1.湖南省人民医院儿童医学中心 湖南省长沙市 410000；
2.中国疾病预防控制中心与病毒生物技术国家工程研究中心 北京 100052
【摘 要】目的：下呼吸道感染是全球儿童致死的重要病因，为了探讨人类非SARS冠状病毒与儿童急性下呼吸道感染的关系，本研究从湖南省急性下呼吸道感染的儿童鼻咽抽吸物（nasopharyngeal aspirates，NPA）标本中分离出冠状病毒NL63和HKU1，对比两者的临床表现及流行病学异同。方法：我们采集2007年9月至2012年3月急性下呼吸道感染住院儿童NPA标本2817份，提取病毒RNA进行PCR，阳性扩增产物进行病毒基因序列测定，检测常见的12种呼吸道病毒，包括NL63和HKU1。结果：在2817份标本中，检测到冠状病毒NL63阳性扩增产物13份，总检出率为0.46 %，检测到冠状病毒HKU1阳性扩增产物22份，总检出率为0.78 %。NL63和HKU1均以男性患儿居多，NL63发病以夏秋季为主，HKU1以春秋季多发。发病年龄均以小婴儿为主，NL63阳性患儿中<1岁婴儿占8/13（61.5%），<3岁（100%），HKU1阳性患儿<1岁为14/22（63.6%），<3岁（86.3%），2例新生儿起病。NL63较HKU1更容易引起发热，P≤ 0.05，两者引起的下呼吸道感染临床症状差异没有显著性，最常见有咳嗽，咳痰，气喘等，伴发有消化道症状，如腹泻，呕吐等。结论：NL63和HKU1是中国湖南长沙地区急性下呼吸道感染的病因之一，发病率不高，病情以轻-中度为多见。
【关键词】儿童；下呼吸道感染；冠状病毒；NL63；HKU1
Research about human coronaviruses NL63 and HKU1 in children with acute lower respiratory infection in hunan province
LIN xiaojuan，ZHANG bing，DUAN zhaojun，XIAO niguang，XIE leyun，ZHONG lili，HUANG han，Hunan Provincial People’s Hospital，CHANGSHA，410000，HUNAN，CHINA
Objective：lower respiratory tract infection is an important cause of death in children worldwide.In order to investigate the relation between human non-SARS corona virus and children with acute lower respiratory tract infection，in this study from nasopharyngeal aspirate（NPA）specimens of children patients in Hunan with acute lower respiratory infections we isolated coronavirus NL63 and HKU1，comparing similarities and differences in clinical manifestations and epidemiology of them.Methods：We collect 2817 children NPA specimens hospitalized from September 2007 to March 2012 with acute lower respiratory tract infection，extracting viral RNA to run PCR，and the sequencing the gene of positive amplified products.We detect 12 kinds of common respiratory viruses，NL63 and HKU1 included.Results：In 2817 specimens，we detect 13 parts of corona virus NL63 positive amplification product，the positive rate was 0.46%，22 parts of corona virus HKU1 positive amplification product，with the rate 0.78%.NL63 and HKU1 are mostly in male children，NL63 onset mainly in summer and autumn，HKU1 in spring and autumn.Age of onset are mainly babies，NL63-positive infants <1 year of age accounted for 8/13（61.5%），<3 years of age（100%），HKU1 positive patients <1 year of age for 14/22（63.6%）<3 years old（86.3%），and two cases of neonatal onset.NL63 is relatively more likely to cause fever than HKU1，P≤ 0.05，and no statistically significance on the clinical symptoms difference caused by the both respiratory tract infection.The most common symptoms are cough，sputum，wheezing，etc.，associated with gastrointestinal symptoms，such as diarrhea and vomiting.Conclusion：NL63 and HKU1 is one cause of acute lower respiratory tract infections in Changsha，Hunan Province，China，with not high incidence and the mild - moderate condition is more common.
Keywords：Children；lower respiratory tract infection；corona virus；NL63；HKU1
冠状病毒是正链RNA病毒，与人类及动物的许多疾病相关，主要引起呼吸道和消化道疾病。目前，有6种冠状病毒会感染人类，人类冠状病毒HCoV229E 和OC43，HKU1和NL63，SARS-HCoV及其MERS-CoV，其中人类冠状病毒HCoV229E 和OC43是常见的人呼吸道感染的重要病原，在上世纪60年代即被发现；NL63 和 HKU1是冠状病毒家族中的新成员，它们的发现是缘于2003年爆发的SARS危机，此次全球范围的病毒流行引起了研究者对冠状病毒的关注，伴随分子生物学技术的发展，NL63 和 HKU1分别于2004年和2005年被分离而发现[1][2]，进而在2012年4月爆发于的中东地区呼吸道综合症患者身上分离出另一种新型的冠状病毒MERS-CoV。目前研究发现NL63 和 HKU1这两者与人类呼吸道疾病相关，多数仅引起较轻的呼吸道感染，但在儿童、老年人以及免疫抑制和患有基础疾病的病人，可能导致严重的呼吸道症状[3][4]。为了进一步了解NL63 和 HKU1在儿童呼吸道尤其是下呼吸道感染的情况以及两者临床的异同点，我们收集了湖南省患下呼吸道感染的儿童鼻咽抽吸物（nasopharyngeal aspirates，NPA）标本进行病毒检测，对临床资料进行回顾性分析，对比了流行病学特点和临床表现。
1.对象与方法
1.1对象：以2007年9月～2012年3月因急性下呼吸道感染在湖南省人民医院儿科医学中心住院的儿童为对象，且在征得患儿父母的知情同意后，采集患儿入院24小时内 NPA标本。
NPA标本收集和处理：所有NPA均在收取标本后24小时内进行处理，保存在病毒运输液中（含200 U/ml青霉素，200 U/ml链霉素，200 U/ml两性霉素B及0.125% BSA），放入-80℃冰箱保存，后续送至中国疾病控制中心行冠状病毒NL63，HKU1检测，同时还检测常见的呼吸道病毒，包括RSV，HRV，IFVA，IFVB，PIV1，PIV2，PIV3，HMPV，ADV，HBOCA等。
1.2.方法：
1.2.1 NL63病毒RNA的提取使用QIAmp RNA Mini Kit（Qiagen）病毒RNA小量提取试剂盒，具体操作参照说明书进行。利用引物NL63-F：5′- GAT AAC CAG TCG AAG TCA CCT AGT TC -3′；NL63-R：5′- ATT AGG AAT CAA TTC AGC AAG CTG TG -3′扩增NL63 N基因。提取的RNA用随机引物合成cDNA，随后进行PCR，反应条件为：95℃，8min预变性，再以95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，扩增35个循环，最后72℃延伸8min。所有阳性扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.2 HKU1 病毒RNA提取及基因扩增：病毒RNA的提取使用QIAmp RNA Mini Kit（德国，Qiagen公司）病毒RNA小量提取试剂盒，具体操作按说明书进行。利用引物HKU1．F：5’一GGTTGGGACGATATGTI'ACGTCA-3’（15352—15374，NO．NC一006577），HKU1—R：5 7一CCATCATCACTCAAAATCATCATA．3’（15848～15825，NO．NC-006577）¨o扩增HKU1 pol基因。提取的RNA用随机引物合成cDNA，随后进行PCR，反应条件为：95℃，5 min预变性，再以94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，30 s，扩增35个循环，最后72℃延伸7 min。所有阳性扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.2.3 核苷酸序列分析：所有阳性扩增产物纯化回收后送北京华大基因研究中心进行序列测定。利用生物软件DNASTAR将所测得的序列与GenBank中的参考株进行同源性比对及核苷酸序列的变异分析，利用MEGA4软件完成种系进化分析。
1.2.4数据分析：t 检验，χ2检验。
2.结果：
2.1发病率：2007年9月1日～2012年3月共采集急性下呼吸道感染住院儿童NPA标本3120份，其中检测到冠状病毒NL63阳性扩增产物13份，总检出率为0.42 %，检测到冠状病毒HKU1阳性扩增产物22份，总检出率为0.70 %。
2.2流行病学特点
NL63病毒在2007年9月检出2例，12月1例，2008年全年未检出，2009年2月1例，7月1例，8月4例，2010年3月，8月各1例，10月2例，2011年全年直至2013年3月未检出。
HKU1病毒在2007年未检出，2008年1月检出2例，3月，4月出现峰值，各检出4例，5月检出1例，7月1例，2009年全年未检出，2010年6月2例，9月1例，10月4例，11月1例，2011年4月1例，5月1例。可以看出，在2008年春和2010年秋季各出现一个高峰。NL63和 HKU1在各时间段的发病例数及分布时间见图1：
.png)
性别比在NL63病毒感染为9：4，在HKU1病毒感染为13：9，均为男性居多，性别比差异不具有显著性，P≥0.05。
2.3临床特点：
NL63和HKU1引起的下呼吸道感染临床症状最常见有发热，咳嗽，咳痰，气喘等，伴发有消化道症状，如腹泻，呕吐，两者的临床表现比较见表1，我们的研究发现前者出现发热的几率更高，P≤ 0.05，而其他的临床症状相似，差异没有显著性。病例以轻-中度居多，但也有相当比例为病重患儿，前者为5/13，后者为6/22，并没有发现危重的病例出现呼吸功能不全而需要使用呼吸机支持治疗。
.png)
3 讨论
NL63和HKU1是近年才被发现的冠状病毒家族成员，国内外的研究者就它们的流行病学和临床特点进行了研究，发现它们主要与人类呼吸道感染性疾病相关，但目前研究中总的发病例数并不多。有学者[5]采集了中国北京地区2005年至2009年下呼吸道感染成年患者8，396份呼吸道分泌物标本，用RT-PCR方法进行病毒序列分析，在14（0.2 %）例标本中检测到HCoV-HKU1，8例标本中检测到了HCoV-NL63（0.1%），而另一项调查，同样是在中国北京，2008年5月至2010年3月因下呼吸道感染住院的儿童NPA中，NL63和HKU1病毒的检出率分别为8.4 %和14.9 %[6]。在中国香港地区儿童的感染率分别为0.6 %和0.5 %[7]。我们的研究发现NL63和HKU1是中国湖南省儿童下呼吸道感染的病因，NL63病毒在NPA样本中的检出率为0.50 %，HKU1病毒的阳性率为0.77 %，与香港地区儿童发病率相似，我国南方地区发病率明显低于北方，提示这两种冠状病毒在不同的地域发病率存在差异。其他国家和地区同样能观察到这种发病率的差异，在欧洲国家，如英国，检测两者发病率为0.64%和0.52%[8]，在美国两者的发生率为2%和0.1%[9]。另外，欧洲国家观察到NL63感染率在年与年之间存在很大的差异，可见到2年间隔的流行期，高峰在2000~2001年冬，2002~2003年冬，2004~2005年冬，本次调查湖南地区NL63病毒在2007年秋冬，2009年夏季出现小高峰，2008年未检测到，而HKU1在2008年春和2010年秋季各出现一个高峰，而在2007年末和2009年全年未检测到，提示湖南地区NL63和HKU1病毒的检出率在不同年份也有较大差异。
本研究显示，NL63和HKU1临床表现存在很多相似点，都主要表现为呼吸道和消化道症状，我们发现NL63比HKU1感染后发热的比例更高（P≤ 0.05），在我们的实验中并未发现川崎病样改变。最常见的临床症状为呼吸道症状：咳嗽，咳痰，气喘，NL63还可以有声嘶表现；HKU1似乎更容易出现气喘症状，但差异不具有统计学意义，这与Leung TF等人的结论相反7；我们观察到NL63和HKU1感染后也可伴发消化道症状：主要为腹泻和呕吐，NL63感染后腹泻比率似乎比HKU1要高，但是没有统计学差异。Esper F等曾对479例胃肠炎的患者大便中的冠状病毒进行检测，仅有1.3%为阳性，而阳性结果均为HKU1[10]。NL63和HKU1感染引起的下呼吸道感染的预后均较好，没有死亡病例。重症患儿甚至入住ICU的危重患儿均好转后治愈出院。
总之，我们的研究提示NL63和HKU1是中国湖南地区下呼吸道感染的病因，发病率不高，预后较好。
参考文献：
[1] van der Hoek L，Pyro K，Jebbink MF，Vermeulen-Oost W，Berkhout RJ，Wolthers KC，et al.Identifi cation of a new human coronavirus.Nat Med.2004；10：368–73.DOI：10.1038/nm1024
[2] Woo PC，Lau SK，Chu CM，Chan KH，Tsoi HW，Huang Y，et al.Characterization and complete genome sequence of a novel coro-navirus，coronavirus HKU1，from patients with pneumonia.J Virol.2005；79：884–95.DOI：10.1128/JVI.79.2.884-895.2005
[3] Monto AS，Lim SK.The Tecumseh study of respiratory illness.VI.Frequency of and relationship between outbreaks of coronavirus infection.J Infect Dis.1974；129：271–6.
[4] Gerna G，Campanini G，Rovida F，Percivalle E，Sarasini A，Marchi A，et al.Genetic variability of human coronavirus OC43-，229E-，and NL63-like strains and their association with lower respiratory tract infections of hospitalized infants and immunocompromised patients.J Med Virol.2006；78：938–49.DOI：10.1002/jmv.20645
[5] Ren L，Gonzalez R，Xu J，Xiao Y，Li Y，Zhou H，Li J，Yang Q，Zhang J，Chen L，Wang W，Vernet G，Paranhos-Baccalà G，Wang Z，Wang J.Prevalence of human coronaviruses in adults with acute respiratory tract infections in Beijing，China.J Med Virol.2011 Feb；83（2）：291-7
[6] Li-Jin Cui，Chen Zhang，Ting Zhang，Human Coronaviruses HCoV-NL63 and HCoV-HKU1 in Hospitalized Children with Acute Respiratory Infections in Beijing，China，Advances in Virology Volume 2011，Article ID 129134，6 pages
[7] Leung TF，Chan PK，Wong WK，Ip M，Cheng WT，Ng PC Human coronavirus NL63 in children：epidemiology，disease spectrum，and genetic diversity.Hong Kong Med J.2012 Feb；18 Suppl 2：27-30.
[8] Gaunt ER，Hardie A，Claas EC，Simmonds P，Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E，HKU1，NL63，and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method.J Clin Microbiol.2010 Aug；48（8）：2940-7.Epub 2010 Jun 16.
[9] Dominguez SR，Robinson CC，Holmes KV，Detection of four human coronaviruses in respiratory infections in children：a one-year study in Colorado.J Med Virol.2009 Sep；81（9）：1597-604.
[10] Esper F，Ou Z，Huang YT Human coronaviruses are uncommon in patients with gastrointestinal illness.J Clin Virol.2010 Jun；48（2）：131-3.Epub 2010 Apr 1.
论文作者:林小娟1,张兵1,段招军2,肖霓光1,谢乐云1,钟
论文发表刊物:《中国蒙医药》2016年3月第3期
论文发表时间:2016/8/12
标签：检出论文; 病毒论文; 呼吸道感染论文; 阳性论文; 冠状病毒论文; 儿童论文; 标本论文; 《中国蒙医药》2016年3月第3期论文;