞中CDC50A+细胞的比例;流式细胞仪分选OVCAR4细胞系中CDC50A+及CDC50A-细胞,qPCR法比较两种细胞CDC50A基因的表达水平;流式细胞仪分选OVCAR4细胞系中CDC50A+及CDC50A-细胞,无血清悬浮培养法比较两种细胞sphere形成能力;OVCAR4细胞系采用无血清悬浮培养的方法,形成sphere,流式细胞学方法检测OVCAR4 sphere对CDC50A的富集作用;流式细胞仪分别分选SKOV3及OVCAR4细胞系CDC50A+细胞,于悬浮培养基中悬浮培养,定期于细胞培养基中加入CDC50A抗体、同型对照Ig-G、PBS,同时设空白组,比较各组细胞sphere形成情况;流式细胞仪分选OVCAR4细胞系CDC50A+及CDC50A-细胞,不同浓度的顺铂处理后,CCK-8法比较不同细胞在OD450nm处的吸光度,比较CDC50A+及CDC50A-的顺铂耐药性。结果1.OVCAR4细胞在光镜下呈多边形状,核仁明显,细胞异型性明显,小团细胞聚集呈簇状生长,并与SKOV3细胞形态形成鲜明对比,SKOV3细胞呈梭形,树突状凸起,细胞大多散在分布,细胞核大、深染,胞质较均匀;SKOV3细胞系的群体倍增时间（PDT）比OVCAR4细胞系明显缩短,细胞生长快,同样时间下细胞生长数量多于OVCAR4;OVCAR4细胞系中G0/G1期所占比例较SKOV3细胞系稍低,但OVCAR4细胞系S期细胞所占比例明显高于SKOV3细胞系;OVCAR4细胞系的顺铂IC50明显低于SKOV3细胞系,OVCAR4对顺铂的反应更敏感;p53抗体在OVCAR4细胞系细胞核染色强阳性,而SKOV3细胞系染色阴性;两组细胞系裸鼠皮下移植瘤模型均可见移植瘤形成,解剖裸鼠,肿瘤均限于接种部位,SKOV3组移植瘤重量明显高于OVCAR4组,差异有统计学意义（P<0.05）,OVCAR4皮下移植瘤组织p53染色强阳性,而SKOV3细胞系皮下移植瘤组织p53染色阴性。2.建立了稳定的OVCAR4-Luciferase细胞系,顺利的构建了OVCAR4细胞系NSG小鼠腹腔及卵巢原位移植瘤模型,10天后均可于活体成像仪下检测到荧光信号,定期监测肿瘤信号增长良好,适时牺牲小鼠解剖后并未见到腹腔内有大块样肿瘤形成,腹腔组3只小鼠及卵巢原位组5只小鼠腹腔内均可见少许腹水,3/3只小鼠腹腔网膜及肠系膜根部可以见到粟粒样的肿瘤组织形成,3/5只小鼠右侧卵巢形成移植瘤,均为单侧,5/5只左侧卵巢外观均正常,网膜及肠系膜根部肉眼未见到肿瘤组织形成。3.流式细胞仪检测发现OVCAR4细胞系中CDC50A+细胞群所占比例为1.03%,符合干细胞比例要求;qPCR结果显示流式细胞仪分选的OVCAR-CDC50A+细胞中CDC50A基因的表达水平明显高于分选的OVCAR-CDC50A-细胞,进一步验证了CDC50A抗体的特异性和分选样本的正确性;OVCAR-CDC50A+细胞sphere形成能力明显高于OVCAR-CDC50A-,差异有统计学意义（P<0.01）;无血清悬浮培养出OVCAR4 sphere,流式分析验证CDC50A+细胞在OVCAR4 sphere中所占的比例显着高于贴壁OVCAR4细胞;悬浮培养基中培养的流式分选出的OVCAR4-CDC50A+细胞及SKOV3-CDC50A+细胞中,CDC50A抗体组中sphere形成数量明显低于Ig-G组、PBS组及空白组,差异有统计学意义（P<0.01）,后三组间sphere形成数量无明显差异;经3、6、9ug/ml不同浓度的顺铂处理后,6、9ug/ml顺铂作用下的OVCAR4-CDC50A-细胞活性显着低于OVCAR4-CDC50A+细胞（P<0.05）。结论1.OVCAR4细胞系具有卵巢高级别浆液癌生物学特征。从细胞的生物学特征上看,OVCAR4细胞系的细胞异型性明显,S期细胞所占比例明显高于SKOV3细胞系,对顺铂治疗的反应更敏感;p53抗体在细胞核染色强阳性,具备HGSOC的生物学特征,能很好地进行体外细胞实验。OVCAR4细胞系可以在裸鼠皮下形成移植成瘤,移植瘤石蜡切片p53抗体免疫组化染色强阳性。SKOV3细胞系确实不表达p53蛋白,其可能并不属于HGSOC细胞系。2.成功构建了OVCAR4细胞系NSG小鼠腹腔及卵巢原位成瘤模型,在活体成像系统的动态监测下观察到肿瘤细胞的生长。OVCAR4细胞系腹腔内成瘤形态具有卵巢癌腹腔内播散的生物学特征。3.OVCAR4细胞系中CDC50A+细胞具有肿瘤干细胞特征。CDC50A+细胞在OVCAR4细胞系中所占比例符合干细胞比例,OVCAR-CDC50A+细胞中CDC50A基因的表达水平明显高于分选的OVCAR-CDC50A-细胞。OVCAR4-CDC50A+细胞sphere形成能力明显高于OVCAR-CDC50A-细胞;OVCAR4-sphere中CDC50A+细胞比例明显高于贴壁细胞,sphere具有富集CDC50A+细胞的作用;抗体封闭CDC50A+细胞后,sphere形成能力明显下降;不同浓度的顺铂处理后,OVCAR4-CDC50A-细胞抗顺铂治疗能力显着低于OVCAR4-CDC50A+细胞。深入探讨CDC50A作为卵巢癌对铂类耐药的潜在治疗靶点具有积极意义。
二、卵巢癌组织多药耐药性的临床研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、卵巢癌组织多药耐药性的临床研究（论文提纲范文）
（1）MyD88上调P-gp介导宫颈癌顺铂化疗耐药机制的初步探讨（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 P-糖蛋白与宫颈癌顺铂化疗耐药关系及相关机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）Hsa＿circ＿0000714/miR-370-3p调控RAB17对卵巢癌紫杉醇耐药的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:RAB17 对卵巢癌紫杉醇耐药特性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 慢病毒感染过表达RAB17 |
| 2.3.3 化学合成siRNA干扰降低RAB17 表达 |
| 2.3.4 CCK8 法测定细胞耐药指数 |
| 2.3.5 实时定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.6 克隆形成检测细胞增殖 |
| 2.3.7 流式细胞检测细胞周期 |
| 2.3.8 Western blotting免疫印迹法 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RAB17 在耐紫杉醇卵巢癌细胞A2780/PTX中高表达 |
| 3.2 敲低RAB17 表达对A2780/PTX细胞紫杉醇耐药特性的影响 |
| 3.2.1 A2780/PTX细胞转染siRNA质粒靶向敲低RAB17 的表达 |
| 3.2.2 敲低RAB17 表达细胞紫杉醇耐药指数降低 |
| 3.2.3 敲低RAB17 表达细胞克隆增殖能力减弱 |
| 3.2.4 敲低RAB17 表达细胞周期阻滞在G1期 |
| 3.2.5 敲低RAB17 表达抗凋亡蛋白降低、凋亡和黏附蛋白表达增加 |
| 3.3 过表达RAB17 对A2780 细胞紫杉醇耐药特性的影响 |
| 3.3.1 A2780 细胞转染RAB17 过表达病毒 |
| 3.3.2 过表达RAB17 细胞紫杉醇耐药指数升高 |
| 3.3.3 过表达RAB17 细胞克隆增殖能力增加 |
| 3.3.4 过表达RAB17 加快细胞G1-S期转换 |
| 3.3.5 过表达RAB17 抗凋亡蛋白增加、凋亡和黏附蛋白表达降低 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:Hsa_circ_0000714/miR-370-3p调控RAB17 对卵巢癌紫杉醇耐药特性的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 生物信息学预测 |
| 2.3.3 脂质体转染 |
| 2.3.4 CCK8 法测定细胞耐药指数 |
| 2.3.5 实时定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.6 克隆形成检测细胞增殖 |
| 2.3.7 流式细胞检测细胞周期 |
| 2.3.8 Western blotting免疫印迹法 |
| 2.3.9 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.10 细胞核质分离实验 |
| 2.3.11 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RAB17是miR-370-3p的新靶点 |
| 3.2 MiR-370-3p上调对A2780/PTX细胞紫杉醇耐药特性的影响 |
| 3.2.1 A2780/PTX细胞转染miR-370-3p mimics靶向沉默RAB17 的表达 |
| 3.2.2 转染miR-370-3p mimics细胞紫杉醇耐药指数降低 |
| 3.2.3 转染miR-370-3p mimics细胞克隆增殖能力减弱 |
| 3.2.4 转染miR-370-3p mimics细胞周期阻滞在G1期 |
| 3.3 Hsa_circ_0000714 作为miR-370-3p的分子海绵调控RAB17 表达 |
| 3.3.1 Hsa_circ_0000714在A2780/PTX细胞中显着高表达 |
| 3.3.2 Hsa_circ_0000714 作为miR-370-3p的分子海绵调节靶基因RAB17 表达 |
| 3.4 敲低hsa_circ_0000714 表达对A2780/PTX细胞紫杉醇耐药特性的影响 |
| 3.4.1 A2780/PTX细胞敲低hsa_circ_0000714 靶向沉默RAB17 的表达 |
| 3.4.2 敲低 hsa_circ_0000714 表达细胞紫杉醇耐药指数降低 |
| 3.4.3 敲低hsa_circ_0000714 表达细胞克隆增殖能力减弱 |
| 3.4.4 敲低hsa_circ_0000714 表达细胞周期阻滞在G1期 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:Hsa_circ_0000714/miR-370-3p/RAB17 激活CDK6/RB信号通路影响卵巢癌紫杉醇耐药特性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 慢病毒感染过表达RAB17 |
| 2.3.3 化学合成siRNA干扰降低RAB17 表达 |
| 2.3.4 Western blotting免疫印迹法 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RAB17 部分通过药物泵P-gp蛋白影响卵巢癌紫杉醇耐药 |
| 3.2 RAB17 主要激活CDK6/RB信号通路影响卵巢癌紫杉醇耐药 |
| 3.3 Hsa_circ_0000714/miR-370-3p调控RAB17 通过激活CDK6/RB信号通路影响卵巢癌紫杉醇耐药 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CircRNA-miRNA-mRNA网络在紫杉醇耐药中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）阿帕替尼联合多西他赛治疗转移性卵巢癌疗效、安全性及增效机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 阿帕替尼联合多西他赛对比单药多西他赛治疗转移复发性卵巢癌的疗效及安全性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 阿帕替尼体内水平对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的作用研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阿帕替尼体外水平对ABCB 1介导的卵巢癌多西他赛化疗MDR的影响及其作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文-1 |
| 外文论文-2 |
（4）冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 冬凌草甲素衍生物对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618对乳腺癌及卵巢癌耐药细胞的抑制作用 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618抑制STAT3信号克服乳腺癌及卵巢癌细胞耐药 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 冬凌草甲素衍生物CYD0618靶向结合STAT3 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 冬凌草甲素及其衍生物的抗肿瘤作用及机制 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 PD-L1在卵巢癌组织表达及其在卵巢癌顺铂耐药细胞中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-34a-5p通过PD-L1靶向调控卵巢癌细胞耐药作用 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-34a-5p靶向PD-L1对裸鼠体内成瘤的作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表学术论文 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）miR-382-5P介导信号通路影响铂类耐药卵巢癌细胞敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写词索引 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 基于生物学信息分析miR-382-5P在卵巢癌中的表达及临床意义 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 hsa-miR-382-5p生物信息学分析 |
| 1.2.2 回顾分析临床组织样本 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 hsa-miR-382-5P的生物学分析结果 |
| 1.3.2 卵巢癌临床组织标本检测miR-382-5p表达水平及临床资料分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 2 基于生物信息学分析卵巢上皮癌HIPK3 基因的表达及意义 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 Pub Med查找HIPK3的相关文献 |
| 2.2.2 TCGA数据库 |
| 2.2.3 Metascape数据库和String数据库 |
| 2.2.4 DAVID数据库 |
| 2.2.5 Oncomine数据库 |
| 2.2.6 HPA数据库 |
| 2.2.7 cBio Portal数据库 |
| 2.2.8 Kaplan-Meier Plotter数据库 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HIPK3与卵巢癌患者临床病理参数之间的相关性 |
| 2.3.2 HIPK3在卵巢癌组织和卵巢正常组织的表达情况 |
| 2.3.3 HIPK3与卵巢癌预后之间的相关性 |
| 2.3.4 HIPK3在卵巢癌中的差异基因及其潜在功能 |
| 2.3.5 HIPK3的互作蛋白及其与卵巢癌预后相关性 |
| 2.3.6 HIPK3在卵巢癌中的共表达基因及其潜在功能 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 3 miR-382-5P靶向HIPK3介导Ras通路调控卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞来源 |
| 3.2.2 主要试剂和耗材 |
| 3.2.3 主要使用仪器 |
| 3.2.4 主要试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞复苏 |
| 3.3.2 细胞换液 |
| 3.3.3 细胞计数 |
| 3.3.4 细胞传代 |
| 3.3.5 细胞冻存 |
| 3.3.6 慢病毒转染卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII |
| 3.3.7 提取miRNA的实验步骤 |
| 3.3.8 提取总RNA的实验步骤 |
| 3.3.9 逆转录反应合成cDNA |
| 3.3.10 提取细胞蛋白质 |
| 3.3.11 CCK8 |
| 3.3.12 平板克隆形成实验 |
| 3.3.13 划痕实验步骤 |
| 3.3.14 侵袭实验步骤 |
| 3.3.15 流式细胞仪 |
| 3.3.16 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 LV-anti-miR-382-5P慢病毒感染靶细胞的结果 |
| 3.4.2 检测SKOV3-DDPII、 SKOV3-DDPII-NC及SKOV3-DDPII-inhibiitor细胞中miR-382-5P的表达情况 |
| 3.4.3 检测SKOV3-DDPII、 SKOV3-DDPII-NC及SKOV3-DDPII-inhibiitor细胞中miR-382-5靶基因HIPK3的表达情况 |
| 3.4.4 验证在SKOV3-DDPII细胞miR-382-5p与 Ras通路是否存在调控关系 |
| 3.4.5 miR-382-5P敲低影响卵巢癌耐药细胞SKOV3-DDPII中 Ras通路的表达 |
| 3.4.6 LV-HIPK3慢病毒转染结果 |
| 3.4.7 检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492及SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞中HIPK3的表达情况 |
| 3.4.8 检测SKOV3-DDPII、SKOV3-DDPII-GV492及SKOV3-DDPII-GV492-HIPK3细胞中HIPK3的表达情况 |
| 3.4.9 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞SKOV3-DDPII中 Ras通路的表达 |
| 3.4.10 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII对顺铂敏感性 |
| 3.4.11 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII的增殖情况 |
| 3.4.12 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII的克隆能力 |
| 3.4.13 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII的迁移能力 |
| 3.4.14 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII的侵袭能力 |
| 3.4.15 HIPK3过表达是否影响卵巢癌耐药细胞株SKOV3-DDPII的凋亡情况 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 参考文献 |
| 4 miR-382-5P与 MTAP基因3’-UTR的靶向验证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞来源 |
| 4.2.2 主要试剂和耗材 |
| 4.2.3 主要使用仪器 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 提取细胞蛋白质 |
| 4.3.2 生物信息学软件预测miR-382-5P与靶基因MTAP的结合位点 |
| 4.3.3 双荧光素酶报告基因检测系统 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Western blot验证miR-382-5P与 MTAP存在调控关系 |
| 4.4.2 预测miR-382-5P与 MTAP3’-UTR的结合位点 |
| 4.4.3 PCR扩增与酶切鉴定结果 |
| 4.4.4 miR-382-5P与 MTAP结合位点的验证结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 创新点 |
| 本研究不足之处 |
| 综述 miRNA 介导卵巢癌多药耐药性的机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）RASSF1A、WT-1蛋白的表达与复发性上皮性卵巢癌的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 临床研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 资料收集及标本采集 |
| 1.1.3 实验室检测 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 RASSF1A及WT-1蛋白表达与复发性上皮性卵巢癌的关系 |
| 1.2.2 RASSF1A及WT-1蛋白表达与复发性上皮性卵巢癌临床病理特征的关系 |
| 1.2.3 RASSF1A及WT-1蛋白表达与铂敏感/铂耐药复发的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 RASSF1A的表达及意义 |
| 1.3.2 WT-1的表达及意义 |
| 1.3.3 RASSF1A与WT-1之间的关系对复发及铂敏感/铂耐药的影响 |
| 1.3.4 上皮性卵巢癌复发及铂敏感/铂耐药的相关因素 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 复发性卵巢癌和表观遗传学 |
| 2.1.1 表观遗传学 |
| 2.1.2 细胞凋亡 |
| 2.2 RASSF1A的功能特点与卵巢癌的关系 |
| 2.3 WT-1的功能特点与卵巢癌的关系 |
| 2.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 临床病理资料收集表 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（9）TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1. 卵巢癌临床研究概况 |
| 1.1 卵巢癌发病流行病学研究进展 |
| 1.2 卵巢癌诊断研究进展 |
| 1.3 卵巢癌治疗研究进展 |
| 2. TNKS研究背景 |
| 2.1 TNKS生物学特性 |
| 2.2 TNKS生物学功能 |
| 2.3 TNKS1介导Wnt通路与恶性肿瘤关系的研究进展 |
| 3. 研究内容和科学意义 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 科学意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 临床标本 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 试剂与配置 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.4 实时荧光定量 |
| 2.5 免疫印迹(Western blot)检测 |
| 2.6 细胞生长实验(MTS) |
| 2.7 细胞集落形成实验 |
| 2.8 细胞迁移与侵袭实验 |
| 2.9 流式细胞学 |
| 2.10 葡萄糖摄取实验 |
| 2.11 乳酸分泌实验 |
| 2.12 细胞ATP检测 |
| 2.13 双荧光素酶报告基因分析 |
| 2.14 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.15 统计分析 |
| 第三章 结果 |
| 1. TNKS1在卵巢癌组织的表达及其临床意义 |
| 1.1 网络数据库TNKS在卵巢癌中的表达 |
| 1.2 临床资料 |
| 1.3 TNKS1在卵巢癌组织中的表达 |
| 1.4 TNKS1在卵巢癌组织中高表达的临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞的体内外增殖 |
| 2.1 TNKS1敲低细胞模型建立 |
| 2.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞体外生长的影响 |
| 2.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.4 敲低TNKS1对卵巢癌细胞体内成瘤的影响 |
| 3. TNKS1与卵巢癌耐药性的关系 |
| 3.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞药物敏感性的影响 |
| 3.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞凋亡的影响 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞的迁移与侵袭 |
| 4.1 细胞划痕修复法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移的影响 |
| 4.2 转移小室法检测TNKS1对卵巢癌细胞迁移与侵袭的影响 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞的有氧糖酵解 |
| 5.1 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞葡萄糖摄取的影响 |
| 5.2 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞乳酸分泌的影响 |
| 5.3 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞ATP生成的影响 |
| 5.4 敲低或抑制TNKS1对卵巢癌细胞耗氧率的影响 |
| 6. TNKS1通过调控PC表达介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6.1 抑制或敲低TNKS1对卵巢癌细胞丙酮酸羧化酶表达的影响 |
| 6.2 TNKS1通过PC介导卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 7. TNKS1通过激活Wnt/β-catenin/snail信号通路调控卵巢癌发生发展 |
| 7.1 敲低或抑制TNKS1显着抑制Wnt/β-catenin信号通路 |
| 7.2 TNKS1对Wnt/β-catenin信号通路多个靶基因的调控 |
| 7.3 TNKS1通过调控Snail表达而影响PC的表达 |
| 8. TNKS1与Snail、PC蛋白在临床组织表达的相关性分析 |
| 第四章 讨论 |
| 1. TNKSI在卵巢癌中高表达及其临床意义 |
| 2. TNKS1促进卵巢癌细胞快速增殖 |
| 3. TNKS1介导卵巢癌细胞耐药性产生 |
| 4. TNKS1促进卵巢癌细胞转移 |
| 5. TNKS1促进卵巢癌细胞有氧糖酵解 |
| 6. TNKS1调控卵巢癌发生发展的分子机制 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 主要缩略语表 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）卵巢癌细胞系OVCAR4生物学特性研究及CDC50A作为卵巢癌干细胞标记蛋白的验证（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 卵巢癌细胞系OVCAR4与SKOV3生物学特性的比较 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二章 卵巢癌细胞系OVCAR4小鼠腹腔及卵巢原位成瘤模型建立及动态观察 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三章 CDC50A+细胞在OVCAR4细胞系中干细胞特性的验证 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 卵巢癌干细胞介导多药耐药机制及其治疗策略的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、卵巢癌组织多药耐药性的临床研究（论文参考文献）
- [1]MyD88上调P-gp介导宫颈癌顺铂化疗耐药机制的初步探讨[D]. 叶鑫鑫. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]Hsa＿circ＿0000714/miR-370-3p调控RAB17对卵巢癌紫杉醇耐药的影响及机制研究[D]. 郭敏. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]阿帕替尼联合多西他赛治疗转移性卵巢癌疗效、安全性及增效机制研究[D]. 殷蓓蓓. 山东大学, 2020(04)
- [4]冬凌草甲素衍生物GYD0618对乳腺癌和卵巢癌耐药细胞的抑制作用及机制研究[D]. 刘熙. 昆明医科大学, 2020(02)
- [5]miR-382-5P介导信号通路影响铂类耐药卵巢癌细胞敏感性的机制研究[D]. 吴佩阳. 广西医科大学, 2020
- [6]miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的机制研究[D]. 左英. 山东大学, 2020(09)
- [7]miR-382-5P介导信号通路影响铂类耐药卵巢癌细胞敏感性的机制研究[D]. 吴佩阳. 广西医科大学, 2020
- [8]RASSF1A、WT-1蛋白的表达与复发性上皮性卵巢癌的关系[D]. 韩娜. 华北理工大学, 2020(02)
- [9]TNKS1通过Wnt/β-catenin信号通路调控卵巢癌发生发展的作用与机制[D]. 杨宏毅. 南方医科大学, 2020(01)
- [10]卵巢癌细胞系OVCAR4生物学特性研究及CDC50A作为卵巢癌干细胞标记蛋白的验证[D]. 蔡艳. 北京协和医学院, 2020(05)