淮安市疾病预防控制中心 淮安 223001
摘要：目的 应用液质联用（LC-MS/MS）技术，建立农产品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量检测方法，对市场中的农产品进行分析。方法 样品粉碎后经乙腈水（84+16）提取，不经免疫亲和柱净化，氮吹浓缩定容后过0.22μm滤膜。滤液经反向C18柱分离，以0.1%甲酸水-甲醇作流动相梯度洗脱分离4种黄曲霉毒素。质谱采用电喷雾离子化源（ESI），正离子模式扫描。结果 4种毒素在各自的定量范围内均呈良好的线性关系，r > 0.990，回收率>80%，且与经免疫亲和柱净化相比，具有较高的回收率。结论 该方法具有简便、快速、经济、灵敏、准确等优点，适用于多种农产品中黄曲霉毒素的检测。
关键词：液质联用技术；农产品；黄曲霉毒素
黄曲霉毒素（aflatoxin，简称AF）是目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，广泛污染农作物、食品、饲料，严重威胁人类健康和生命安全，已经引起社会的普遍关注[1]。 目前已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物共二十多种，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2等，B1的毒性最大。普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中，直接或间接进入人类食物链，结构也比较稳定，在食物的热加工过程中都不易被破坏[2-3]。黄曲霉毒素有极强的致癌性[4-5]，长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌。
目前检测黄曲霉毒素的常规方法主要有薄层色谱法[6]、酶联免疫吸附法[7]、二维薄层色谱法[8]、高效液相法9]。薄层色谱法操作繁琐、而且有机试剂用量大、污染严重、灵敏度低、定量差、耗时长；高效液相色谱法需要使用荧光检测器，样品需要在柱前或柱后进行衍生，分析时间较长、步骤多、损失不易控制；酶联免疫吸附法虽然前处理过程简单，但特异性差易出现假阳性。
高效液相色谱-串联质谱联用技术（HPLC-MS /MS）具有选择性高、灵敏度好、不需要衍生化等优点，近年来，液质联用技术在食品安全领域得到广泛应用，它将色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏度这两种优势结合在一起，可以对很多种类的化合物进行定性定量分析。目前国内对真菌毒素的HPLC检测多侧重于采用免疫亲和柱或多功能净化柱的方法进行样品净化，但在净化的过程中也带来了待测组分的损失，同时各种纯化柱的价格昂贵，无法重复使用，检测成本高[10]。本研究应用HPLC-MS /MS法，通过优化样品提取方法和色谱质谱检测条件，建立一套可以对多种农产品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 同时进行定性定量检测的简便、快速方法。
1 仪器与试材
1.1仪器与设备
Agilent Technologies 1290超高效液相色谱-API4000串联四级杆质谱仪（美国AB公司），配有电喷雾离子源（ESI）；超纯水发生器（美国LABCONCO公司）；高速电动匀浆器（FSH-Ⅱ型）；TGL-16台式高速冷冻离心机（湖南湘仪）；氮吹仪（美国TECHNE）；电子天平（感量0.0001g，梅特勒）；DIKMA氨基固相萃取小柱；食品料理机（欧科）。
1.2 材料与试剂
大米、花生、玉米粉（渣）、芝麻、面粉市购。黄曲黄曲霉毒素标准溶液，AFB1 2.0μg /ml，AFB2 2.0 μg /ml，AFG1 2.0μg /ml，AFG22.0μg /ml（农业部环境保护科研监测所，编号SB05-195~198-2008，批号1405）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国，Merck）；醋酸铵、甲酸（色谱纯，美国，Dikma-Pure）；超纯水（由超纯水发生器产生）。黄曲霉毒素净化柱（美国，LCTech）
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Poroshell120ec-C18 色谱柱（2.1 mm×75 mm，2.7 µm）；流速0.3 mL/min；柱温：35℃；进样量：2 µl；流动相A-甲醇，B-0.1% 甲酸水溶液（pH 3.0）。梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1。
2.3 混合标准品溶液的配制
精密吸取黄曲霉毒素标准溶液各250 μl，混匀，4℃保存备用。
2.4 样品处理
称取2.0g 粉碎好的样品置于100mL 离心管中，加10mL 乙腈- 水溶液（84：16，V/V），浸泡20分钟，高速匀浆3min，5 000 r/min下离心10 min，取1mL 上清液氮气吹干（室温），残渣准确加入1 mL甲醇溶解，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，备用。
2.5 标准曲线的绘制
取“2.3”项下的混合标准品溶液，加甲醇分别配制成浓度为的0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0μg /mL 的混合标准品溶液，按上述色谱质谱条件注入液质联用仪进行分析，结果见表3，可见4种真菌毒素在各自浓度范围内具有良好的线性关系。
2.6 检测限（LOD）、定量限（LOQ）和精密度
取中间浓度的混合标准品溶液，按上述色谱质谱条件注入液质联用仪进行分析，以3N /S 和10 N /S 的信噪比分别测得四种黄曲霉毒素的LOD 和LOQ。再连续进样6次，记录各峰峰面积，计算精密度，结果见表3。
3 讨论
本实验建立了一种快速、灵敏、经济、简便、可靠的方法检测农产品中4 种黄曲霉毒素，通过比较本方法与黄曲霉免疫亲和净化柱的效果，发现净化柱纯化后各黄曲霉毒素的回收率均有一定程度降低，说明使用净化柱纯化会导致目标化合物的损失，这不利于微量黄曲霉毒素的检测。本法克服了上述缺点，且提取、检测过程简便，不仅节省了检测的成本，更提高了结果的准确性，从而可用于农产品的大量筛查。
参考文献：
[1]Diaz J 霉菌毒素蓝皮书［S］．北京：中国农业科学出版社，2008。
[2]郑荣，毛丹，王柯，等.基质固相分散色谱法检测辣椒产品中的黄曲霉毒素[J].色谱，2005，25（6）：610-613.
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[8]中国标准出版社第二编辑室.水质分析方法国家标准汇编[M].北京：中国标准出版社，1997，1996：477.
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[10]韩铮．中药材中常见真菌毒素分析方法学及代谢动力学研究［D］．杭州：浙江大学博士学位论文，2011．
作者简介：王芹（1982-），女，本科，主管技师，主要从事理化检验工作。
单位：江苏淮安市疾病预防控制中心
论文作者:王芹,宋鑫,王露
论文发表刊物:《健康世界》2014年23期供稿
论文发表时间:2016/4/5
标签：毒素论文; 黄曲霉论文; 色谱论文; 中黄论文; 农产品论文; 方法论文; 曲霉论文; 《健康世界》2014年23期供稿论文;