【摘要】 目的：检测与分析宫颈癌组织中Ras相关区域家族2A基因启动子甲基化状态，同时分析Ras相关区域家族基因甲基化特点及其与临床病理关系。方法：选取本院所收治的92例宫颈癌患者和76例宫颈上皮内瘤变患者及50例正常宫颈组织人群进行研究，并采用甲基化特异性PCR对研究对象的Ras相关区域家族基因启动子甲基化状态进行检测。结果：经检测和统计分析，宫颈癌组织中Ras相关区域家族基因甲基化率明显高于正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤变(P<0.05)。Ras相关区域家族甲基化阳性率与淋巴结转移呈正相关性(P<0.05)。Ras相关区域家族甲基化与年龄、组织分级、临床分期、病理类型无相关性(P>0.05)。结论：临床上，Ras相关区域家族基因启动子甲基化为常见情况，同时其可能与临床宫颈癌发生及淋巴结转移存在紧密联系，进而临床宫颈癌分子诊断及预后判断提供重要参考价值。
【关键词】Ras相关区域家族；甲基化；宫颈癌
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）08-0103-02
宫颈癌是临床妇科中常见恶性肿瘤疾病，对女性人群生命健康造成极大威胁，且其发病率及死亡率呈逐年上升趋势。目前全球大约新发患者为50万，大约80%发生于发展中国家[1]。宫颈癌发病的主要原因为人乳头状瘤病毒(HPV)感染，然大约90%宫颈鳞癌及50%宫颈腺癌患者可检测到HPV DNA，因此宫颈癌为目前恶性肿瘤疾病中唯一明确病因的疾病[2]。但HPV感染为宫颈病变或宫颈癌必要条件，经流行学调查发现，感染HPV感染妇女中，少数患者发展为宫颈癌，因此而说明还存在其他因素参与宫颈癌恶性转化过程。近年来，随着临床研究不断深入，遗传学在肿瘤发生中的作用逐渐得到人们所重视。RSA蛋白通过相关重要信号传导途径来有效调节细胞分化和增殖及凋亡等。经研究发现[3]，RSA信号通路改变可导致肿瘤发生，RAS相关区域家族2A基因(RAS association domain family2A,RASSF2A)是一个潜在抑癌基因，其表达缺失或减弱已于胃癌和结肠癌及胰腺癌等肿瘤中发现。但目前对RASSF2A基因表达及其启动子甲基化状态与宫颈癌关系的研究较少，本次对宫颈癌组织中RASSF2A基因启动子甲基化状态采用甲基化特异性PCR(MSP)法进行检测，并分析其与临床病理特征间关系，探讨RASSF2A基因启动子甲基化在宫颈癌中发生及发展的作用及临床意义，报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
选取贵阳市妇幼保健院妇科2011年6月～2014年10月期间所收治的92例宫颈癌患者和76例宫颈上皮内瘤变患者及50例正常宫颈组织人群进行研究。其中宫颈癌患者中，年龄28～67岁，平均(45.5±1.5)岁；临床分期：IA2期20例、IB1+IB2期56例、IIA期16例；病理分级：腺癌16例、鳞癌76例；淋巴结转移者20例、无淋巴结转移者72例；术前患者均未采取放化疗治疗。宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasis，CIN)患者：CIN I为28例、CIN II～III为48例；年龄23～68岁，平均为(47.0±1.0)岁。正常宫颈组织取自全子宫切除术患者中，年龄26～65岁，平均为(46.5±1.0)岁。本次所研究标本均经病理证实，标本收集后放置于-80℃冰箱中保存。
1.2 方 法
使用试剂：组织基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技公司。DNA甲基化试剂盒购自Zymo research公司，纯化试剂盒购自 Promega公司；引物均由上海生工生物工程技术公司合成。
检测方法：将冻存组织剪碎、研磨，按照DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，然后测定其纯度及浓度。基因组DNA采用亚硫酸钠处理，取1 ug DNA溶于50ul水中，并加入3mol/L氢氧化钠溶液3.3ul，于37℃中孵育15min[4]。加10mmol/L氢醌30ul、亚硫酸氢钠3mol/L520ul，混匀，放置于50℃水浴中16h。经碱基修饰的DNA采用Wizard DNA Clean-Up System进行脱盐和纯化，然后再回收。回收后的DNA溶于20 ul TE缓冲液中，并放置于-80℃冰箱中保存备用。
甲基特异性聚合酶链反应：经修饰的DNA采用MSP试剂盒按使用说明书进行操作。甲基特异性引物：5＇-GT-TCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3＇和5＇-AAAAACCAACGAC-CCCCGCG-3＇[5]。非甲基特异性引物：5＇-AGTTTGTTGTTGTTTTT-TAGGTGG-3＇、5＇-AAAAAACCAACAACCCCCACA-3＇；扩增片段均为108bp[6]。反应条件：反应体积30 ul，95℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30℃，72℃延伸30s，共35个循环，72℃再延伸6min。PCR产物经2%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察成像记录结果。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS20.0软件统计与分析，计数资料采用(例,%)表示，采用X2检验，结果以P<0.05表示具有统计学意义。
2.结果
2.1 各组甲基化情况
经检测和统计分析，宫颈癌组织中Ras相关区域家族基因甲基化率明显高于正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤变(P<0.05)。见表1。
由表1可知，宫颈癌组织中，RASSF2A基因启动子甲基化阳性率明显高于CIN组、正常宫颈组(X2=5.51，6.74，P<0.05)；且CIN组明显高于正常宫颈组(X2=10.74，P<0.05)；CIN I组明显低于CIN II～III组(X2=20.41，P<0.05)。
2.2 宫颈癌组RASSF2A基因启动子甲基化与临床病理特征关系
Ras相关区域家族甲基化阳性率与淋巴结转移呈正相关性(P<0.05)。Ras相关区域家族甲基化与年龄、组织分级、临床分期、病理类型无相关性(P>0.05)。见表2。
3.讨论
DNA甲基化是最早所发现的基因转录前调控途径之一。然在真核生物基因组中，大约有80%CpG位点被甲基化，且这些甲基化主要发生于基因启动子区域的CpG岛。经相关研究表明，DNA甲基化可导致染色质结构和DNA构象及DNA稳定性、DNA与蛋白质相互作用方式发生变化，自身或结合甲基结合蛋白后，其将阻遏转录因子与启动子的结合，最终可有效调控基因表达，同时其也是表观遗传学修饰最重要的基因转录前调控方式。抑癌基因的启动子甲基化与某些肿瘤的临床分期与病理类型存在紧密联系，同时其也成为肿瘤分子诊断及预后判断的重要生物标志物。基因启动子甲基化作为基因水平的标志物，其具有极高特异性和灵敏度。近年来，随着临床医学的不断深入研究，逐渐认识到DNA甲基化异常对基因调控及表型传递起到十分重要的作用。经研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞甲基化水平发生极大变化，且在肿瘤发生与发展过程中，时常出现整个基因组DNA的低甲基化和CpG岛局部高甲基化。DNA的低甲基化往往因肿瘤细胞中DNA甲基化酶活性增高或CpG岛的局部保护机制受到破坏而引起，最终导致染色体不稳定及原癌基因过度表达。而CpG岛局部高甲基化常常会导致细胞凋亡基因和细胞周期调控基因及血管生成基因等癌相关基因的沉默，最终导致发生癌症。
RASSF2A位于人体染色体20p13区段，其是RASSF家族的重要组成成员，广泛于人体内表达，尤其是脑和胎盘及血液为高。此外，RASSF2F存在多个转录本，并且其启动子区域存在多个CpG岛，使得其转录受到甲基化的调控。经本次研究发现，经检测和统计分析，宫颈癌组织中Ras相关区域家族基因甲基化率明显高于正常宫颈组织及宫颈上皮内瘤变(P<0.05)。Ras相关区域家族甲基化阳性率与淋巴结转移呈正相关性(P<0.05)。Ras相关区域家族甲基化与年龄、组织分级、临床分期、病理类型无相关性(P>0.05)。由此而说明RASSF2A基因启动子区甲基化可能参与了宫颈癌的发生，同时其可能与宫颈癌恶性进展存在紧密联系。其通过增强宫颈癌细胞侵袭力，进而增加患者宫颈癌转移率，为临床检测宫颈癌淋巴转移的重要生物学指标，但其是否可有效预示较差的临床预后，还需进一步研究与观察。虽多种基因DNA甲基化与肿瘤发生存在较为紧密联系，但肿瘤发生是一种多因素和多阶段的复杂过程，DNA甲基化与其他致癌因素协同促进肿瘤的发生尚不清楚，DNA 异常甲基化在肿瘤发生中涉及的多种蛋白因子如何相互作用及具体机理，尚待进一步研究。
综上所述，DNA甲基化是肿瘤发生过程中早期事件，因此临床筛查RASSF2A基因甲基化状态对宫颈癌早期诊断具有重要意义，进而可有效判断患者预后，提高患者生存质量。
【参考文献】
[1]崔华英,周栩茹,韩庆,等.宫颈癌C-33A细胞RASSF1A基因启动子CG位点甲基化及其临床意义[J].山东医药,2011,51(6):34-35.
[2]崔华英,周栩茹,韩庆,等.宫颈癌RAS相关区域家族1A基因启动子甲基化检测及临床意义研究[J].中国全科医学,2011, 14(14): 1529-1531+1534.
[3]符策岗,汪磊,宋银宏.抑癌基因甲基化与宫颈癌的关系[J].生命科学,2013,25(1):63-67.
[4]李琦,胡昌华,万光华,等.死亡相关蛋白激酶1基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义[J].检验医学与临床,2013,10(9):1101-1102+1104.
[5]李琦,胡昌华,张婧.宫颈脱落细胞RASSF1A基因甲基化在宫颈癌中的临床意义[J].检验医学与临床,2013,10(12):1518-1519.
[6]潘英,陈洪,张慧,等.胃癌组织RASAL1基因启动子甲基化及临床意义研究[J].中华肿瘤防治杂志,2013,20(20):1589-1591.
论文作者:谢景
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第8期供稿
论文发表时间:2015/7/2
标签：宫颈癌论文; 基因论文; 甲基化论文; 宫颈论文; 甲基论文; 区域论文; 组织论文; 《医药前沿》2015年第8期供稿论文;