楚雄医药高等专科学校 云南 楚雄 675005
基金项目： 2009年国家自然科学基金资助项目(项目名称:降浊颗粒对慢性肾衰大鼠肾纤维化TGF-β/Smads信号传导通路的影响;项目编号:30960477
通讯作者：吉勤 单位：云南中医学院第一附属医院肾病科
摘要【目的】：通过大鼠动物实验，观察5/6肾切除诱导的大鼠慢性肾功能衰竭(CRF)残肾 Smad2、Smad7 蛋白及TGF-β1 mRNA 表达。以探讨Smad2、Smad7及TGF-β1 mRNA 对慢肾衰肾纤维化的机理。
【方法】：选符合标准Wistar大鼠30只，随机分为3组。即：①正常组；②假手术组；③5/6肾切除组。2期手术后大鼠自然喂养连续7周，检测血清BUN、Scr，之后自然喂养60天后全部处死，留取肾组织、股动脉血标本送检。检测指标①血清BUN、Scr；②免疫组化法检测大鼠肾组织中Smad2、Smad7的表达。③ELISA检测试剂盒检测TGF-β1 mRNA 。
【结果】：①与假手术（对照组）相比，Smad2蛋白在5/6肾切除CRF大鼠残肾肾间质表达显著增多(P < 0.01)，在肾小管上皮细胞的表达均明显增多(P <0.05) ,并与TGF-β1表达上调成正相关;而Smad7 蛋白在肾小管中的表达明显下降(P < 0.01)，在肾小球中及肾间质的表达下降(P < 0.05)) ,且与TGF-β1表达上调成负相关。TGF-β1在 CRF大鼠肾脏表达较假手术大鼠明显增多(P<0.05)。结果提示，作为TGF-β/ Smads 信号通路的成员，抑制性Smad7在 CRF肾纤维化发生发展过程中可能起重要的反馈性抑制作用；受体调节型Smad2 在 CRF肾纤维化发生发展过程中可能起重要的促进性作用。
【结论】TGF-β/ Smads 信号通路参与了慢肾衰的肾纤维化进程 ，Smad2 蛋白过度表达和Smad7 负调控不足可能是导致大鼠残肾纤维化的主要原因。
关键词：5/6肾切除； 慢性肾衰竭； Smad7； 转化生长因子 -β1
【中图分类号】R248.3【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)09-0317-02
当前，国内外关于CRF的发病机制研究颇多，其中肾间质纤维化是慢性肾脏病(CKD)进展致CRF的主要原因之一[1]。大量研究文献资料显示，肾间质纤维化在CKD进展中起着主导作用，其病变程度与CKD的预后密切相关。目前肾间质纤维化及肾小球硬化的机制目前并未完全明确，其中相对明确的是TGF-β1/Smads信号传导通路的激活,这是导致肾纤维化的重要环节[2]。近年研究表明Smad蛋白家族是TGF-β超家族胞内信号转导的重要调控因子，且是目前所知的唯一的TGF-β1受体的胞内激酶底物[3]，介导TGF-β1细胞内反应的主要通路, Smad蛋白依赖磷酸化在细胞质和细胞核间进行穿梭对于TGF-β1信号的动态调控具重要作用。Smads蛋白按结构和功能分3大类：第1 类是受体调节型 (R-Smads)：即Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8；第2类是抑制型（I-Smads)：即Smad6及Smad7； 第3类是共同调节型 (Co-Smads)：即Smad4，10。TGF-β1介导的肾纤维化可被Smad2/3激活，被Smad7所阻断；Smad2，3，4，7蛋白参与TGF-β/Smad 信号转导[4-5] 。
本实验研究采用免疫组织化学染色（SP法）技术分析测定Smad2、7。细胞膜或胞浆出现棕黄色染色为阳性。ELISA检测试剂盒检测TGF-β1 mRNA 。探讨Smad2、Smad7及TGF-β1 mRNA 对慢肾衰肾纤维化的机理。
1. 材料与方法
1.1 试剂与实验药物:Smad2兔多克隆抗体、Smad7兔多克隆抗体购自Abcam艾美捷科技有限公司（ab6584）；SP免疫组化检测试剂盒(兔) 购自北京博奥森生物技术有限公司（sp-0023）；DBA显色试剂盒及快捷型酶标羊抗兔IgG聚合物均购自福州迈新生物技术有限公司；PBS液等免疫组织化学检测所需试剂由昆明医科大学口腔医学院重点实验室提供。
1.2动物模型的制作: Wistar雄性大鼠36只，2级，动物合格证号：SCXK(川)2011-18，体重（220 ±20）g，6-8周龄，自然喂养一周。大鼠随机分为正常组（未手术组）、模型组及假手术组，采用5/6肾大部切除法[6]建立CRF大鼠模型，分两期手术完成。2期手术后正常喂养7周，全部大鼠断尾采血，测定大鼠BUN、Scr升高；说明造模成功。
2. 动物分组及检测内容：
大鼠3组：即①正常组10只②假手术组10只；；③模型组10只：继续自然喂养60天后检测指标。剪股动脉采血5ml，检测Scr、BUN。采血后，手术取下残余肾脏，4%甲醛液固定，制作病理切片， SP法技术测定Smad2、Smad7蛋白及ELISA试剂盒检测TGF-β1 mRNA。
2.1检测方法：SP法检测 TGF-β1、 Smad2、Smad7 表达定位并进行半定量分析,切片、常规脱蜡、3%H2O2 处理、微波修复抗原后滴加封闭液，封闭后分别加第一抗体兔抗大鼠多克隆Smad2、 Smad7 抗体(1:50~1:100)，孵育 10 min ，4℃过夜。次日加生物素化第二抗体快捷型酶标羊抗兔IgG聚合物，加山羊血清一滴，37℃孵育 20 min， DAB 显色，苏木素复染。阴性对照为一抗。阳性显色为棕色或红色。最后PBS冲洗返蓝。经过梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片保存。
2.2 ELISA试剂盒测定大鼠肾脏TGF-β1mRNA 表达：取各组大鼠肾皮质组织 0.1 g，用 TRIzol 抽提总 RNA，以 RNA 纯化柱纯化，ELISA方法测定mRNA水平。按照试剂盒操作说明进行操作。逆转录条件：反应总体积50 μL，反应条件为 50℃2 min； 95℃ 10 min； 95℃ 15 s； 60℃ 1 min，重复40 个循环，保存其循环域值(threshold cycle, CT)。具体操作与昆明医科大学口腔病理实验室合作。
2.3S-P法结果判定: 阳性细胞率评分：细胞膜或胞浆出现黄色或棕黄色染色为阳性。依据以下标准分析：每张切片低倍镜下（100×）依序单盲观察左上、左下、中间、右上、右下5个视野，然后各项计分之和，作为细胞率评分。阳性细胞率评分表：
按平均灰度半定量评估：观察视野内免疫阳性部分的平均灰度,平均灰度越小表示免疫阳性程度越强。LEICA显微镜下观察肾组织病理变化并拍照,输入北航医学病理图像分析系统进行图像分析。
3. 统计学处理：用SPSS 统计软件(13.0 版)for windows进行组间方差分析，实验数据以 mean±SD 表示，TGF-β1 和 Sm ads蛋 白免疫组化染色的变化比较采用方差分析，P<0.05为有显著性差异。P <0.01有非常显著性差异。
4．结果：SP法
4.1 Smad2检测结果:模型组与假手术组比较Smad2阳性细胞率明显增加，经统计学方法分析,差异有显著意义（P<0.05）；假手术组与未手术组比较阳性细胞率无明显增加，经统计学方法分析,差异无显著意义（P﹥0.05）（见表一、图一）
4.2各组大鼠肾组织7TGF-β1的表达
模型组与假手术组比较 TGF-β1mRNA表达强度明显升高，经统计学方法分析方法，差异有非常显著性意义（P<0.01）；而未手术组与假手术组比较，经统计学方法分析，差异无显著性意义（P>0.05），说明CRF过程中TGF-β1mRNA的表达明显增强。（见表三、图三）
3. 讨 论
TGF-β1是各种肾病肾小球硬化和肾间质纤维化发生、发展的必需因子，其过度产生在CKD中引起不可逆的肾脏纤维化。利用免疫组化染色，我们发现与对照组相比， Sm ad2 蛋白在C RF 中肾小管上皮细胞的表达均显著增加 ，与 TGF-β上调呈正相关 ； 而 Sm ad7 蛋白表达却明显下降 ,与 TGF-β上调呈负相关。因此我们认为，TGF-β／ Sm ad信号通路参与了C RF纤维化 进程 ，细胞内确实存在有Sm ad2 正调控和 Sm ad7 负调控的平衡 。所以通过观测 Sm ad2，7在C RF中的定位和表达，有助于阐明 TGF-β在CRF中作用的分子机制和发病机理 。有望通过靶向阻断Smad2蛋白的磷酸化或提高Smad7表达以阻断TGF-β1信号转导通路，为肾纤维化的临床治疗提供一种新的途径。
参考文献：
[1]Mallat Z, Gojova A, Marchiol-Fournigault C, et al. Inhibition ofplaque metalloproteinasesandfoam cell phenotypes [ J] . Thromb transforming growth factor-beta signaling accelerates atherosclerosis Haemost, 2009, 101 ( 6) : 1006 -1011 .
[2]吉勤；李潇；杨文荣；谷艳；谢江海.降浊颗粒对慢性肾衰竭大鼠肾组织α-SMA的影响[J].云南中医学院学报.2012（07）
[3]杨勤；韩冰；谢汝佳；程明亮.骨形态发生蛋白-7及抑制性Smads在糖尿病肾病发生发展中的表达变化[J].生理学报.2007；6：76-78
论文作者:孙梅艳
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年9月
论文发表时间:2016/11/2
标签：大鼠论文; 蛋白论文; 阳性论文; 信号论文; 免疫论文; 组织论文; 统计学论文; 《中国医院药学杂志》2016年9月论文;