张英华[1]2000年在《乳铁蛋白的提取、促进铁吸收及其抑菌性质的研究》文中研究说明乳铁蛋白（LF）是一种铁结合糖蛋白，分子量大约是77000±2000Da，pI=8.0±0.2。乳铁蛋白具有多种生物活性。本课题对LF的提取条件、检测方法、热稳定性、补铁功能、抑菌作用等进行了全面深入的研究。 1.建立三种LF的免疫学检测方法---酶联免疫法、单相免疫扩散法、双相免疫扩散法。其中酶联免疫法精确度高，最小检出量为0.5mg/L，线性范围为0.8～100mg/L。单相免疫扩散法是一种操作较为简便的定量检测方法，适用于在提取过程中测定LF的浓度。双相免疫扩散法是一种特异性强，操作较为简单的定性检测方法，通过抗原和抗体形成的沉淀线来判断乳铁蛋白的存在。 2.本实验用色谱法提取乳铁蛋白，柱材料为CM Sephadex C-50，在pH值为7.4时，用含有NaCl的磷酸盐缓冲液进行线性梯度洗脱。 3.为了建立一种针对乳铁蛋白的有效的杀菌方法，研究了乳铁蛋白在不同pH值下，经热处理后其免疫活性和抑菌效果的变化。将乳铁蛋白的pH值分别调至3.7～8.0，在65～135℃几个不同的温度下进行热处理后，用免疫双扩散法检测其免疫活性，以及对大肠杆菌的抑菌效果。结果表明，pH4.8、75℃加热5min，不仅保持LF的溶解性和免疫活性，而且能大大提高其抑菌效果。 4.乳铁蛋白可以通过增加肠道内无机铁的溶解度来促进铁的吸收，本实验测定在磷酸根存在的中性pH值条件下，乳铁蛋白对Fe~(3+)和Fe~(2+)溶解度的影响，结果表明LF对Fe~(3+)和Fe~(2+)均有增溶作用。 5.抑菌实验选择大肠杆菌和沙门氏菌两种肠道致病菌。随着乳铁蛋白浓度的增加，对两种菌的抑菌效果均明显增强。pH值对乳铁蛋白的抑菌作用也有影响，对大肠杆菌的最佳抑菌pH值为7.4，对沙门氏菌的最佳抑菌pH值为7.0。另外乳铁蛋白与免疫球蛋白和溶菌酶具有协同的抑菌作用。
柏亚军[2]2008年在《人乳铁蛋白转基因小鼠遗传特性及rhLF抑菌活性分析》文中进行了进一步梳理人乳铁蛋白(human lactoferrin)又称乳转铁蛋白,是人乳汁中主要的铁结合蛋白,具有抑菌、增强免疫等多种生物学功能。本研究应用人乳铁蛋白(cDNA)基因与牛α-S1-casein或山羊β-casein调控序列分别构建的表达载体制备转基因小鼠,从而检验表达载体在原代及后代转基因小鼠中乳腺特异性遗传与表达的特性,以及表达产物(rhLF)的抑菌活性,为后续山羊人乳铁蛋白乳腺生物反应器的制备提供实验依据。分别用牛α-S1-casein或山羊β-casein调控序列和人乳铁蛋白cDNA功能基因构建了AP与PCL25两个乳腺特性表达载体,通过显微注射法制备转基因小鼠,分别获得2♀与1♀原代转基因小鼠。原代转基因小鼠与ICR或C57交配,出生后代经PCR检测,筛选出F1代转基因小鼠,再从F1代中随机选取2-3只阳性整合小鼠与ICR或C57交配,得F2代,依次反复得到F3、F4代转基因小鼠;将AP与PCL25的原代转基因小鼠以及F1、F2代转基因小鼠,通过近交或回交方法繁殖,用测交法和PCR整合检测筛选出纯合子转基因小鼠。分别收集AP与PCL25转基因小鼠乳汁,离心去除脂肪和酸化沉淀去除酪蛋白,获得小鼠乳清。用标准hLF为参照,经ELISA定量表达产物;Western-blot进一步分析表达的rhLF大小,并通过透析与凝胶过滤层析提取rhLF;再用所得的rhLF对大肠杆菌和沙门氏菌进行抑菌试验。结果显示,AP构件的F1代转基因小鼠的整合率为57.14%(12/21只), F2代中阳性整合率为50%(10/20只),F3代中阳性整合率为50%(17/34只),F4代中阳性整合率为53.33%(24/45只);PCL25构件的F1代转基因小鼠的整合率为53.85% (14/26只),F2代中阳性整合率为39.58%(19/48只),F3代中阳性整合率为31.11% (14/45只),F4代中阳性整合率为38%(19/50只)。通过ELISA检测各代转基因母鼠乳汁中rhLF的含量,结果表明,AP与PCL25构件的后代转基因小鼠,其表达量与原代(3.61 g·L-1、6.4 g·L-1)相比,有上升也有降低,统计学分析无显著性差异(P>0.05)。获得AP构件的纯合子转基因小鼠2只(1♂1♀),其母鼠乳汁中rhLF表达量为5.65 g·L-1;PCL25构件的纯合子转基因小鼠1只(1♀),表达含量为5.98 g·L-1。它们乳汁中的rhLF含量明显高于杂合子转基因小鼠乳汁中的含量。采用ELISA和Western-Blot对提取的rhLF进行免疫检测,结果显示,AP与PCL25都有与标准hLF相一致的条带(约78kDa),其浓度分别为7.52g·L-1、8.04g·L-1;分别用不同浓度的rhLF对大肠杆菌、沙门氏菌进行抑菌试验,从抑菌率和抑菌圈的大小,可以看出由AP与PCL25构件制备的转基因小鼠乳汁中的rhLF都具有抑菌活性,并随着浓度的增加而增强。通过本研究初步表明,我们所构建的AP与PCL25表达载体不仅能够指导人乳铁蛋白基因在原代小鼠乳腺中高效表达,并能够在后代中稳定的遗传和表达;且表达的rhLF具有抑菌活性。另外,转基因纯合子小鼠的筛选结果,这些都为我们下一步建立高效表达的人乳铁蛋白转基因山羊乳腺生物反应器奠定了基础。
参考文献：
[1]. 乳铁蛋白的提取、促进铁吸收及其抑菌性质的研究[D]. 张英华. 东北农业大学. 2000
[2]. 人乳铁蛋白转基因小鼠遗传特性及rhLF抑菌活性分析[D]. 柏亚军. 扬州大学. 2008